坎離顆粒抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制探究

李 悅，王肖龍，姚成增

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，且預(yù)后較差[1]。慢性心肌肥大及其相關(guān)的心肌重構(gòu)是CHF發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)[2]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要組成部分，是導(dǎo)致心肌肥大及心肌重構(gòu)的重要致病因素，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑及AngⅡ受體拮抗劑可抑制心肌肥大的發(fā)展進(jìn)程[3]。因此，抑制AngⅡ相關(guān)的心肌肥大對(duì)改善CHF預(yù)后具有重要意義。

中醫(yī)藥防治CHF相關(guān)證候歷史候久。多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，中醫(yī)藥可改善CHF病人的臨床癥狀，提高CHF病人的生活質(zhì)量[4]?？搽x顆粒是蔣梅先教授在繼承全國(guó)名老中醫(yī)張伯臾的學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，創(chuàng)制的治療CHF經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)本學(xué)科長(zhǎng)期應(yīng)用，療效顯著。臨床研究已證實(shí)，坎離顆粒對(duì)CHF病人的療效顯著，能明顯改善CHF病人的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)指標(biāo)、內(nèi)皮功能及心率變異性等，提高心力衰竭病人的活動(dòng)耐量和生活質(zhì)量[5-7]?；A(chǔ)研究也已證實(shí)，坎離顆粒具有改善心肌一氧化氮(NO)/內(nèi)皮素(ET)值，抑制心肌細(xì)胞凋亡，降低其心肌膠原體積分?jǐn)?shù)、心臟指數(shù)、左室質(zhì)量指數(shù)、左心室舒張末期內(nèi)徑，升高Ⅰ/Ⅲ型膠原比值等藥理效應(yīng)[8-9]。本研究運(yùn)用AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大，探索坎離顆粒抗CHF的作用機(jī)制，以期為坎離顆粒在心血管疾病方面的應(yīng)用提供更有力的證據(jù)，為心血管疾病的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)藥物坎離顆粒(生黃芪、熟附子、白術(shù)等9味中藥組成)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光臨床醫(yī)學(xué)院制劑室制作而成；H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；AngⅡ(貨號(hào)：A9525)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；改良伊格爾培養(yǎng)基DMEM(貨號(hào)：C11995500CP)、胎牛血清(貨號(hào)：10099141)、胰蛋白酶(貨號(hào)：25200072)和青霉素/鏈霉素雙抗(貨號(hào)：15140122)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：NCI3225CH)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；RIPA裂解液(貨號(hào)：P0013C)購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；CellTiter-Glo?發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：G7571)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；TRIzol試劑(貨號(hào)：15596-026)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；RNA抽提試劑盒Direct-zolTMRNA MiniPrep(貨號(hào)：A-R2051)購(gòu)自美國(guó)Zymo Research公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：RR047A)購(gòu)自日本Takara公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(貨號(hào)：AM1005)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：NCI3225CH)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；兔多克隆抗體心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)(貨號(hào)：NBP2-14873)購(gòu)自美國(guó)Novus公司；兔多克隆抗體腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)(貨號(hào)：ab19645)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)(貨號(hào)：ab38898)、組織金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)(貨號(hào)：ab38898)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔多克隆抗體基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinases，MMP-1)(貨號(hào)：DF6325)購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；小鼠單克隆抗體β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)(貨號(hào)：sc-53089)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；PCR引物由上海鉑尚生物技術(shù)公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因名稱及引物序列(5′-3′)

1.2 方法

1.2.1 H9c2心肌細(xì)胞的培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞系在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的二甲基亞礬(DMEM)培養(yǎng)基中置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中小心培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代或凍存。

1.2.2 AngⅡ及坎離顆粒溶液的配制 AngⅡ溶于無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，配制成1 mmol/L母液，根據(jù)需要濃度再行稀釋。坎離顆粒浸膏粉以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑，再溶于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，配制成1 mg/mL母液，根據(jù)需要濃度再行稀釋(DMSO濃度不超過(guò)0.1%)。

