miR-181a-5p對(duì)人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

夏煜星， 廖崇珊， 康非吾

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，上海 200072）

在骨損傷的修復(fù)過程中，骨愈合和骨代謝的能力決定了患者的預(yù)后情況及術(shù)后的生活質(zhì)量[1]。骨折的修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜連續(xù)的過程，包括了血腫機(jī)化、骨痂形成等[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的成骨分化過程在骨愈合中起了關(guān)鍵作用[2]。在成骨分化早期，堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)上調(diào)，成骨分化后期，骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Runx2基因表達(dá)相對(duì)明顯[3]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度為20~24 nt的小RNA，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA可介導(dǎo)不同組織之間的旁分泌和內(nèi)分泌通信，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)和遠(yuǎn)端細(xì)胞的功能；其也可作為疾病診斷和預(yù)后判斷的重要生物標(biāo)志物[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a在骨代謝過程中可通過雙特異性磷酸酶6（dual-specificity phosophate 6，DUSP6）誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，并且負(fù)調(diào)控破骨細(xì)胞凋亡[6]。但是，在成骨過程中miR-181a所起的作用尚不明確。因此，本研究通過對(duì)人BMSCs中的miR-181a-5p進(jìn)行過表達(dá)和沉默，觀察其在成骨過程中的變化，從而為骨折術(shù)后促進(jìn)快速恢復(fù)找到新的治療方向提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

因正頜手術(shù)需要而切除的頜骨碎片來自同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，本研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審批[批準(zhǔn)號(hào)（2019）-R-011]。 α-MEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素、鹽酸緩沖液（Hyclone公司，美國(guó)）；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS；Excell Bio公 司 ， 澳 大 利 亞 ）；Lipofectamine 3000（Invitrogen公司， 美國(guó)）；RNAiso Plus、Prime-ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa公司，日本）；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、多聚甲醛 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）；DEPC水（生工生物工程股份有限公司，中國(guó)）；堿性磷酸酶（ALP）測(cè)定試劑盒 （南京建成生物工程研究所，中國(guó)）；人BMSCs成骨誘導(dǎo)液、茜素紅染色液（賽業(yè)生物科技有限公司，中國(guó)）；Human MSC Analysis Kit試劑盒 （BD公司，美國(guó)）；Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix（翌圣生物科技上海股份有限公司，中國(guó)）；One-StepTMNBT/BCIP（碧云天公司，中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人BMSCs的分離和培養(yǎng) 無菌技術(shù)下取得正頜手術(shù)中廢棄的頜骨骨松質(zhì)，用大量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗后以350×g離心5 min，棄上清液，再用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液重懸之后連同剪碎的頜骨骨碎接種于6孔板中，進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。等到細(xì)胞融合約80%時(shí)，消化傳代，記為P1代。之后用胰酶消化后常規(guī)傳代培養(yǎng)，取P3~5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 人BMSCs的鑒定 取P2代人BMSCs，用胰蛋白酶消化并中和后用PBS洗滌，倒去上清液。用PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，以500 μL每管將其分裝至流式管中，分別加入熒光直標(biāo)CD105、CD90、CD73、CD44抗體5 μL后，于室溫下避光孵育30 min，使用PBS洗滌2遍后重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志。

