宿半夏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及體細(xì)胞胚發(fā)生的研究

陶興魁,張興桃,馮 凡,王海潮

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州,234000

半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，是一種重要的中藥材。半夏野生資源分布于東北、華北以及長江流域等地區(qū)，主產(chǎn)于四川、湖北、江蘇、安徽等省份，采挖季節(jié)為夏天和秋天莖葉茂盛時期。半夏主要功效有燥熱化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)，近些年研究發(fā)現(xiàn)還具有抗腫瘤、降血脂、保護肝臟等多種重要作用，據(jù)統(tǒng)計在500多種中藥處方中，半夏使用頻率高居第22位[1-2]。宿半夏生長在宿州、淮北等地，質(zhì)量上等，根據(jù)清光緒年間《宿州志》中有記載：“宿半夏唯獨四鋪、孫町(現(xiàn)在淮北市境內(nèi))佳也，宿半夏粉足、色白，北京同仁堂點名要此地半夏”[3]。目前關(guān)于半夏組織培養(yǎng)方面的研究已有很多，但是關(guān)于半夏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程、懸浮培養(yǎng)下單細(xì)胞誘導(dǎo)胚胎發(fā)生方面的研究報道較少。劉貴賢等[4]研究將半夏愈傷組織接種在MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中連續(xù)繼代3次，得到的疏松愈傷組織適于建立半夏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系。 李歡等[5]以半夏疏松愈傷組織為試驗材料，采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，通過控制培養(yǎng)條件(溫度、咖啡因、蔗糖濃度)研究表明8 ℃處理12 h，恢復(fù)36 h，懸浮細(xì)胞同步化效果較好，分裂指數(shù)為13.86%。毛春娜等[6]研究結(jié)果顯示低溫處理可以明顯影響半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化，有效提高其分裂指數(shù)。陶興魁等[7]對半夏試管塊莖懸浮培養(yǎng)加以水楊酸刺激，研究了半夏體內(nèi)生物堿的含量變化。近些年，通過植物生物技術(shù)高效獲得體細(xì)胞胚，然后通過體細(xì)胞胚進(jìn)行植株再生研究已成為熱門方向[8-10]。文本在建立宿半夏懸浮培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，對宿半夏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生長周期和生長周期中的pH、細(xì)胞干鮮重的變化、懸浮培養(yǎng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行了研究，為宿半夏組織培養(yǎng)的開發(fā)和優(yōu)良無性系的繁殖提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

宿半夏由安徽省淮北市濉溪縣飛龍中藥材科技開發(fā)研究所提供，經(jīng)淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院薛建平教授鑒定為安徽道地藥材宿半夏的新鮮塊莖。

1.2 方 法

選取宿半夏塊莖外植體，經(jīng)體外消毒、接種、組織培養(yǎng)獲得愈傷組織。20 d后，取3.5 g質(zhì)地疏松、分散性好的愈傷組織，接種在添加2,4-D和6-BA的MS液體培養(yǎng)基中[11-12]，3%蔗糖，300 mg/L水解酪蛋白(CH)，pH 5.8～6.0，溫度25±1 ℃，置于水平旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90～100 rpm，光照條件下懸浮振蕩培養(yǎng)。篩選最優(yōu)的懸浮培養(yǎng)條件，得到宿半夏懸浮細(xì)胞系，用100目不銹鋼篩對懸浮細(xì)胞進(jìn)行過濾，保留濾液，然后補充新鮮培養(yǎng)液，15 d后作為起始培養(yǎng)液。每5 mL懸浮母液轉(zhuǎn)入含有30 mL液體培養(yǎng)基中，15 d繼代一次。

用血球計數(shù)板檢測細(xì)胞數(shù)目，計算起始密度(1.0×105個/mL)，用中性紅染液檢測活細(xì)胞數(shù)目，每2 d取其懸浮液檢測細(xì)胞密度，并繪制細(xì)胞生長曲線圖。用精密酸度計檢測其pH值變化，然后用離心機對懸浮液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為5 000 rpm，離心20 min，棄去上清液稱其鮮重，在60 ℃的溫度下烘干4 h后稱其干重。將宿半夏懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，降低或停止振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生。定期顯微觀察拍照。試驗重復(fù)3次，利用Excel 2010、SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基篩選

