基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序解析翹嘴鱖適應(yīng)人工飼料的分子機(jī)制

劉鼎瑞，歐陽(yáng)號(hào)鋒，黃景軍;，韓林強(qiáng)，李水生，李桂峰，嚴(yán)保華，侯玉潔，林浩然，張 勇

(1.中山大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275；2.廣東梁氏水產(chǎn)種業(yè)有限公司，廣東 佛山 528100；3.南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，南昌 330299)

0 引言

翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)屬于鱸形目，鮨科，翹嘴鱖亞科。翹嘴鱖是我國(guó)大宗淡水養(yǎng)殖魚類中經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的養(yǎng)殖品種，分布廣泛[1]，味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者喜愛。

翹嘴鱖是一種兇猛的肉食性魚類[2]，以活的魚類和其他水生動(dòng)物為食，拒絕攝食死魚[3]。這種獨(dú)特的攝食習(xí)性可能與多個(gè)因素有關(guān)，比如視黃醇通路[4]、學(xué)習(xí)和記憶[5]、食欲控制和晝夜節(jié)律等[6]。傳統(tǒng)活餌料魚養(yǎng)殖方式導(dǎo)致養(yǎng)殖病害易水平傳播、疫病高發(fā)、養(yǎng)殖成活率低，而使用違禁藥物又存在隱患。

鑒于上述情況，人們開始嘗試使用人工飼料馴化翹嘴鱖[7]。人們將肉食性魚類從攝食活餌料魚馴化成為攝食人工飼料已有成功案例，比如大口黑鱸(Micropterussalmoides)[8]。與傳統(tǒng)喂養(yǎng)活餌料魚的養(yǎng)殖模式相比，喂養(yǎng)人工飼料不僅可以大幅減少翹嘴鱖養(yǎng)殖的成本[9]，還可以避免通過(guò)餌料魚傳播的潛在疾病。然而，改變?nèi)馐承贼~類食性，攝食人工飼料存在一些潛在的問(wèn)題，比如，投喂人工飼料會(huì)使大口黑鱸產(chǎn)生氧化應(yīng)激并抑制先天免疫，最終影響大口黑鱸的健康狀況[10]。在翹嘴鱖中，人工飼料會(huì)對(duì)翹嘴鱖產(chǎn)生什么樣的影響尚未清楚，所以，在人工飼料養(yǎng)殖下，我們開展了翹嘴鱖生長(zhǎng)代謝與免疫應(yīng)激等生理變化的研究。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本實(shí)驗(yàn)由廣東梁氏水產(chǎn)種業(yè)有限公司提供大小規(guī)格一致的翹嘴鱖共180尾。其初始體長(zhǎng)為(7.57±1.39)cm，初始體質(zhì)量為(37.61±4.58)g。將其分為兩組：處理組(使用人工飼料喂養(yǎng))和對(duì)照組(使用活餌料魚喂養(yǎng))。處理組中使用的人工飼料為購(gòu)自佛山市南海區(qū)杰大飼料有限公司的翹嘴鱖專用配合飼料，對(duì)照組中使用的餌料魚為鯪魚(Cirrhinusmolitorella)苗。在養(yǎng)殖120 d后，分別從處理組和對(duì)照組各隨機(jī)選擇50尾魚進(jìn)行生長(zhǎng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，記錄體長(zhǎng)和體質(zhì)量。另外隨機(jī)從對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中分別選擇3尾魚進(jìn)行解剖取樣，解剖前使用MS-222(Westgene公司)對(duì)翹嘴鱖進(jìn)行麻醉以減少疼痛。然后分別采集對(duì)照組魚體的肝臟(CL組)及腦(CB組)與實(shí)驗(yàn)組魚體的肝臟(FL組)及腦(FB組)組織樣品。

1.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

步驟1：使用TRIzol試劑(Invitrogen,美國(guó))提取總RNA。

步驟2：分別使用Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(Agilent Technologies,美國(guó))的RNA Nano 6000 Assay Kit和NanoPhotometer?分光光度計(jì)(IMPLEN,美國(guó))檢測(cè)并測(cè)試RNA的完整性和純度。