1.2.3 H9c2心肌細(xì)胞的分組及處理方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以適當(dāng)密度鋪于6孔板、26孔板或96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)。第1部分實(shí)驗(yàn)分為4組，空白組：H9c2心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)24 h，未做任何處理；AngⅡ-24 h組：H9c2心肌細(xì)胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ培養(yǎng)24 h；AngⅡ-48 h組：H9c2心肌細(xì)胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ培養(yǎng)48 h；AngⅡ-72 h組：H9c2心肌細(xì)胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ培養(yǎng)72 h。第2部分實(shí)驗(yàn)分為5組，空白組：H9c2心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)48 h，不做任何處理；AngⅡ組：H9c2心肌細(xì)胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ培養(yǎng)48 h；坎離顆粒低劑量組：H9c2心肌細(xì)胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ+低劑量(25 μg/mL)坎離顆粒溶液培養(yǎng)48 h；坎離顆粒中劑量組：H9c2心肌細(xì)胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ+中劑量(50 μg/mL)坎離顆粒溶液培養(yǎng)48 h；坎離顆粒高劑量組：H9c2心肌細(xì)胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ+高劑量(75 μg/mL)坎離顆粒溶液培養(yǎng)48 h。

1.2.4 α-actin免疫熒光染色 準(zhǔn)備4組24孔板，在每塊板中間區(qū)域輕輕放入6塊玻片，每孔先加入1 mL的1×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗1遍，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞用胰蛋白酶消化，以密度為1×103左右的細(xì)胞密度種到24孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相應(yīng)處理。將處理好的細(xì)胞加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，隨后用PBS清洗2遍，每次5 min；加入0.2% TritonX-100通透5 min，隨后清洗3遍，每次5 min；室溫封閉30 min，隨后清洗2遍，每次5 min；加入一抗稀釋液，4 ℃過(guò)夜處理；次日清洗細(xì)胞后，加入二抗稀釋液，室溫孵育40 min，隨后清洗2遍，每次5 min；最后加入DAPI工作液，避光室溫處理1 min，隨后清洗晾干，封片，使用激光共聚焦顯微鏡掃描拍照。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測(cè)基因mRNA表達(dá)水平 使用TRIzol試劑和Direct-zolTMRNA MiniPrep試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，隨后對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 s變性、60 ℃ 20 s退火、72 ℃ 20 s延伸，共42個(gè)循環(huán)。mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法測(cè)定。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 使用RIPA裂解緩沖液中裂解實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，并使用BCA蛋白定量分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。制備蛋白樣本，將等量的煮沸蛋白質(zhì)提取物通過(guò)7.5%或10.0% 聚丙烯酰胺凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移到甲醇預(yù)活化的聚偏二氟乙烯膜上。將膜與5%脫脂牛奶在室溫下孵育1 h，然后與目的一抗稀釋液在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后將膜在二抗中室溫孵育2 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑使印跡中的蛋白質(zhì)可視化。

2 結(jié) 果

2.1 AngⅡ誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞肥大最佳作用時(shí)間的確定

2.1.1 不同時(shí)間AngⅡ刺激H9c2心肌細(xì)胞表面積的變化 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，AngⅡ刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，心肌細(xì)胞表面積均有一定程度的增大，其中AngⅡ誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞48 h時(shí)，細(xì)胞表面積增加最為明顯。詳見(jiàn)圖1。

圖1 不同時(shí)間AngⅡ刺激對(duì)H9c2心肌細(xì)胞表面積影響的細(xì)胞免疫熒光

2.1.2 不同時(shí)間AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞肥大基因的蛋白表達(dá)變化 與空白組比較，AngⅡ-24 h組、AngⅡ-48 h組、AngⅡ-72 h組ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1的蛋白表達(dá)均明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；其中AngⅡ-48 h組上述基因的表達(dá)增加最為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用AngⅡ刺激細(xì)胞48 h為心肌肥大模型最佳誘導(dǎo)時(shí)間。詳見(jiàn)圖2。

