載鍶納米鈦表面促進骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的體外研究

Shahrzad Hosseinijenab， 王靜文， 蘇儉生， 張 磊

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)教研室，上海 200072）

近年來，隨著人民生活水平的提高和口腔種植技術(shù)的不斷普及，中老年人對種植修復(fù)的需求持續(xù)增長。骨質(zhì)疏松癥作為一種退行性和代謝性疾病，在中老年人群中高發(fā)。由于患者成骨能力的下降及成骨細胞和破骨細胞的失衡，種植修復(fù)的效果常常不理想[1]。而種植體與周圍骨形成穩(wěn)定的骨整合是種植成功的核心和關(guān)鍵[2]。因此，如何有效促進骨質(zhì)疏松條件下種植體周圍的骨整合，成為該人群中亟待解決的問題[3]。

課題組前期對鈦種植體表面改性進行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)可以促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的增殖和成骨分化，且鈣離子的負載能夠顯著促進種植體周圍成骨[4]。有研究表明，鍶能夠通過抑制破骨細胞吸收和刺激成骨細胞形成的雙重機制發(fā)揮促進成骨的作用[5-6]。Li等[7]通過凝膠涂層的方法引入鍶離子，證實其具有促進種植體周圍成骨的能力。

因此，本實驗擬通過水熱法制備鈦表面載鍶納米結(jié)構(gòu)，探究其對骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs成骨分化的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑及設(shè)備 氫氧化鈉和氫氧化鍶（生工生物工程（上海）股份有限公司，中國）；α-MEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶和青霉素-鏈霉素（雙抗）（Hyclone公司，美國）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Gibco公司，美國）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS；Hyclone公司，美國）；CCK-8試劑盒（碧云天公司，中國）；TRIzol總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；掃描電子顯微鏡（SEM，Hitachi公司，日本）；實時熒光定量PCR儀（羅氏公司，瑞士）。

1.1.2 實驗動物SD大鼠由同濟大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心SPF級實驗動物房中。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料制備及表征 本實驗所用鈦片為機械加工純鈦片（Φ15 mm×2 mm），將其置于丙酮、無水乙醇、去離子水中依次超聲清洗后，于60℃下烘干待用。將清洗后的純鈦片作為對照組（control-Ti組）；將純鈦片放在聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，加入25 mL 0.5 mol/L NaOH水溶液，于180℃下處理12 h，取出鈦片用去離子水超聲振蕩清洗15 min，烘干后得到納米組（nm-Ti組）；將純鈦片置于25 mL 2 mmol/L Sr（OH）2水溶液中，于180℃下處理12 h，取出后清洗烘干得到載鍶純鈦組（Sr-Ti組）；將純鈦片置于25 mL 0.5 mol/L NaOH水溶液中，于180℃下處理12 h，烘干后再次放入反應(yīng)釜內(nèi)，加入25 mL 2 mmol/L的Sr（OH）2水溶液，于180℃下處理12 h，取出后清洗烘干得到載鍶納米組（nm/Sr-Ti組）。所有鈦片經(jīng)高溫高壓滅菌后備用。

使用SEM觀察各組鈦片表面結(jié)構(gòu)，通過X射線光電子能譜（XPS）分析各組鈦片表面元素組成及含量，通過X射線衍射（XRD）進一步分析各組鈦片表面構(gòu)成。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 選取2~3周齡的雄性SD大鼠，將大鼠頸椎脫臼處死后分離其股骨和脛骨，浸泡在含10%雙抗的PBS中，轉(zhuǎn)入無菌操作臺。用鑷子小心夾持股骨，無菌器械剪去兩端骨骺，用1 mL無菌注射器吸取適量培養(yǎng)液 （含10%FBS、1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液），將骨髓沖入10 cm培養(yǎng)皿中，用同樣方法將同一側(cè)脛骨內(nèi)的骨髓沖入同一培養(yǎng)皿中，各培養(yǎng)皿共加入8 mL培養(yǎng)液，將骨髓均勻吹散后放入恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2、37℃）中培養(yǎng)，每3 d換液，待BMSCs密度達80%~90%時，使用含2.5%乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化后傳代培養(yǎng)，取第2代BMSCs進行實驗。

選取2~3周齡的雌性SD大鼠，采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)（OVX）建造骨質(zhì)疏松大鼠模型，10周后建模完成。用相同方法提取OVX大鼠的BMSCs，培養(yǎng)至第2代待用。

1.2.3 細胞增殖 當?shù)?代BMSCs密度達80%~90%時，使用含2.5%EDTA的胰蛋白酶消化，以1×104/孔（24孔板）的密度接種于各組鈦片表面，每3 d換液。分別于接種后第1、4、7天棄去孔板中的原培養(yǎng)液，使用PBS清洗3次，使用CCK-8試劑盒，將CCK-8原液與培養(yǎng)液以1∶10的比例配制成CCK-8工作液，按550 μL/孔加入各孔板內(nèi)，37℃下避光孵育3 h。使用酶標儀在波長450 nm下檢測其吸光度值，比較各組鈦片表面細胞增殖情況。各組重復(fù)3次實驗，消除樣本和操作誤差。