步驟3：使用NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina?(NEB，美國(guó))生成序列庫(kù)，并在cBot聚類生成系統(tǒng)上對(duì)樣品添加索引代碼進(jìn)行聚類，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

步驟4：使用Illumina Novaseq平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序(北京諾禾致源科技股份有限公司，天津)。

1.3 數(shù)據(jù)分析和功能注釋

測(cè)序后使用in-house Perl腳本處理fastq格式的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行質(zhì)量控制，以獲得干凈數(shù)據(jù)(clean reads)。使用Hisat2 v2.0.5建立索引，并將clean reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì)。按照Pertea等人[11]的方法，使用StringTie(v1.3.3b)來(lái)組裝比對(duì)后的數(shù)據(jù)。

1.4 差異表達(dá)基因(DEGs)分析

DESeq2 R包(1.16.1)被用來(lái)分析差異表達(dá)基因(DEGs)。使用Benjamini和Hochberg方法調(diào)整P值以獲得明顯的差異性表達(dá)。使用Cluster Profiler R包進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG：Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和基因本體(GO：Gene Ontology)富集分析。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)

為了驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的可靠性，選擇肝臟和腦組織中9個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。表1為用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)的引物，分別選擇糖代謝相關(guān)蛋白葡萄糖激酶引物(GCK)、葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白引物(GCKR)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶引物(PEPCK)，脂代謝相關(guān)基因脂蛋白脂肪酶引物(LPL)，攝食相關(guān)基因神經(jīng)肽Y引物(NPY)，免疫相關(guān)基因單?；视王＾D(zhuǎn)移酶1引物(MGAT1)、單?；视王＾D(zhuǎn)移酶4引物(MGAT4)，人生長(zhǎng)停滯DNA損傷可誘導(dǎo)蛋白α引物(GADD45α)、α腫瘤壞死因子引物(TNF-α)的基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其擴(kuò)增效率均為90%～100%。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

表1 (續(xù))

按照1.2節(jié)所述提取總RNA，使用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kit(TOYOBO)合成第一鏈cDNA。使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier 5設(shè)計(jì)特定引物。在Roche LightCycler480實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析，按照說(shuō)明書使用SYBR Green I Master Mix(Roche)。PCR條件如下：95 ℃，10 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s。選擇β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)表現(xiàn)

在使用人工飼料和活餌料魚喂養(yǎng)翹嘴鱖120 d后，分別從處理組和對(duì)照組中各隨機(jī)抽取50尾魚測(cè)量其生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值，并使用非配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯著性差異。飼養(yǎng)120 d后，處理組的體長(zhǎng)為(19.48±2.35) cm，體質(zhì)量為(140.27±53.83) g，對(duì)照組體長(zhǎng)為(28.45±2.74) cm，體質(zhì)量為(407.03±109.12) g。處理組的平均體長(zhǎng)和體質(zhì)量與對(duì)照組有顯著差異，處理組的體長(zhǎng)較短，體質(zhì)量較小(圖1)。

****表示P<0.000 1。圖1 處理組與對(duì)照組的生長(zhǎng)表現(xiàn)

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的初步分析

使用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行cDNA文庫(kù)測(cè)序后，在處理組的肝臟(FL組)和處理組的腦(FB組)中分別獲得42 796 015，46 129 992條原始數(shù)據(jù)，在對(duì)照組的肝臟(CL組)和對(duì)照組的腦(CB組)中分別獲得44 900 185，44 054 696條原始數(shù)據(jù)。進(jìn)行過(guò)濾后FL、FB、CL和CB組中分別產(chǎn)生了41 451 466，44 876 309，43 077 980和42 240 382條干凈數(shù)據(jù)。在所有文庫(kù)中Q20(某一堿基質(zhì)量值占全部堿基數(shù)的20%)不小于96%，Q30(某一堿基質(zhì)量值占全部堿基數(shù)的30%)不小于90%(表2)，結(jié)果表明測(cè)序質(zhì)量非常高，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)效率分析