與空白組比較，＊P<0.05，# P<0.01。

2.1.3 坎離顆粒對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力的影響 坎離顆粒用藥濃度范圍經(jīng)過(guò)多組多次由高到低的實(shí)驗(yàn)濃度篩選，最終得到相對(duì)精確的實(shí)驗(yàn)用藥濃度。首先分別用0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL、1 600 μg/mL坎離顆粒處理H9c2心肌細(xì)胞48 h，進(jìn)行CellTiter-Glo4?檢測(cè)，結(jié)果顯示，與 0 μg/mL比較，100 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力開(kāi)始下降，至400 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率>50%，800 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率<50%，由此確定400 μg/mL為低濃度細(xì)篩最高值(見(jiàn)圖3A)。隨后采用濃度為0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL、350 μg/mL、400 μg/mL、450 μg/mL坎離顆粒處理H9c2心肌細(xì)胞48 h，檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，與0 μg/mL比較，至100 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率>90%，150 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率<90%，因此確定100 μg/mL為坎離顆粒實(shí)驗(yàn)用藥濃度上線(見(jiàn)圖3B)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL坎離顆粒作為其高、中、低劑量組。

圖3 坎離顆粒的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2.2 坎離顆粒對(duì)H9c2心肌細(xì)胞肥大模型的干預(yù)作用 采用qRT-PCR與Western Blot 法檢測(cè)坎離顆粒干預(yù)心肌細(xì)胞48 h后的ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1 mRNA與蛋白表達(dá)水平。與空白組比較，AngⅡ組ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1 mRNA與蛋白表達(dá)均明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與Ang Ⅱ組比較，坎離顆粒用藥組ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1 mRNA與蛋白表達(dá)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，提示坎離顆粒能夠有效抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大相關(guān)mRNA與蛋白水平的上調(diào)。詳見(jiàn)圖4。

與空白組比較，＊ P<0.01；與AngⅡ組比較，#P<0.05，△ P<0.01。

3 討 論

CHF作為世界范圍內(nèi)死亡的主要病因之一，發(fā)病群體逐漸年輕化，其5年內(nèi)存活率接近惡性腫瘤[10-12]。CHF具有復(fù)雜的病理生理學(xué)特征，研究表明包括心肌肥大在內(nèi)的心肌重構(gòu)是CHF臨床進(jìn)程的重要決定因素[13-16]。心肌肥大是機(jī)體受到生理或病理刺激初期做出的適應(yīng)性反應(yīng)，以減少室壁應(yīng)力并維持心臟功能，隨著病程時(shí)間的延長(zhǎng)，生理性心肌肥大向病理性心肌肥大轉(zhuǎn)變，持續(xù)性的肥大則會(huì)加重心肌重構(gòu)，最終導(dǎo)致CHF的發(fā)生與發(fā)展[17-18]。

目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療CHF的觀念發(fā)生了明顯變化，為提高病人生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生命，CHF治療目標(biāo)不再只是追求其暫時(shí)的癥狀改善，更重要的是預(yù)防和延緩心肌重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展。因此，抑制心肌重構(gòu)，改善心臟功能，是當(dāng)前階段治療CHF的重要方向[17，19]。臨床常用藥物ACEI類、β受體阻滯劑、醛固酮拮抗劑及伊伐布雷定、腦啡肽酶抑制劑等均是通過(guò)抗心肌重構(gòu)而抑制CHF的發(fā)展[20-21]，雖然CHF病人的長(zhǎng)期死亡率明顯下降，但這些藥物引發(fā)的副作用較多，病人的生活質(zhì)量依然低下，如使用利尿劑后，CHF病人血流動(dòng)力學(xué)雖有明顯好轉(zhuǎn)與改善，但可能會(huì)出現(xiàn)尿酸升高、腎功能惡化等一系列不良反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致其他并發(fā)癥，嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量[22]。因此，探索療效顯著且副作用小的治療方式迫在眉睫。