將半夏塊莖外植體增殖所得的愈傷組織接種在添加2,4-D和6-BA的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)后均可得到懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種植物激素不同濃度的搭配使用得到的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的分散度、生長情況及細(xì)胞胚性等差別教大。由表1表明，液體培養(yǎng)基MS+1.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+300mg/L CH中振蕩培養(yǎng)，觀察得到的懸浮細(xì)胞，生長增殖最快，單細(xì)胞最多，分散度好，活細(xì)胞率最高，細(xì)胞系比較穩(wěn)定。

表1 不同植物生長物質(zhì)對宿半夏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

2.2 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線及生長狀態(tài)的變化

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宿半夏懸浮細(xì)胞生長曲線呈“S”型(圖1)，可分為延遲期(0～5 d)、對數(shù)生長期(6～14 d)、平穩(wěn)期(15～19 d)和衰亡期(20 d后)。當(dāng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)至衰亡期之前，活細(xì)胞數(shù)量逐漸增長至最大值，衰亡期后逐漸減少。因此，宿半夏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時間應(yīng)控制在20 d以內(nèi)，繼代培養(yǎng)時間在15～18 d比較好。

圖1 宿半夏懸浮細(xì)胞生長曲線

懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)2～3次后培養(yǎng)液中即有大量游離單細(xì)胞，多為橢圓形、月牙形細(xì)胞，圓形細(xì)胞較少(圖2)，這時的細(xì)胞為非胚性細(xì)胞，表現(xiàn)為體積較大生長較慢。繼代3～4次時，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，即圓形細(xì)胞和橢圓形細(xì)胞開始增多，此時的細(xì)胞多為胚性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)濃厚，分裂增殖旺盛，多為均等分裂，能夠看到細(xì)胞核(圖3)。試驗發(fā)現(xiàn)，第一次懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞的延遲期較長，7 d左右，啟動分裂的緩慢，生長較慢。經(jīng)過2～3次懸浮繼代培養(yǎng)后，啟動分裂時間縮短，分裂增殖加快，用100目不銹鋼篩過濾，濾去大細(xì)胞團和組織碎片，可得到宿半夏單細(xì)胞懸浮系，繼續(xù)培養(yǎng)并趨于穩(wěn)定。

圖2 宿半夏游離單細(xì)胞

圖3 宿半夏胚性細(xì)胞

2.3 宿半夏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)pH值的變化

由圖4結(jié)果可見宿半夏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值隨著培養(yǎng)時間延長有著明顯的變化，宿半夏懸浮細(xì)胞接種到液體培養(yǎng)基中，0～2 d內(nèi)pH上升到最高值6.72；但2～4 d內(nèi)pH有一個明顯下降的過程，降到5.2左右；隨后pH又繼續(xù)回升，6～24 d后pH便逐漸下降，到25 d時，培養(yǎng)基中的pH最低只有4.2左右。

圖4 宿半夏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值變化

2.4 懸浮培養(yǎng)液內(nèi)細(xì)胞鮮重和干重的變化

由圖5和圖6結(jié)果表明，懸浮液中細(xì)胞的鮮重和干重變化隨細(xì)胞的生長周期變化而呈現(xiàn)一致的變化趨勢。在延遲期培養(yǎng)物增重緩慢；在指數(shù)期培養(yǎng)物增重迅速；而到衰亡期增重幾乎停止，甚至出現(xiàn)下降的趨勢。因此，宿半夏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的最佳收獲期為20 d左右。

圖5 宿半夏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中鮮重的變化

圖6 宿半夏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中干重的變化

2.5 宿半夏懸浮細(xì)胞體細(xì)胞胚的發(fā)生過程

將繼代3～4次獲得的宿半夏懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基MS+1.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+300 mg/L CH中降低或停止振蕩培養(yǎng)。2 d后就開始有細(xì)胞分裂(圖7)，6～8 d后可見到胚性細(xì)胞團塊形成(圖8)，14～16 d后可觀察到有胚狀體的形成，30 d后產(chǎn)生大量的胚狀體，此時多數(shù)處在球形胚時期(圖9)。40 d后球狀胚顏色變成綠色，而且在胚狀體上可以看到有芽點產(chǎn)生，此時胚狀體迅速增殖變大，直徑約為5～6 mm(圖10)，胚生長狀況良好，可進(jìn)一步發(fā)育形成成熟的胚。

