化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法的研究現(xiàn)狀與技術(shù)難點(diǎn)

王培三，齊春霞

1.安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽合肥,230032；2.合肥師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，安徽合肥,230601

自從法國科學(xué)家Fenton發(fā)現(xiàn)Fe2+可以激活H2O2氧化酒石酸后，F(xiàn)enton 及其相關(guān)反應(yīng)引起了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的極大興趣[1]。Fe2+和 H2O2之間的反應(yīng)可以產(chǎn)生高活性羥基自由基(·OH)，而高氧化還原電位(E (·OH/H2O) = 2.8 V)的·OH被認(rèn)為具有最有效的調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過程的能力[2-3]?；诖?，2016年中科院上海硅酸鹽研究所施劍林研究員團(tuán)隊(duì)與步文博教授課題組提出一種利用腫瘤微環(huán)境(TME)實(shí)現(xiàn)特異性激活產(chǎn)生·OH殺死腫瘤細(xì)胞的新型治療策略，即化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法(CDT)[4]。

1 化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法的研究現(xiàn)狀

眾所周知，TME具有乏氧、微酸、H2O2過表達(dá)以及谷胱甘肽(GSH)高表達(dá)等特點(diǎn)，這為一些針對(duì)腫瘤微環(huán)境的治療手段提供必要條件[5-6]。CDT依賴于Fenton/類Fenton反應(yīng)來促進(jìn)腫瘤部位產(chǎn)生豐富的·OH，其中納米藥物在酸性TME中釋放Fenton化學(xué)試劑，將過表達(dá)的H2O2轉(zhuǎn)化為高毒性的·OH，進(jìn)而在癌細(xì)胞中引起氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，達(dá)到腫瘤治療的目的。值得注意的是，F(xiàn)enton/類Fenton反應(yīng)在堿性條件下和非腫瘤區(qū)域H2O2低于有效濃度下難以觸發(fā)，因此CDT是一種高選擇性和低毒副作用的腫瘤治療策略[7]。

2 化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法的技術(shù)難點(diǎn)

近幾年雖然CDT得到廣泛的探索和研究，但仍然存在治療效果不佳的局限，限制其在臨床上的應(yīng)用；主要受到以下三個(gè)方面的挑戰(zhàn)：(1)腫瘤部位相對(duì)較高的pH值不適合大多數(shù)Fenton/類Fenton反應(yīng)的發(fā)生；(2)腫瘤內(nèi)源性H2O2濃度低，不足以連續(xù)的產(chǎn)生·OH；(3)腫瘤微環(huán)境(TME)中還原性物質(zhì)(如谷胱甘肽GSH)的高表達(dá)削弱了CDT的治療效果。值得注意的是，F(xiàn)enton/類Fenton反應(yīng)通常在較低pH值范圍內(nèi)(pH值3～4)充滿活力，而腫瘤酸中毒作為一種常見的微環(huán)境應(yīng)激源，其特點(diǎn)是細(xì)胞外pH值呈微酸性(≈6.5)，細(xì)胞內(nèi)pH值呈中性(≈7.2)[8]，不足以觸發(fā)Fenton/類Fenton反應(yīng)。因此，弱酸性TME通常會(huì)限制Fenton/類Fenton反應(yīng)效率，顯著降低·OH的產(chǎn)率。為了解決酸度不夠的問題，近年來，已嘗試使用原位H+生成策略重構(gòu)TME以增強(qiáng)CDT效應(yīng)(ECDT)。例如，許多研究已將葡萄糖氧化酶(GOx)整合到Fenton納米治療劑中，GOx可以催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，從而形成富含H+的環(huán)境，提高腫瘤部位的酸度以增強(qiáng)Fenton/類Fenton反應(yīng)效率并實(shí)現(xiàn)ECDT[9-10]。除了使用GOx原位產(chǎn)生酸外，使用光酸是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的另一種常用方法。在光照射下，光酸被激活釋放H+，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞pH的重建[11]。盡管如此，GOx或光酸原位生成H+用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值通常是低效的，因?yàn)镠+產(chǎn)量低且癌細(xì)胞中固有的pH穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，而且，這種策略依賴于較長的反應(yīng)時(shí)間來酸化TME[12]。與經(jīng)典的pH依賴性Fenton/類Fenton反應(yīng)相比，開發(fā)非pH依賴性Fenton/類Fenton試劑有助于增加·OH的產(chǎn)生，尤其是在弱酸性TME中。近年來，一些納米材料，如金納米團(tuán)簇[13]、CoFe2O4納米顆粒[14]、Au@Ag異質(zhì)納米棒[15]以及錳基納米結(jié)構(gòu)[16]已被證明具有非酸性pH依賴性過氧化物酶模擬活性。這些與pH值無關(guān)的納米材料通過克服pH值限制，在增強(qiáng)癌細(xì)胞中的Fenton/類Fenton反應(yīng)方面表現(xiàn)出巨大的潛力。值得注意的是，錳基納米材料基于Mn2+引發(fā)的類Fenton反應(yīng)的最佳反應(yīng)pH值接近TME中的pH值，逐漸成為最具潛力的CDT試劑[17]。