比對(duì)效率即與參考基因組比對(duì)上的數(shù)據(jù)占干凈數(shù)據(jù)的百分比。本研究中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)效率均高于90%。其中處理組6個(gè)樣本的比對(duì)效率均超過(guò)90%，最高的為94.95%；對(duì)照組6個(gè)樣本的比對(duì)效率均超過(guò)90%，最高的為95.53%。比對(duì)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠，可以用于后續(xù)研究，比對(duì)結(jié)果見表3。

表3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)效率

2.4 DEGs的分析

使用R包deseq2，以差異表達(dá)倍數(shù)(FC，記為FC)的對(duì)數(shù)值|log2FC|>2和Padj<0.05(Padj表示修正過(guò)的P值)為篩選條件，分別對(duì)FL、FB、CL和CB組的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示處理組和對(duì)照組的組間基因表達(dá)量存在差別，且差別則較為明顯(圖2)。RNA-seq結(jié)果顯示在FL組和CL組之間有1 064個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，其中586個(gè)基因上調(diào)，478個(gè)基因下調(diào)。FB組和CB組之間有233個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，其中83個(gè)基因上調(diào)，150個(gè)基因下調(diào)(圖3)。在FL組和CL組之間大量與葡萄糖代謝、脂質(zhì)反應(yīng)、對(duì)內(nèi)源性刺激的反應(yīng)、蛋白質(zhì)分解過(guò)程、免疫反應(yīng)、蛋白酶體復(fù)合體和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性有關(guān)的DEGs被富集。

FL CL FB CB FL組為處理組肝臟，CL組為對(duì)照組肝臟， FB組為處理組腦，CB組為對(duì)照組腦。紅色：表示基因表達(dá)水平高；綠色：表示基因表達(dá)水平低。圖2 差異表達(dá)基因的層次聚類熱圖

圖3 處理組與對(duì)照組各組織的差異基因火山圖

2.5 GO和KEGG通路的富集分析

對(duì)處理組和對(duì)照組的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示大腦中有416個(gè)GO條目被富集，肝臟中有698個(gè)GO條目被富集(圖4)。肝臟作為重要的代謝器官，我們進(jìn)一步研究了處理組中DEGs的GO富集情況，在生物過(guò)程類別(BP)中，對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)(GO:0033993)、對(duì)內(nèi)源性刺激的反應(yīng)(GO:0009719)、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路(GO:0043401)、對(duì)激素的反應(yīng)(GO:0009725)和蛋白質(zhì)催化過(guò)程(GO:0030163)被顯著富集。在細(xì)胞成分類別(CC)中，蛋白復(fù)合物(GO:0000502)和內(nèi)源復(fù)合物(GO:1905369)被顯著富集。在分子功能類別(MF)中，蘇氨酸型肽酶活性(GO:0070003)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(GO:0003700)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器活性(GO:0140110)等條目被顯著富集。

對(duì)處理組和對(duì)照組的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，分別有134和61條信號(hào)通路在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中被富集，并且分別有一條信號(hào)通路被顯著富集。在富集的信號(hào)通路中，脂肪酸代謝、Toll樣受體信號(hào)通路和細(xì)胞黏附分子在肝組織中更為突出，而神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路和氮代謝在腦組織中更為突出(圖5)。這表明，翹嘴鱖腦中的神經(jīng)配體作用以及肝臟中糖脂相關(guān)代謝可能對(duì)于翹嘴鱖適應(yīng)人工飼料以及馴化有著重要的作用。

(a)處理組與對(duì)照組肝臟的富集結(jié)果 (b)處理組與對(duì)照組腦的富集結(jié)果 BP為生物過(guò)程；MF為分子功能；CC為細(xì)胞組分。圖4 處理組與對(duì)照組各組織的GO富集結(jié)果

