新型染料木素衍生物對(duì)肺癌細(xì)胞活性影響的研究

趙 芳，李紅俠，劉 宇,鮑道源

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州，234000

染料木素(Genistein,Gen),屬于大豆異黃酮苷元[1]，廣泛存在槐、葛根和大豆等中，有抗腫瘤活性[2]、抗氧化[3]和神經(jīng)保護(hù)作用等[4-5]，大量的研究及相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，染料木素對(duì)癌癥、炎癥、絕經(jīng)后癥狀、骨質(zhì)疏松和心血管疾病等多種病癥都具有較好的治療效果[6-8]。前列腺癌和乳腺癌在亞洲人中發(fā)病概率較低，就被歸因于亞洲人大量攝入的大豆產(chǎn)品中含有高水平植物雌激素——染料木素；與其他異黃酮類化合物相比，結(jié)構(gòu)類似于17β-雌二醇(E2)，與其競(jìng)爭(zhēng)雌激素受體(ER)，對(duì)ER-α的親和力為E2的4%，對(duì)ER-β的結(jié)合力為E2的87%[9]，從而在激素相關(guān)癌癥的治療中發(fā)揮良好的作用。EGFR-TKI 的出現(xiàn)使過(guò)去許多不能治療的惡性腫瘤得到有效控制，然而由于當(dāng)前的藥物具有毒副作用和耐藥性的缺點(diǎn)，因而研發(fā)高效、低毒的藥物迫在眉睫[10-11]。目前，國(guó)內(nèi)外研究表明，染料木素衍生物具有比母體更高的生物活性[12-13]，尤其在抗癌方面[14-16]。

肺癌屬于最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全球癌癥的相關(guān)死亡中，占比較高[17]。近幾十年來(lái)在肺癌的診斷及治療方面取得非常顯著的進(jìn)展，但5年生存率不高于百分之二十，肺癌屬于一種發(fā)病率和死亡率都高的惡性腫瘤，目前最有效的治療手段包括手術(shù)切除輔以放療和化療[18]。

哌嗪是藥物化學(xué)中經(jīng)常使用的一類含氮雜環(huán)的堿性基團(tuán)，易與蛋白形成多個(gè)氫鍵或者離子鍵，能有效調(diào)節(jié)藥物的酸堿平衡常數(shù)和脂水分配系數(shù)。將哌嗪引入分子中，能有效增加分子的水溶性和堿性，通過(guò)調(diào)節(jié)藥物的理化性質(zhì)，改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，從而提高分子的生物活性效增強(qiáng)，抗癌活性好[19-20]。本實(shí)驗(yàn)以染料木素為原料，引入哌嗪，合成一種新型染料木素衍生物(GeD)，通過(guò)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抗增殖活性影響,以期為今后的新藥物研發(fā)提供思路和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器、藥品

實(shí)驗(yàn)材料:人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549),人腎上腺上皮細(xì)胞株(293T),均由生物與食品工程學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室提供。

主要實(shí)驗(yàn)儀器:三用紫外分析儀,上海青浦瀘西儀器廠;XT4型熔點(diǎn)儀,北京泰克儀器有限公司的XT4型熔點(diǎn)儀;水平式細(xì)胞離心機(jī),北京雷勃爾離心機(jī)有限公司;Thermo 371 CO2培養(yǎng)箱,上海道尚生物科技有限公司;倒置顯微鏡,美國(guó) Thermo公司;酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;紅外線光譜儀(AVATAR370),日本日立公司;Accuri C6流式細(xì)胞儀,美國(guó)BD公司。

主要藥品：染料木素、2-氟苯基哌嗪(阿拉丁)、胎牛血清、胰蛋白酶和Annexin V-FITC/PI試劑盒(Beijing Solarbio Sicence Technogy Co.Ltd)；DMEM培養(yǎng)基(南京化學(xué)試劑有限公司)；MTT(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物的合成