CDT 也可以與其他治療方式的聯(lián)合治療。通過 CDT 與化療、光熱療法、光動(dòng)力學(xué)療法、超聲動(dòng)力學(xué)療法、氣體療法、饑餓療法、免疫療法等治療方式的聯(lián)合(圖 1)，有助于彌補(bǔ)單一療法各自的不足，取長補(bǔ)短，實(shí)現(xiàn)協(xié)同高效腫瘤治療[18]。

圖1 基于 CDT 的各種聯(lián)合治療策略

3 化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法中如何提高H2O2濃度的研究進(jìn)展

多種錳基納米材料(包括MnO[19-20]，MnO2[21-22]，MnS[23]，MnSiO3[24-25])已被設(shè)計(jì)用于觸發(fā)腫瘤內(nèi)Fenton/類Fenton反應(yīng)以產(chǎn)生·OH，消耗腫瘤內(nèi)源性H2O2實(shí)現(xiàn)CDT。然而，腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性過氧化氫水平不足和強(qiáng)大的抗氧化系統(tǒng)限制了·OH的產(chǎn)生并加速了·OH的消耗，從而極大降低了CDT治療效果。因此，通過增加H2O2濃度和降低腫瘤細(xì)胞中的GSH水平來上調(diào)癌細(xì)胞的氧化電位是增強(qiáng)ECDT的Fenton/類Fenton反應(yīng)的潛在手段。盡管TME中相對(duì)高濃度的H2O2為CDT提供了機(jī)會(huì)，但越來越多的研究表明，內(nèi)源性H2O2在CDT過程中仍不能產(chǎn)生足夠量的·OH來殺死癌細(xì)胞[26]。為克服這一障礙，大量H2O2自供給納米系統(tǒng)與Fenton納米藥物相結(jié)合，以提高Fenton/類Fenton反應(yīng)和ECDT的效率[27]。這些H2O2自供納米系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和建立通常圍繞兩個(gè)設(shè)計(jì)理念進(jìn)行：一是傳遞外源性H2O2[28-29]，二是原位激活內(nèi)源性H2O2增強(qiáng)通路，提高H2O2濃度，促進(jìn)瘤內(nèi)Fenton/類Fenton反應(yīng)，提高ECDT的效率[30-31]。在腫瘤抗氧化防御系統(tǒng)中谷胱甘肽(GSH)發(fā)揮重要作用，GSH作為還原劑可以直接清除ROS，從而降低CDT的效率。最近的研究表明，通過各種機(jī)制消耗GSH是提高CDT治療性能和選擇性的可行方法，可以作為輔助抗癌治療的重要策略[32]。盡管增加H2O2濃度和降低腫瘤細(xì)胞中的GSH水平使得CDT效率得到很大提高，但是實(shí)體瘤復(fù)雜的生物環(huán)境和較低藥物滲透率，使得單靠CDT很難徹底根除惡性腫瘤[7,33]?；贑DT的協(xié)同治療策略，包括光熱/CDT協(xié)同療法、化學(xué)/CDT協(xié)同療法、光動(dòng)力/CDT協(xié)同療法和聲動(dòng)力/CDT協(xié)同療法，已經(jīng)引起人們廣泛的關(guān)注[34]。在眾多聯(lián)合療法中，光熱療法(PTT)逐漸成為提高CDT療效的最常用而有效策略，其中光熱試劑將近紅外光(NIR)能量轉(zhuǎn)化為熱能，從而提高腫瘤部位的溫度[35]。重要的是，腫瘤區(qū)域局部過熱會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞內(nèi)生物分子造成不可逆的損害，破壞腫瘤生物屏障，提高了藥物滲透率，同時(shí)溫和的光熱效應(yīng)可以加速·OH的產(chǎn)生，增強(qiáng)CDT效率，從而提高抗腫瘤效果[36]。因此，開發(fā)具有光熱效應(yīng)以及TME響應(yīng)性消耗GSH、提高內(nèi)源性H2O2濃度性能的CDT藥物具有重要的研究意義和臨床價(jià)值。