1.2.3 人BMSCs的轉(zhuǎn)染 參照脂質(zhì)體Lipofectamine 3000試劑說明書，依據(jù)銳博生物公司推薦的濃度，miRNA mimic濃度為50 nmol/L，miRNA inhibitor濃度為100 nmol/L，normal control（NC）組濃度為50 nmol/L。分別將miR-181a-5p inhibitor組（miR-181a-5p沉默組）、miR-181a-5p mimic組（miR-181a-5p過表達(dá)組）、NC組（對(duì)照組）轉(zhuǎn)染人BMSCs 24 h，另設(shè)未轉(zhuǎn)染組為control組。轉(zhuǎn)染后檢測(cè)BMSCs的表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4 成骨誘導(dǎo) 根據(jù)賽業(yè)生物科技有限公司的成骨誘導(dǎo)液使用說明書，小心吸走完全培養(yǎng)液后加入成骨誘導(dǎo)液，每3天換液。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR） 使用傳統(tǒng)TRIzol法抽提RNA，然后通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,采用Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix進(jìn)行RT-qPCR。表1為miR-181a-5p、COL1、Runx2、OCN及 內(nèi) 參U6、GAPDH的引物序列。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 ALP染色及定量分析24孔板中的BMSCs用4%多聚甲醛固定30 min，吸去固定液，用PBS洗滌2次/5 min，每孔加入200 μL One-StepTMNBT/BCIP溶液完全覆蓋培養(yǎng)皿底部，在室溫下避光染色1 h，用PBS洗去多余染液，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。根據(jù)ALP活性測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中的ALP活性。

1.2.7 茜素紅染色24孔板中的人BMSCs用4%多聚甲醛固定30 min，吸棄固定液后用PBS洗滌2次，每孔加入2%茜素紅染液200 μL，室溫下避光染色30 min，用雙蒸水洗去多余的染液，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人BMSCs形態(tài)學(xué)觀察、鑒定和轉(zhuǎn)染

頜骨碎片經(jīng)培養(yǎng)7~10 d后，光鏡下沿骨片周圍有散在單個(gè)細(xì)胞爬出（圖1A），呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)7 d后，可見細(xì)胞繁殖呈漩渦聚集狀（圖1B）。為了進(jìn)一步探究miR-181a-5p的作用，在誘導(dǎo)BMSCs成骨樣分化期間使用miR-181a-5p mimic和miR-181a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞以過表達(dá)和沉默miR-181a-5p。RT-qPCR檢 測(cè) 結(jié) 果 顯 示 ，miR-181a-5p mimic組細(xì)胞內(nèi)miR-181a-5p的表達(dá)顯著高于NC組,miR-181a-5p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)miR-181a-5p的表達(dá)顯著低于NC組,表明細(xì)胞過表達(dá)和沉默miR-181a-5p成功（圖3C）。傳至P4代，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示，CD90、CD73、CD44、CD105的陽(yáng)性表達(dá)率分別為92.4%、92.3%、92.1%、91.9%（圖1D—G）。

圖1 人BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察、鑒定及轉(zhuǎn)染Figure 1 Morphological observation,identification and transfection of human BMSCs

2.2 成骨誘導(dǎo)7 d的ALP染色和ALP活性檢測(cè)結(jié)果

成骨誘導(dǎo)7 d后，取細(xì)胞上清液進(jìn)行ALP活性檢測(cè)，miR-181a-5p mimic組的ALP水平比control組更高（P<0.001），而miR-181a-5p inhibitor組無明顯變化 （圖2A）。光鏡和直觀下可見，miR-181a-5p mimic組的ALP染色比control組表達(dá)更高，而miR-181a-5p inhibitor組則相對(duì)表達(dá)較低（圖2B、C）。

圖2 ALP染色和ALP活性檢測(cè)Figure 2 ALP staining and detection of ALP activity

2.3 成骨誘導(dǎo)21 d的ALP和茜素紅染色結(jié)果

成骨誘導(dǎo)21 d后，ALP染色光鏡下和直觀下可見control組、miR-181a-5p mimic組和miR-181a-5p inhibitor組無明顯差異（圖3A、B）。茜素紅染色光鏡下和直觀下可見miR-181a-5p mimic組比control組表達(dá)更高，可見礦化結(jié)節(jié)，而miR-181a-5p inhibitor組表達(dá)相對(duì)較低（圖3C、D）。