依次準(zhǔn)確稱取染料木素1 mmol,1-2F苯基哌嗪1 mmol于50 mL的反應(yīng)瓶中，加無(wú)水乙醇30 mL，甲醛80 μL，置于油浴鍋加熱，溫度80 ℃，時(shí)間48 h,TLC跟蹤，反應(yīng)停止后，柱層層析，得染料木素的衍生物即藥物8 -((4-(2-氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)-5,7-二羥基-3-(4-羥基苯基)-2H-色烯-4-酮(文中以GeD代替)。

1.2.2 藥物的抗癌活性

(1)細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM高糖培養(yǎng)基，10%的胎牛血清，1%的雙抗。細(xì)胞培養(yǎng)條件5% CO2，溫度37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞瓶中的細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，終止培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。

(2)緩沖液配制。PBS的配制:準(zhǔn)確稱取NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4·12H2O 3.63 g、KH2PO40.24 g分別用超純水溶解調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1 L滅菌121 ℃，20 min， 4 ℃冰箱保存。

(3)藥液的配制。準(zhǔn)確稱取藥物GeD0.002 g，DMSO溶解，配成20 mg每升的母液，于-20 ℃冰箱保存，用時(shí)稀釋。

(4)腫瘤細(xì)胞的增殖活性。

①鋪板：取96孔板，外圍一圈加100 μL PBS。其余各孔加細(xì)胞液，將對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞，稀釋至預(yù)計(jì)濃度(用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ mL)后，分別加100 μL細(xì)胞液,置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

②加藥：12 h后，吸走原培液，第2列加100 μL培養(yǎng)液，第3列加細(xì)胞懸浮液100 μL，作為陰性對(duì)照。其余各列分別加藥，設(shè)4個(gè)濃度梯度(10、25、50、100 μmol/L)，3個(gè)重復(fù),放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。

③加MTT：24 h后，于避光環(huán)境下，每孔各加15 μL 5%的MTT,繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。

④加DMSO：4 h后吸去培養(yǎng)液，加150 μL的DMSO，水平搖床振蕩8～10 min。用酶標(biāo)儀，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值。

⑥細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，每孔100 μL，置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。設(shè)置對(duì)照組和藥物組，每組設(shè)3個(gè)平行；藥物組加入不同濃度梯度的GeD溶液共孵育24 h。各孔加入15 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去孔內(nèi)液體，然后加入150 μL DMSO，震蕩8～10 min，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值(OD)，重復(fù)三次。

(5)凋亡檢測(cè)

①選取對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞鋪六孔板。

②待細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1×106后，吸去培養(yǎng)液。分別加入0 μmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L濃度的GeD，置于37 °C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

③24 h和48 h后，每孔各加500 μL胰酶，大約1～2 min后，終止消化，吹打均勻后吸入2 mL的EP管中，3 400 r/min離心，時(shí)間5 min。

④輕輕吸去上層溶液，每管各加冷的PBS 1 mL，吹打均勻后，3 400 r/min，離心4 min。

⑤重復(fù)上一步驟后，用冷的PBS洗2次，吸去上層溶液，每管加入500 μL結(jié)合液，混勻后各加5 μL Annexin V-FITC，5 μL Propidium Iodide染色，25 ℃避光反應(yīng)10～15 min。

⑥在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果分析

2.1 藥物的性質(zhì)和表征

目標(biāo)化合物名稱：8-((4-(2-氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)-5,7-二羥基-3-(4-羥基苯基)-4H-色烯-4-酮，顏色為黃色，產(chǎn)率為66.5%，熔點(diǎn)為166-169 ℃1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ: 12.82(S,1H),8.16(S,1H),7.15-7.14(d,J=8.46 Hz,3H),6.83-6.80(m,3H),6.73-6.70(m,2H),6.60-6.58(d,J=8.46Hz,2H),6.03(S,1H),2.87(S,4H),2.45(S,4H),2.27(m,4H)。IR(KBr):3 313.14，2 968.19，2 826.67，1 652.20，1 586.54，1 509.68，1 475.14，1 440.97，1 371.43，1 353.82，1 322.80，1 258.37，1 192.19，1 175.09，1 150.63，1 116.01，1 060.51，1 027.90，1 007.19，938.73，920.11，902.04，889.26，878.10，837.81，794.23，758.84，720.54，707.25，673.58，617.85，559.67，537.03。分子式為：C26H23FN2O5，分子量：462.48。