(a)處理組與對(duì)照組肝臟的富集結(jié)果 (b)處理組與對(duì)照組腦的富集結(jié)果 nC為差異表達(dá)基因數(shù)量；Padj為校正后的P值。圖5 處理組與對(duì)照組各組織的KEGG富集結(jié)果

2.6 實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，對(duì)腦和肝臟中9個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析，并比較qRT-PCR與RNA-seq的結(jié)果。這9個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與RNA-seq中的趨勢(shì)相似(圖6)。因此，qRT-PCR的結(jié)果證實(shí)了RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，在投喂人工飼料期間，翹嘴鱖肝臟中與糖代謝以及脂代謝有關(guān)的基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，促食欲基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，說(shuō)明翹嘴鱖可能對(duì)人工飼料的接受度不高，并且糖脂代謝可能與翹嘴鱖的馴化密切相關(guān)。

(a)肝臟中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量和FPKM值 (b)肝臟中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量和FPKM值

(c)腦中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量和FPKM值 (d)腦中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量和FPKM值 *表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1。圖6 處理組和對(duì)照組肝臟和腦的基因表達(dá)譜

3 討論

在對(duì)比養(yǎng)殖4個(gè)月后，對(duì)照組與處理組的生長(zhǎng)出現(xiàn)了顯著性差異，對(duì)照組的平均體質(zhì)量和體長(zhǎng)明顯高于處理組。由于翹嘴鱖具有獨(dú)特的攝食習(xí)慣[12]，是一種肉食性魚類[13]，處理組的翹嘴鱖出現(xiàn)了食欲不振和游動(dòng)緩慢等現(xiàn)象，這表明翹嘴鱖對(duì)人工飼料還沒有形成良好的適應(yīng)性。Guan等[14]比較了用人工飼料和餌料魚喂養(yǎng)的大口黑鱸的生長(zhǎng)性狀。結(jié)果顯示，從第20天開始，用餌料魚喂養(yǎng)的大口黑鱸的體質(zhì)量開始明顯高于用人工飼料喂養(yǎng)的大口黑鱸，這與本研究結(jié)果一致。這種生長(zhǎng)上的差異可能與人工飼料的營(yíng)養(yǎng)成分和營(yíng)養(yǎng)比例有關(guān)，餌料魚中各種脂肪和蛋白質(zhì)的比例或其組合形式更容易吸收。由于翹嘴鱖對(duì)人工飼料沒有形成良好的適應(yīng)性，使用人工飼料喂養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致翹嘴鱖對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率較低，影響翹嘴鱖的生長(zhǎng)。

