• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    載銀/鈷β-磷酸三鈣的抗菌性能評估及其應(yīng)用于感染性骨缺損治療研究*

    2022-11-01 13:18:36劉昱辰韓秋陽汪壽騰謝克難楊為中
    功能材料 2022年10期
    關(guān)鍵詞:生物

    何 帥,劉昱辰,韓秋陽,汪壽騰,謝克難,謝 璐,鄧 怡,楊為中

    (1. 四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,成都 610065; 2. 中國人民解放軍63820部隊醫(yī)院,四川 綿陽 621051;3. 四川大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,成都 610065; 4. 四川大學(xué) 華西口腔醫(yī)院,成都 610041)

    0 引 言

    生物陶瓷β-磷酸三鈣(β-TCP)憑借其優(yōu)越的骨誘導(dǎo)性、優(yōu)異的生物相容性、耐腐蝕性能以及與人體骨骼具有相似的結(jié)構(gòu)和性能等諸多優(yōu)點,逐漸成為骨組織修復(fù)領(lǐng)域的首選植入材料之一[1-4]。但是,由于β-TCP本身缺乏殺菌能力,在植入手術(shù)過程中易引起植入體周圍感染(IAI)從而導(dǎo)致植入手術(shù)失敗[5]。細(xì)菌感染,尤其是IAI已成為全球人類面臨的嚴(yán)重健康威脅[6-8]。用于骨科修復(fù)或受損骨骼重建的合成植入物容易受到細(xì)菌入侵,因為在植入物和骨腔之間存在著一個界面,這為細(xì)菌滋生提供了空間,繼而引發(fā)骨植入體相關(guān)感染[9-10]。植入過程中β-TCP植入物周圍的病原菌感染則會造成患者繼發(fā)性損傷、植入手術(shù)失敗從而延長患者的治療周期。目前,主流療法是通過使用抗生素用于對抗細(xì)菌入侵[11-13]。然而,抗生素的濫用則可能會導(dǎo)致患者體內(nèi)耐藥菌的出現(xiàn),從而增加治療難度和治療成本[14-17]。因此,現(xiàn)急需一種創(chuàng)新、高效、安全的抗菌方法取代抗生素以對抗IAI。

    由于抗菌和成骨是骨缺損再生過程中兩個密切相關(guān)的過程,因此在設(shè)計性能更好的β-TCP植入物過程中,最關(guān)鍵且最具挑戰(zhàn)性的工作是如何平衡兩者之間的關(guān)系[18-19]。植入物的主要修飾方法可分為兩種,其一是通過生物活性金屬對植入體表面進(jìn)行修飾,另一種是將植入物與功能化材料相結(jié)合[20-23]。近年來,主流的抗菌劑一般是具有殺菌作用的金屬離子(Fe、Ag、Mn、Cu離子等),其通過破壞細(xì)菌膜進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部以殺死細(xì)菌[24-25]。同時,輸送到病原菌中的金屬離子會致使細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì)變性和滲漏,干擾其代謝過程并致其失活。其中,具有優(yōu)異抗菌性能的銀納米顆粒(AgNPs)基于以下原因引起了研究人員的廣泛關(guān)注:(1)AgNPs具有較強(qiáng)的滲透性和較大的比表面積;(2)AgNPs具有廣譜抗菌特性,能消滅大部分病原菌;(3)在體液環(huán)境下AgNPs釋放的Ag+可持續(xù)性地殺死細(xì)菌;(4)細(xì)菌膜與銀離子(Ag+)之間的靜電吸附有助于提高Ag+的殺菌能力;(5)病原體不會對AgNPs產(chǎn)生任何耐藥性。然而,考慮到體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性,多余的Ag+會帶來嚴(yán)重的全身性毒副作用。因此,如何降低Ag+的生物毒性同時不影響其抗菌效果是應(yīng)用AgNPs進(jìn)行抗菌治療的關(guān)鍵所在。由于仿貽貝聚多巴胺(PDA)具有出色的生物相容性和粘附性,AgNPs可以通過PDA的螯合作用緊密均勻地附著在植入物表面,以減少Ag+的浸出,從而降低其生物毒性[10]。因此,可通過PDA輔助將AgNPs接枝在植入體表面以增強(qiáng)材料抗菌能力。

    除了殺菌能力,良好的促組織生長能力對于骨植入材料來說也是極其重要的。因為組織生長的能力將直接影響植入物的成骨效果和長期固定能力[6]。近年來,許多研究結(jié)果表明,一些過渡金屬離子(Cr、Sr、Co、Ni、Fe、Cu離子等)可在細(xì)胞內(nèi)通過創(chuàng)造類缺氧微環(huán)境來刺激血管生成和促進(jìn)組織再生[18]。其中,鈷(Co)元素是人體生理功能中的關(guān)鍵微量元素。鈷離子可以替代血液中的鐵離子穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)并促進(jìn)紅細(xì)胞的生成,此外鈷離子還具有強(qiáng)大的抗菌能力?;贑o的這些特性,在本研究中開發(fā)了一種同時具有抗菌和促骨再生能力的Co摻雜材料。

    首先,通過壓制成型和煅燒制備了鈷摻雜的β-TCP(Co/β-TCP),再通過PDA的螯合反應(yīng)將AgNPs接枝在Co/β-TCP表面(Ag@Co/β-TCP)。通過掃描電子顯微鏡(SEM)、能量色散光譜(EDS)、X射線衍射儀(XRD)、傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)、接觸角測試儀和X射線光電子能譜(XPS)對材料的組成和表面性質(zhì)進(jìn)行了表征。以革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(S.aureus)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)為代表菌,測試了Ag@Co/β-TCP植入體的廣譜抗菌能力。與此同時,本研究還探究了該材料的生物相容性和生物毒性。