圖3 ALP染色和茜素紅染色Figure 3 ALP staining and alizarin red staining

2.4 RT-qPCR結(jié)果

成骨相關(guān)基因COL1、Runx2在miR-181a-5p mimic組中的表達(dá)比control組中更多 （P<0.05），而OCN表達(dá)更少（P<0.05）。COL1在miR-181a-5p inhibitor組中的表達(dá)比control組少（P<0.001）。詳見圖4。

圖4 RT-qPCR檢測(cè)成骨相關(guān)因子COL1、Runx2、OCNFigure 4 Detection of osteogenic related factors COL1,Runx2 and OCN by RT-qPCR

3 討論

在骨折術(shù)后恢復(fù)期中，骨改建的過程非常復(fù)雜，并且至關(guān)重要，BMSCs、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞在其中相互影響。而基于BMSCs再生的療法是目前主流的研究趨勢(shì)[7]。miRNA廣泛參與細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡，并且多種生理過程和病理結(jié)果高度依賴于miRNA的作用。許多研究證實(shí)miRNA在骨代謝過程中發(fā)揮了極其重要的調(diào)控作用，參與維持骨代謝的平衡[8-10]。Li等[11]發(fā)現(xiàn)了手部或關(guān)節(jié)骨折患者血漿中miR-214-5p的高表達(dá)，并證明了miR-214-5p下調(diào)的重要性，從而增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的活力和抗凋亡能力。有學(xué)者在小鼠股骨橫向骨折部位注射miR-218過表達(dá)細(xì)胞，在骨折后2周和4周時(shí)，與對(duì)照組相比，miR-218組骨體積顯著增加，表明miR-218對(duì) 骨 再 生 有 促 進(jìn) 作 用[12]。Lee等[13]證 明 了miR-29b-3p在股骨骨折愈合中有意義的治療效果，體內(nèi)研究表明，通過超聲系統(tǒng)單次注射miR-29b-3p，14 d后骨折明顯愈合。

miR-181a-5p作為miRNA家族中的重要成員，可通過調(diào)控不同的靶基因或信號(hào)通路參與細(xì)胞的生物學(xué)過程。miR-181a-5p是一種與骨代謝關(guān)系密切的基因，在多種間充質(zhì)干細(xì)胞分化時(shí)表達(dá)，可發(fā)揮成骨基因或破骨基因的作用參與細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)。本研究發(fā)現(xiàn)了miR-181a-5p是BMSCs成骨分化過程中一個(gè)重要的miRNA，在此過程中，miR-181a-5p過表達(dá)會(huì)促進(jìn)成骨分化，從而加快骨愈合過程。

然而，本研究對(duì)miR-181a-5p在成骨分化中的作用尚不清楚。學(xué)者發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞成骨樣分化時(shí)，下降的miR-181a-5p可抑制成骨樣分化，其可能的機(jī)制是抑制促鈣化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MAPK1和MAPK8的表達(dá)[14]。TGF-β/BMP和wnt/β-catenin通路在轉(zhuǎn)錄后被不同的miRNA調(diào)控，從而促進(jìn)或抑制成骨。具體來說，miRNA可以直接增加或降低信號(hào)通路成分和/或參與成骨分化的基因表達(dá)，最終對(duì)成骨過程產(chǎn)生刺激和抑制作用[15]。miR-23b、miR-30、miR-34c、miR-133、miR-135a、miR-137、miR-143、miR-203、miR-204、miR-205、miR-221、miR-505可 通過調(diào)控成骨相關(guān)靶基因Runx2來影響成骨分化過程[16]。而對(duì)于成骨相關(guān)的重要信號(hào)通路TGF-β/BMP來 說 ，miR-155、miR-195-5p、miR-93-5p、miR-98、miR-140-5p起了一定的調(diào)控作用[17-19]。

綜上所述，本研究證明了miR-181a-5p對(duì)人頜骨BMSCs的成骨分化具有促進(jìn)作用，從而為正頜術(shù)后骨愈合的治療方法提供了新的思路和方向。