4 結(jié) 論

結(jié)合前期的工作積累和研究成果，可以從三方面來提高CDT效率(如圖1)：(1)采用Bi2-xMnxO3納米球作為類芬頓反應(yīng)的催化劑，通過調(diào)節(jié)Bi5+、Mn4+的濃度來提高GSH消耗性能，破壞腫瘤抗氧化系統(tǒng)的平衡，提高CDT效率；(2)高價(jià)Bi具有葡萄糖氧化酶活性，能內(nèi)源性提高H2O2濃度，提高M(jìn)n2+驅(qū)動(dòng)的類Fenton反應(yīng)效率，進(jìn)而增強(qiáng)CDT；(3)摻雜Bi顯著提高Bi2-xMnxO3的光熱性能，提高腫瘤部位的溫度進(jìn)而破壞腫瘤內(nèi)生物分子及加速腫瘤區(qū)域血流量，從而提高實(shí)體瘤藥物滲透性，增強(qiáng)CDT治療效果。此外，錳(II)因其有5個(gè)未配對(duì)電子、高自旋數(shù)、電子弛豫時(shí)間長、順磁性的特點(diǎn)，早期被開發(fā)用作磁共振成像(MRI)的造影劑；鉍元素的高原子序數(shù)和X射線衰減系數(shù)，鉍基納米結(jié)構(gòu)被用作有前景的X射線計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)造影劑，基于材料本身具有多模態(tài)成像的功能，引入先進(jìn)的影像診斷技術(shù)CT、MRI和光聲成像等，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤病灶區(qū)時(shí)監(jiān)測以及評(píng)估CDT治療效果。通過材料表面的靶向修 飾，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)Bi2-xMnxO3材料的攝取，更進(jìn)一步提高材料對(duì)腫瘤的治療效果(如圖2)。