1.2.4 各組鈦片表面BMSCs成骨相關(guān)基因的表達 當?shù)?代BMSCs密度達80%~90%時，使用含2.5%EDTA的胰蛋白酶消化，以1×104/孔（24孔板）的密度接種于各組鈦片表面，每3 d換液。分別于接種后第3、7、10天棄去原培養(yǎng)液，使用PBS清洗2次，用TRIzol法提取細胞總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對獲得的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，得到各組cDNA。根據(jù)實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒說明書，按一定的反應(yīng)體系，以β-actin作為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量PCR儀進行RT-qPCR。

對各組鈦片表面的正常組和骨質(zhì)疏松組的BMSCs的成骨相關(guān)基因表達進行RT-qPCR檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

通過SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（）表示。組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料表征

2.1.1 SEM觀察 各組鈦片表面形貌圖像如圖1，control-Ti組表面平整，無微納結(jié)構(gòu)；Sr-Ti組表面與control-Ti組相似，未見特殊納米形態(tài)；nm-Ti組和nm/Sr-Ti組表面呈現(xiàn)出成簇片狀納米結(jié)構(gòu)。

圖1 各組鈦片表面SEM圖像Figure 1 SEM images of each titanium sheets surface

2.1.2 XPS分析 各組鈦片表面元素分析如表1所示。各組鈦片表面均可檢測到C、O和Ti元素。與control-Ti組相比，Sr-Ti組和nm/Sr-Ti組表面均有較高濃度的Sr離子，且nm/Sr-Ti組含量約為Sr-Ti組的2倍。

表1 XPS分析各組鈦片表面元素組成（%）Table 1 Elements composition of each titanium sheets surface by XPS analysis(%)

2.1.3 XRD檢測 各組鈦片表面XRD結(jié)果如圖2所示，除了Ti峰外，Sr-Ti組表面可見Sr峰，nm-Ti組表面可見Na2Ti6O13峰，而nm/Sr-Ti組表面可以看到Sr2TiO4峰的存在。

圖2 各組鈦片表面XRD 分析圖譜Figure 2 XRD analysis graphics of each titanium sheets surface

2.2 細胞增殖

細胞增殖結(jié)果如圖3所示，隨著時間增加，正常大鼠BMSCs在各組鈦片表面的細胞數(shù)量不斷增加，nm/Sr-Ti組表面細胞增殖較為活躍。而OVX大鼠組的CCK-8結(jié)果顯示，nm/Sr-Ti組和nm-Ti組細胞增殖在第4天和第7天時顯著高于control-Ti組（P<0.05）。

圖3 BMSCs 在各組鈦片表面增殖能力Figure 3 Proliferation capacity of BMSCs on each titanium sheets surface

2.3 各組鈦片表面BMSCs成骨相關(guān)基因的表達

BMSCs成骨相關(guān)基因表達結(jié)果如圖4所示，各組鈦片表面BMSCs 的成骨基因表達量隨時間推移持續(xù)增加。 在正常大鼠中，BMP-2 和 OPN 在第 7 天時表達最高，OCN 在第 10 天時表達最高；nm-Ti 組和nm/Sr-Ti 組成骨基因表達高于control-Ti 組和Sr-Ti 組，以 nm/Sr-Ti 組表達量最多（P<0.05）。 OVX 大鼠BMSCs 結(jié)果與正常大鼠BMSCs 趨勢一致， 但與control-Ti 組相比，Sr-Ti 組 OPN 的表達明顯升高，且差異較正常大鼠組OPN 結(jié)果顯著。且第3 天時，nm/Sr-Ti 組BMP-2 的表達量顯著高于其他組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；第 7 天時，nm-Ti 組和 nm/Sr-Ti 組BMP-2 表達量與另外兩組相比， 其差異較正常大鼠組BMP-2 結(jié)果也更為顯著。

圖4 成骨相關(guān)基因表達Figure 4 Expression levels of osteogenesis related genes

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是中老年人群中的常見疾病，據(jù)文獻報道，盡管種植義齒總體成功率較高，但在骨質(zhì)疏松癥患者中，種植修復(fù)的臨床效果不如預(yù)期[8]。骨質(zhì)疏松癥會影響頜面部的骨質(zhì)和骨量， 在無牙區(qū)尤為明顯[3]。 有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠骨質(zhì)疏松模型中，下頜骨量的減少和骨轉(zhuǎn)換率的降低會導(dǎo)致植入物與骨組織的接觸面積減少，從而降低骨組織對植入物的支撐能力，以及植入物的初始穩(wěn)定性[1,9]。 因此，學(xué)者們通過對種植體表面改性來促進局部細胞成骨活性，從而實現(xiàn)促進骨質(zhì)疏松癥患者種植體周圍成骨[10]。