與活餌料魚相比，人工飼料最大的區(qū)別在于營(yíng)養(yǎng)成分的不同和喂養(yǎng)方式的改變[15]。糖類和脂類成分在人工飼料中占較高的比例，而活餌料魚的蛋白質(zhì)成分較高[16]。作為一種肉食性魚類，翹嘴鱖難以很好地利用糖脂類化合物。同時(shí)，人工飼料中氨基酸含量較少，這也可能會(huì)影響翹嘴鱖的新陳代謝和免疫力。碳水化合物的新陳代謝是魚類最重要的代謝之一。碳水化合物負(fù)責(zé)提供能量，維持正常的生命活動(dòng)，甚至在卵細(xì)胞的成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17]。碳水化合物的代謝包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑以及其他生命過(guò)程，硬骨魚類能夠通過(guò)調(diào)節(jié)自身碳水化合物的代謝途徑來(lái)控制糖的合成和分解從而影響身體的血糖水平和生物合成[18]。與哺乳動(dòng)物不同，魚類一般被認(rèn)為是葡萄糖不耐受的，他們不能很好地利用或儲(chǔ)存葡萄糖[19]。穩(wěn)定的血糖水平對(duì)魚類的生長(zhǎng)、代謝和其他重要的生命活動(dòng)起著重要作用。如果給魚喂食過(guò)量的葡萄糖，可能會(huì)導(dǎo)致葡萄糖代謝紊亂，甚至引發(fā)糖化肝病[20]。在肉食性魚類中，葡萄糖可能在特定組織或特定活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[21]。在本研究中，淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝，以及丙酮酸代謝和胰島素信號(hào)通路都在KEGG中被富集，表明與對(duì)照組相比，肝臟中涉及這些與碳水化合物代謝有關(guān)通路的大多數(shù)基因的表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPCK)與丙酮酸羧化酶一起負(fù)責(zé)糖異生中從丙酮酸到磷酸烯醇丙酮酸的反應(yīng)步驟，是糖異生過(guò)程中的一種重要限速酶。在魚類中，PEPCK與葡萄糖的有效利用密切相關(guān)。軍曹魚(Rachycentroncanadum)是一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類，分布在熱帶水域，如大西洋、印度洋和太平洋(東太平洋除外)[22]。與其他肉食性魚類不同，軍曹魚可以更有效地利用葡萄糖，這可能與它肝臟中PEPCK的表達(dá)水平有關(guān)[23]。本研究中，處理組的肝臟中PEPCK基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組，說(shuō)明與對(duì)照組相比，處理組的翹嘴鱖能更有效地利用葡萄糖，這可能是由于人工飼料中的脂質(zhì)成分已經(jīng)超過(guò)了翹嘴鱖的代謝范圍，因此翹嘴鱖必須通過(guò)糖異生作用將脂質(zhì)成分轉(zhuǎn)化為葡萄糖進(jìn)行儲(chǔ)存。葡萄糖激酶(GCK)是糖酵解反應(yīng)的限速酶，它負(fù)責(zé)催化葡萄糖磷酸化為6-磷酸葡萄糖，在調(diào)節(jié)魚類的血糖平衡中起核心作用[24]。作為GCK的調(diào)節(jié)蛋白，葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白(GCKR)通過(guò)非共價(jià)結(jié)合與葡萄糖激酶形成非活性復(fù)合物，抑制肝臟和胰島細(xì)胞中葡萄糖激酶的活性[25]。在本研究中，處理組GCK基因的表達(dá)水平下降，相應(yīng)地，GCKR的表達(dá)水平增加。這可能是由于人工飼料中含有過(guò)多的葡萄糖，超過(guò)了翹嘴鱖的加工能力，導(dǎo)致翹嘴鱖的糖酵解反應(yīng)減少，葡萄糖分解減少。

脂質(zhì)代謝是最重要的代謝途徑之一，包括甘油三酯代謝、磷脂代謝和膽固醇代謝。在血液中，脂質(zhì)以脂蛋白的形式運(yùn)輸，根據(jù)其密度可分為乳糜微粒、低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白[26]。單酰基甘油酰轉(zhuǎn)移酶(MGATs)是合成三酰甘油(TAG)的關(guān)鍵酶，涉及許多生理功能，諸如腸道脂肪吸收、脂蛋白組裝、脂肪組織形成等[27]。脂蛋白脂肪酶(LPL)主要催化水解糜爛顆粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯，產(chǎn)生脂肪酸和單酰甘油供身體組織使用[28]。本研究處理組中肝組織以及腦組織的MGAT1和MGAT4的表達(dá)水平均上調(diào)，說(shuō)明在投喂人工飼料后，翹嘴鱖腸道對(duì)于脂肪的吸收和三酰甘油的合成加強(qiáng)。相反，處理組中LPL的表達(dá)水平受到了抑制，總的來(lái)說(shuō)可能是由于人工飼料中含有豐富的脂肪酸，因此翹嘴鱖不再需要分解甘油三酯來(lái)獲得脂肪，同時(shí)需要增強(qiáng)吸收脂肪的基因表達(dá)，以此來(lái)應(yīng)對(duì)人工飼料中增加的脂質(zhì)成分。此外，LPL基因還可能與魚類對(duì)人工飼料的適應(yīng)能力以及馴化有關(guān)。Ma等[29]發(fā)現(xiàn)，在大口黑鱸中，LPL的SNPs與大口黑鱸適應(yīng)人工飼料的能力有關(guān)。本研究中，LPL的表達(dá)量在喂食人工飼料后出現(xiàn)下調(diào)。作為動(dòng)物脂代謝的關(guān)鍵酶，這一結(jié)果可能表明，翹嘴鱖暫時(shí)還未適應(yīng)人工飼料。