圖2 項(xiàng)目提出的研究思路與構(gòu)建的Bi2-xMnxO3納米球的能量傳遞原理

5 展 望

如果能夠開發(fā)Bi2-xMnxO3納米球作為非pH依賴性Fenton/類Fenton試劑，技術(shù)難點(diǎn)將會(huì)攻破。通過MTT實(shí)驗(yàn)探究Bi2-xMnxO3納米材料敏感的腫瘤細(xì)胞系，構(gòu)建合適的腫瘤模型，尾靜脈注射后采用CT和MRI成像功能實(shí)時(shí)觀測材料體內(nèi)分布和代謝過程，檢測材料在體內(nèi)循環(huán)過程的生物安全性。研究方法如，選用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞(CT26)、小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)、小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)作為腫瘤細(xì)胞模型，通過CCK8法檢測Bi2-xMnxO3納米結(jié)構(gòu)在有光和無光照情況下對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，通過活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA)檢測相應(yīng)細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生含量，并采用紅外熱成像儀IR780實(shí)時(shí)檢測細(xì)胞中的溫度，篩選Bi2-xMnxO3納米結(jié)構(gòu)敏感的腫瘤細(xì)胞系，指導(dǎo)構(gòu)建合適的腫瘤模型。此外，通過ROS清除劑(如N-乙?；?L-半胱氨酸(NAC))清除CDT治療的效果，觀察純PPT治療效果，以此來計(jì)算CDT和PTT貢獻(xiàn)。然后構(gòu)建CT26、4T1、B16F10皮下荷瘤小鼠模型。尾靜脈注射改性后Bi2-xMnxO3納米結(jié)構(gòu)，通過Bi2-xMnxO3納米結(jié)構(gòu)的CT與MRI造影功能指導(dǎo)近紅外光照射的治療時(shí)間窗口，每隔2天記錄小鼠腫瘤體積大小和體重，觀察抑瘤效果，探索Bi2-xMnxO3納米結(jié)構(gòu)對(duì)不同實(shí)體瘤的治療效果。對(duì)不同治療時(shí)期的小鼠眼球取血后，離心取血清，用試劑盒檢測不同治療時(shí)期小鼠血常規(guī)和血生化指標(biāo)；并分離小鼠主要臟器(心、肝、脾、肺、腎等)，通過HE染色檢查組織病理學(xué)變化，免疫組化檢測腫瘤組織中ROS水平變化。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)材料體內(nèi)的代謝過程的生物安全性以及對(duì)多個(gè)腫瘤模型的治療效果，探究體內(nèi)CDT和PTT協(xié)同抗腫瘤的療效。并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果指導(dǎo)材料制備條件的選擇，實(shí)現(xiàn)本課題的全部研究目標(biāo)，為臨床提供重要的參考數(shù)據(jù)。而Fenton/類Fenton反應(yīng)通常在較低pH值范圍內(nèi)(pH值3～4)充滿活力，在TME中細(xì)胞外pH值呈微酸性(≈6.5)，細(xì)胞內(nèi)pH值呈中性(≈7.2)，不足以觸發(fā)Fenton/類Fenton反應(yīng)；錳基納米材料基于Mn2+引發(fā)的類Fenton反應(yīng)的最佳反應(yīng)pH值接近TME中的pH值，有效克服傳統(tǒng)Fenton/類Fenton試劑對(duì)篇pH的依賴性，顯著提高CDT效率。且Bi2-xMnxO3納米球有效破壞腫瘤抗氧化系統(tǒng)、提高腫瘤內(nèi)源性H2O2濃度，調(diào)節(jié)Bi5+、Mn4+的濃度來提高GSH消耗性能，破壞腫瘤抗氧化系統(tǒng)的平衡，同時(shí)高價(jià)Bi具有葡萄糖氧化酶活性，提高腫瘤內(nèi)源性H2O2濃度，顯著提高CDT效率。并且Bi2-xMnxO3納米球具有良好光熱性能，增強(qiáng)CDT效果，摻雜Bi顯著提高Bi2-xMnxO3的光熱性能，提高腫瘤部位的溫度進(jìn)而破壞腫瘤內(nèi)生物分子進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞，并加速腫瘤區(qū)域血流量，提高實(shí)體瘤藥物滲透性，增強(qiáng)CDT治療效果。

雖然CDT領(lǐng)域發(fā)展迅速,但有些問題依然需要解決:(1)為提升CDT療效提供指導(dǎo),可以從分子層面上有效探索高效的CDT途徑;(2) 為其具備更高效的Fenton反應(yīng)或類Fenton反應(yīng)能力,可以設(shè)計(jì)和調(diào)控過渡金屬功能材料的元素組分和其相關(guān)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),以期增加腫瘤區(qū)羥基自由基的濃度;(3) 影像診斷技術(shù)不斷提高,可以對(duì)腫瘤病灶區(qū)實(shí)時(shí)評(píng)估和監(jiān)測CDT治療效果[37]。

綜上所述，如果按照實(shí)驗(yàn)分析能夠成功實(shí)施，將拓展錳基復(fù)合材料的化學(xué)制備以及在生物納米科技等領(lǐng)域的應(yīng)用，為腫瘤的多模態(tài)成像與治療、甚至臨床試驗(yàn)提供重要的數(shù)據(jù)與參考，具有重要的科學(xué)意義與社會(huì)效益。同時(shí)如果能夠把催化領(lǐng)域的相關(guān)知識(shí)為CDT研究方法提供對(duì)比性研究思路，將會(huì)很好地克服化學(xué)動(dòng)療法目前的技術(shù)難點(diǎn)。