圖7 懸浮細(xì)胞(2天)

圖9 胚狀體(30天 )

圖10 胚狀體(40天)

3 討 論

關(guān)于體胚起源問題，大部分學(xué)者認(rèn)為體胚起源于單個細(xì)胞，胚性單細(xì)胞先發(fā)生不均等分裂形成二細(xì)胞、四細(xì)胞、進(jìn)而形成多細(xì)胞原胚，繼而發(fā)育為具有胚芽和胚根的成熟胚。在植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中，細(xì)胞分裂素和生長素起到關(guān)鍵作用，兩者結(jié)合使用在很多植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中起到很好的效果[13-14]。馮誠誠等[15]研究苦瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)，結(jié)果表明1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.04 mg/L TDZ培養(yǎng)基胚狀體的誘導(dǎo)率最高為19.60%。羅成科等[16]研究表明，將半夏懸浮細(xì)胞接種于附加不同濃度2,4-D和6-BA組合的培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，當(dāng)2,4-D濃度下降到1.0 mg/L時，可以產(chǎn)生大量的體細(xì)胞胚，說明低濃度的2,4-D有利于體細(xì)胞胚發(fā)生。孔凡芹等[17]用0.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA配比使用，楤木胚狀體誘導(dǎo)和增殖的效果明顯，胚狀體分化率達(dá)50%以上，增殖倍數(shù)達(dá)11.337倍。建立高效的半夏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，研究半夏懸浮細(xì)胞胚狀體的發(fā)生，是后續(xù)基于單細(xì)胞水平的半夏多倍體誘導(dǎo)獲得再生植株(組培苗)以及半夏人工種子生產(chǎn)量產(chǎn)化的有效途徑，優(yōu)質(zhì)半夏體細(xì)胞胚胎是進(jìn)行半夏快速繁殖的重要材料[18-19]。目前，由于半夏野生資源的日漸匱乏，通過研發(fā)半夏人工種子能有效地解決半夏品種退化，種莖缺乏，病害侵襲，野生資源瀕危等問題，且對提高半夏的產(chǎn)量和質(zhì)量意義重大[20]。

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，宿半夏細(xì)胞懸浮系的細(xì)胞生長曲線呈現(xiàn)S型，與其他藥用植物如黑果枸杞、太行菊的生長規(guī)律是一樣的[21-22]。pH值呈先升高后下降，然后再升高，最后緩慢下降的趨勢。宿半夏懸浮細(xì)胞的鮮重和干重的變化基本上和細(xì)胞生長曲線保持一致，在延遲期細(xì)胞對環(huán)境的適應(yīng)需要時間過程，此時不能很好地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，懸浮細(xì)胞增重緩慢；在指數(shù)期懸浮細(xì)胞能夠充分吸收營養(yǎng)物質(zhì)而增重迅速；而到衰亡期由于培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡以及有害物質(zhì)的積累導(dǎo)致懸浮細(xì)胞增加幾乎停止，甚至有下降的趨勢。采用1.5 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L 6-BA配比使用，添加適量的蔗糖、水解酪蛋白，降低振蕩速度后可誘導(dǎo)出了大量優(yōu)質(zhì)的宿半夏體細(xì)胞胚。體胚的誘導(dǎo)及發(fā)育不同時期對外源植物激素的需求是動態(tài)變化的，只有適時適量的調(diào)整植物激素，才能確保高頻率誘導(dǎo)形成高質(zhì)量的體細(xì)胞胚，在培養(yǎng)基中加入水解酪蛋白能明顯促進(jìn)體胚形成，適宜濃度為300 mg/L。

本研究通過宿半夏塊莖誘導(dǎo)愈傷組織，對宿半夏愈傷組織進(jìn)行液體振蕩懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，可以獲得了大量球狀體細(xì)胞胚，而且培養(yǎng)過程簡單，成產(chǎn)效率高，體胚生長質(zhì)量良好。為下一步宿半夏人工種子研究以及再生植株的獲得提供新的方法，為宿半夏大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)、試管苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)以及次生代謝產(chǎn)物的研究奠定基礎(chǔ)，對宿半夏藥材的推廣具有重大意義。