中醫(yī)藥在治療CHF方面有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)及獨(dú)特的理論體系。CHF 屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“胸痹”“喘證”“痰飲”“水腫”等范疇，其臨床表現(xiàn)主要為心悸、心慌、胸悶、喘咳、咳痰、氣短、肢體浮腫等。中醫(yī)認(rèn)為心主血脈，其以血為本，以氣為用，全身上下血液之運(yùn)行有賴心氣之推動(dòng)，于百脈中川流不息，以發(fā)揮濡養(yǎng)四肢百骸之功能。對(duì)心功能的認(rèn)識(shí)，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)并無(wú)歧義。多項(xiàng)科學(xué)研究證實(shí)，中醫(yī)藥在治療CHF有著較為完善的治療體系和較好的臨床療效[23-24]?？搽x顆粒是蔣梅先教授在繼承全國(guó)名老中醫(yī)張伯臾教授學(xué)術(shù)思想和臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上創(chuàng)制的治療心力衰竭的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)本學(xué)科長(zhǎng)期臨床應(yīng)用，療效顯著。近30年的臨床應(yīng)用業(yè)已證實(shí)該方可有效增加CHF病人的活動(dòng)耐量，提高病人6 min步行距離，改善病人的臨床癥狀等[25]。

本研究借助離體實(shí)驗(yàn)的方法，采用AngⅡ刺激H9c2心肌細(xì)胞構(gòu)建心肌肥大模型，對(duì)該方的藥理機(jī)制進(jìn)行深入探究。H9c2大鼠心肌細(xì)胞系來(lái)源于胚胎期BD1X大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系，因其具有培養(yǎng)操作性強(qiáng)、可傳代且細(xì)胞存活率高等優(yōu)勢(shì)，在心血管疾病研究領(lǐng)域有著較為廣泛的應(yīng)用[26-27]。目前，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)基礎(chǔ)研究均采用H9c2大鼠胚胎心肌細(xì)胞株作為離體實(shí)驗(yàn)部分的細(xì)胞載體，用以探索某種基因或藥物在心肌重構(gòu)或心力衰竭中的作用機(jī)制[28]。此外，AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的重要執(zhí)行因子，參與多種心血管事件的發(fā)生發(fā)展，在不增加血管阻力和心臟后負(fù)荷的情況下，AngⅡ能夠直接作用于心肌細(xì)胞促進(jìn)其肥大，使胞內(nèi)肥大基因ANP、BNP和β-MHC的表達(dá)增加[29-32]。ANP、BNP等利鈉肽的血漿水平已被證明是心力衰竭等心血管疾病診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，兩者的血漿水平變化可反映左室收縮和舒張功能障礙、瓣膜功能障礙以及右室功能障礙等情況[33-34]。而心肌細(xì)胞作為一種高度分化的終末細(xì)胞，以α-肌球蛋白為主，當(dāng)心肌肥大時(shí)，收縮蛋白以β-MHC 占優(yōu)勢(shì)。β-MHC與心肌重構(gòu)密切相關(guān)，其蛋白水平升高一定程度上可以反映心肌重構(gòu)程度[35]。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族在CHF進(jìn)程中同樣有重要作用，金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)是MMPs的內(nèi)源性抑制物，也被證實(shí)參與心肌重構(gòu)的病理過(guò)程，在衰竭的心臟組織中，MMP/TIMP 失衡可促進(jìn)纖維膠原的逐漸降解，從而導(dǎo)致心室壁變薄和心室擴(kuò)張，兩者失衡加速了心肌重構(gòu)和CHF的發(fā)展[36-37]。

本研究結(jié)果顯示，AngⅡ刺激后H9c2細(xì)胞形態(tài)和體積明顯增大，ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9、TIMP-1等肥大基因蛋白表達(dá)均有所上升，證明了AngⅡ刺激H9c2細(xì)胞促進(jìn)心肌重構(gòu)，而坎離顆?？刹糠帜孓D(zhuǎn)AngⅡ引起的心肌細(xì)胞肥大，提示坎離顆粒對(duì)心肌組織具有顯著的保護(hù)作用，其藥理機(jī)制可能是通過(guò)抑制心肌肥大相關(guān)因子的表達(dá)，減緩肌原纖維的合成，從而改善心肌肥大與心肌重構(gòu)的程度，進(jìn)而改善心臟功能，發(fā)揮抗CHF的作用。更加深入的藥理機(jī)制將會(huì)在未來(lái)的研究中進(jìn)一步探索。