研究表明，具有納米形態(tài)的鈦種植體表面可有效促進骨質(zhì)疏松大鼠的骨整合[11]。 表面的納米結(jié)構(gòu)可以促進成骨細胞的黏附、增殖和分化，實現(xiàn)促進骨整合的目的[12]。 同時，有研究證明，鈦種植體表面負載功能性鍶離子可以顯著提高其表面活性和細胞生物學(xué)行為[13]，能有效促進骨-種植體結(jié)合，縮短臨床愈合周期， 從而實現(xiàn)種植體術(shù)后即刻功能負荷。 課題組前期通過水熱法成功制備出鈦表面載鈣納米形態(tài)， 增加其表面親水性的同時， 實現(xiàn)了功能性鈣離子負載，并通過體內(nèi)外實驗證明了這種結(jié)構(gòu)對成骨細胞的黏附、增殖和成骨分化等生物學(xué)活性均有顯著的促進作用[4]。 因此，本實驗擬通過水熱法制備鈦表面載鍶納米結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)的同時負載鍶離子，以大鼠BMSCs 為研究對象，探究鍶離子的負載能否與納米結(jié)構(gòu)協(xié)同發(fā)揮以促進成骨作用。

在本實驗中，SEM 圖像驗證了nm/Sr-Ti 表面成簇的片狀納米結(jié)構(gòu)，XPS 和XRD 結(jié)果表明鈦表面成功負載了鍶離子，上述表征結(jié)果說明已成功構(gòu)建鈦表面載鍶納米結(jié)構(gòu)。且XPS 分析結(jié)果表明，nm/Sr-Ti 組表面鍶濃度（4.12%）約為 Sr-Ti 組（2.04%）的2 倍。 二者表面形貌的主要區(qū)別在于nm/Sr-Ti 組為納米結(jié)構(gòu)， 提示納米結(jié)構(gòu)可能通過增加其比表面積，從而在相同反應(yīng)條件下提高了鈦表面的吸附能力， 促進鍶離子的負載。 體外細胞增殖實驗表明，nm-Ti 組和nm/Sr-Ti 組均具有良好的促細胞增殖能力，且在第 4 天和第 7 天時，OVX 大鼠的 BMSCs 在nm-Ti 組和nm/Sr-Ti 組的增殖細胞數(shù)顯著高于其他組。 RT-qPCR 結(jié)果表明，各組鈦片表面成骨相關(guān)基因表達均隨時間推移而增加。 在正常大鼠中，與control-Ti 組相比，Sr-Ti 組成骨基因表達結(jié)果無顯著差異，而 nm-Ti 組和 nm/Sr-Ti 組的 BMSCs 在第 7 天時高表達 BMP-2 和 OPN， 在第 10 天時，OCN 表達量最多，且nm/Sr-Ti 組在第7 天時的BMP-2 表達量最高，說明鈦表面納米結(jié)構(gòu)與納米載鍶結(jié)構(gòu)均能促進大鼠BMSCs 的成骨分化。 OVX 大鼠組結(jié)果整體趨勢與正常大鼠組一致，但與control-Ti 組相比，Sr-Ti 組OPN 的表達明顯升高， 且差異較正常大鼠組OPN 結(jié)果顯著，說明鍶離子的負載對骨質(zhì)疏松大鼠的BMSCs 成骨分化有促進作用。 同時，OVX 大鼠組的 RT-qPCR 結(jié)果表明， 在第 3 天時，nm/Sr-Ti 組BMP-2 表達量顯著高于其他組；第 7 天時，nm-Ti 組和nm/Sr-Ti 組BMP-2 表達量與另外兩組相比，其差異較正常大鼠組BMP-2 結(jié)果也更為顯著，進一步表明鍶離子的負載對骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs 的成骨分化有促進作用，同時提示鍶離子負載與鈦表面納米結(jié)構(gòu)可能存在協(xié)同作用，共同促進了骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs 的成骨分化。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了鈦表面載鍶納米結(jié)構(gòu)， 體外實驗結(jié)果表明該結(jié)構(gòu)對骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs 的增殖和成骨分化均有促進作用，其中鍶離子與納米結(jié)構(gòu)可能存在某種協(xié)同作用，為促進骨質(zhì)疏松大鼠骨整合提供了思路。 但本實驗僅局限在體外實驗，缺乏體內(nèi)實驗結(jié)果，且鍶離子與納米結(jié)構(gòu)促進成骨的作用機制尚不清楚。 因此，還需要行進一步實驗深入探究其對骨質(zhì)疏松大鼠的促成骨作用機制，從而為縮短骨愈合期并增強種植體骨整合提供實驗基礎(chǔ)。