在肝臟中，人工飼料主要影響翹嘴鱖的生理代謝，對(duì)糖代謝和脂質(zhì)代謝產(chǎn)生影響。而在大腦中，人工餌料則會(huì)對(duì)翹嘴鱖的攝食調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響。神經(jīng)肽Y(NPY)是一種廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)肽[30]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，NPY一直是魚類攝食調(diào)節(jié)的研究重點(diǎn),它被認(rèn)為與魚類攝食行為的機(jī)制[31]、斑馬魚運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[32]、免疫[33]和焦慮等行為[34]有關(guān)。NPY的主要功能是增加食物攝入和減少飽食動(dòng)物的生熱作用[35]。在金魚(Carassiusauratus)[36]、斑馬魚[37]和羅非魚[38]中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NPY與魚類攝食行為的調(diào)節(jié)有關(guān)，是魚類攝食調(diào)節(jié)中極為重要的神經(jīng)肽。本研究中，處理組腦內(nèi)NPY的表達(dá)水平明顯下降，這與He等[6]的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果一致。這表明，食欲低下的翹嘴鱖可能更容易接受人工飼料，食欲高的翹嘴鱖傾向于追逐活躍的餌料魚，拒絕吃靜止的人工飼料。

本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，免疫相關(guān)途徑在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中被富集,這與大口黑鱸的相關(guān)研究結(jié)果一致。當(dāng)大口黑鱸進(jìn)食人工飼料時(shí)，其免疫相關(guān)基因會(huì)在分子水平上被上調(diào)[39]。研究表明，高糖飲食可能會(huì)增加非酒精性脂肪肝(NAFLD)的風(fēng)險(xiǎn)[40]。當(dāng)血脂水平高時(shí)，幼鱸的生長(zhǎng)，肝臟代謝酶和抗氧化能力將受到影響[41]。因此，在養(yǎng)殖過(guò)程中，如果翹嘴鱖攝入糖脂含量較高的飼料，可能會(huì)對(duì)應(yīng)地產(chǎn)生免疫反應(yīng)。TNF-α是一種多效細(xì)胞分子,在炎癥、細(xì)胞凋亡和免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著核心作用，在調(diào)節(jié)魚類的各種生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，并且與腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)[42]。GADD45α基因編碼的蛋白是一種應(yīng)激蛋白，對(duì)環(huán)境做出反應(yīng)，在DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、衰老、基因毒性應(yīng)激反應(yīng)和其他細(xì)胞功能中起著重要的調(diào)節(jié)作用[43]。在本研究中，TNF-α和GADD45α的表達(dá)在處理組的肝臟和腦中均有上調(diào)，這說(shuō)明投喂人工飼料可能會(huì)引起翹嘴鱖肝臟和大腦的炎癥反應(yīng)，使翹嘴鱖產(chǎn)生免疫反應(yīng)。與傳統(tǒng)餌料魚相比，人工飼料的蛋白質(zhì)來(lái)源不同，糖類和脂類的含量較高。因此，翹嘴鱖在攝入人工飼料后或無(wú)法較好地利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致糖類和脂類成分的積累，最終導(dǎo)致翹嘴鱖產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)投喂人工飼料會(huì)影響翹嘴鱖的代謝、免疫和攝食調(diào)節(jié)。其中，碳水化合物代謝和脂質(zhì)代謝可能會(huì)對(duì)翹嘴鱖適應(yīng)人工飼料產(chǎn)生重要影響。研究結(jié)果可為翹嘴鱖飼料馴化養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，促進(jìn)翹嘴鱖飼料配方和養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展。