圖1和圖2分別是C26H23FN2O5的1H NMR譜圖和IR譜圖。

圖1 C26H23FN2O5 的1H NMR譜圖

圖2 C26H23FN2O5的IR譜圖

由以上1H NMR、IR譜圖可確認(rèn)，合成結(jié)果的為目標(biāo)產(chǎn)物，以GeD來(lái)代替。

2.2 藥物的抗癌活性

2.2.1 藥物對(duì)293T的毒性影響

GeD對(duì)人腎上腺上皮細(xì)胞株(293T)的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(CC50值)為123.83 μM,可知GeD對(duì)正常人體細(xì)胞毒副作用很小。

2.2.2 藥物抗癌活性的檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，GeD對(duì)A549,24 h的IC50值為31.67 μM，48 h的IC50值為20.32 μM，說(shuō)明藥物的抗增殖活性存在時(shí)間上的依賴性。

表1 藥物對(duì)A549的抗增殖活性IC50值( μM)

2.2.3 流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果

圖3是藥物處理24 h細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖。0 μM即對(duì)照組，未用GeD處理，早期細(xì)胞凋亡2.76%，晚期細(xì)胞凋亡2.48%，正常的細(xì)胞占有率為94.4%，機(jī)械原因造成死亡的細(xì)胞的占有率0.4%，生長(zhǎng)的很好；在濃度為2 μM時(shí)，早期凋亡率為5.21%，晚期凋亡率為9.18%，對(duì)A549有輕微抑制作用；在濃度為6 μM時(shí)，早期凋亡率為10.6%，晚期凋亡率為6.34%，對(duì)A549仍為輕微抑制作用，相較2 μM時(shí)抑制效果有所上升；在濃度為8 μM時(shí)，早期凋亡率為14.6%，晚期凋亡率為10.6%，對(duì)A549抑制作用較好，相較2 μM、6 μM時(shí)抑制效果提升明顯。根據(jù)濃度從低到高各濃度GeD處理的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組對(duì)比可得，GeD對(duì)A549有明顯的抗增殖作用，且抑制效果隨GeD濃度的增加而增強(qiáng)。

圖3 目標(biāo)化合物對(duì)A549培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞凋亡

圖4是藥物處理48 h細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖，在濃度為2 μM時(shí)，凋亡細(xì)胞為20.65%，較24 h的用藥增加了6.26%，在濃度為6 μM時(shí)，凋亡細(xì)胞為28.06%，較24 h的用藥增加了11.12%，在濃度為8 μM時(shí)，凋亡細(xì)胞為43.3%，較24 h的用藥增加了18.1%，由此可見(jiàn)，當(dāng)藥物濃度不變時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率逐漸增加，且濃度越大，影響也越大。

圖4 目標(biāo)化合物對(duì)A549培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞凋亡

3 結(jié) 語(yǔ)

經(jīng)氫譜、紅外光譜等測(cè)定手段，確定合成的目標(biāo)化合物(GeD)的結(jié)構(gòu)。293T的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，其CC50值為147.15 μM，說(shuō)明新型染料木素衍生物的毒副作用很小。體外抗癌活性實(shí)驗(yàn)表明，合成藥對(duì)A549的IC50值在24 h、48 h時(shí)分別是31.67 μM和20.32 μM，藥物具有較好的抗增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果，表明細(xì)胞的凋亡率隨藥物的濃度、時(shí)間的增加而成依賴性增加。