    1 材料和方法

    1.1 實驗試劑

    四水合硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O, AR)、六水合硝酸鈷(Co(NO3)2·6H2O, AR)、磷酸氫二銨((NH4)2HPO4, AR)、鹽酸(HCl, AR)、硝酸銀(AgNO3, AR),氯化鈉(NaCl, AR)和瓊脂(AR)購自成都科隆試劑(中國);蛋白胨和牛肉提取物購自北京澳寶生物技術(shù)公司(中國);Tris-HCl緩沖溶液購自北京太陽生物科技公司(中國);CCK-8試劑盒購自北京博泰生物科技有限公司(中國)。

    1.2 樣品制備

    鈷摻雜β-TCP(Co/β-TCP)是通過壓制成型和煅燒制備的[22]。簡而言之,將Ca(NO3)2·4H2O(0.1 mol/L)和Co(NO3)2·4H2O(0,0.002,0.005 mol/L)添加到去離子水中并在室溫下攪拌確保Ca(NO3)2·4H2O和Co(NO3)2·4H2O充分溶解。隨后,將7.926 g (NH4)2HPO4快速加入到上述混合溶液中并快速攪拌1 h,使用氨水將混合物的pH值調(diào)至10左右。將所得產(chǎn)品抽濾并用去離子水沖洗,重復(fù)3次。將所得樣品放入60 ℃烘箱中干燥24 h以去除殘留水分。在產(chǎn)品中添加硬脂酸鈉(質(zhì)量比為20%)作為造孔劑,然后將得到的粉末放入直徑為5 mm的模具中,在油壓壓片機(jī)中以10 MPa的壓力壓制3 min。最后,將成型的樣品放入馬弗爐中在800 ℃高溫下燒制2 h。

    為在植入體表面接枝AgNPs,在37 ℃下將Co/β-TCP浸入到PDA濃度為2 mg/mL的Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L, pH = 8.5)中浸泡12 h以得到PDA修飾的Co/β-TCP。用去離子水沖洗上述樣品并干燥后,將PDA修飾的Co/β-TCP在37 ℃下浸入AgNO3溶液(1 mmol/L)中6 h。然后使用去離子水將負(fù)載有Ag的Co/β-TCP沖洗3次去除未負(fù)載的AgNPs,在空氣中干燥。同時,在本研究中采用與對照組相同的方法制備了不含Co的Ag修飾β-TCP。

    1.3 表 征

    1.4 體外抗菌試驗

    S.aureus和E.coli分別是典型的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。因此,在本項研究中通過抑菌圈實驗測試了不同樣品(β-TCP, Co/β-TCP, Ag/β-TCP, Ag@Co/β-TCP)對E.coli和S.aureus的抑菌能力。將經(jīng)過紫外線照射滅菌后的樣品固定在涂有200 μL細(xì)菌懸浮液(1×106CFU/mL)的Luria-Bertani(LB)固體瓊脂培養(yǎng)基中,在37 ℃下培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

    1.5 體外細(xì)胞實驗

    1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    在溫度為37 ℃,含5% CO2的孵育箱中,人骨肉瘤細(xì)胞(MG63)在含10%胎牛血清(FBS,Gibco,美國)和1%鏈霉素-青霉素(南京凱基生物技術(shù)公司,中國)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM,南京凱基生物技術(shù)公司,中國)中培養(yǎng),每隔一天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)基。

    1.5.2 細(xì)胞毒性評估

    CCK-8試劑盒測定用于評估MG63的存活率。將培養(yǎng)的細(xì)胞以每孔2×104個細(xì)胞的密度接種在含有材料的48孔板中。培養(yǎng)1,3,5 d后,用含有10% CCK-8試劑和90%細(xì)胞培養(yǎng)基的混合物代替細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)2 h后,從每個孔中提取上述100 μL混合物并添加到酶標(biāo)板中,使用酶標(biāo)儀測量混合溶液在λ = 450 nm處的吸光度,以評估細(xì)胞的相對存活率。

    1.5.3 細(xì)胞形態(tài)評價

    在該研究中,通過SEM來觀察材料對細(xì)胞形貌的影響以評估材料的生物相容性。將細(xì)胞以每孔1×104個細(xì)胞的初始密度接種在含不同樣品的48孔板中。培養(yǎng)3 d后取出樣品并用磷酸緩沖溶液清洗,在300 μL戊二醛(2.5%)溶液中固定4 h。然后,使用不同濃度的乙醇(30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%)對細(xì)胞進(jìn)行梯度脫水。隨后,將樣品真空干燥,噴金,并通過SEM觀察細(xì)胞的形貌。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 材料的設(shè)計、制造和表征

    在這里,為了解決由植入體引起的相關(guān)感染問題和促進(jìn)骨缺損再生,開發(fā)了一種新型多功能材料(Ag@Co/β-TCP)。如圖1(a)所示,純β-TCP和Co摻雜β-TCP最初是通過壓制成型和煅燒制備的。在pH值為9~10的條件下,PDA可以通過自聚合錨定在大部分固體表面(包括β-TCP)。此外,由于PDA的兒茶酚基團(tuán)對金屬具有強(qiáng)大的螯合能力,因此AgNPs可以與PDA結(jié)合組裝形成Ag@Co/β-TCP表面的抗菌涂層,以提高Co/β-TCP的抗菌性能,解決IAI問題(圖1(b))。

    全站儀作為能夠自動測量距離、角度,自動進(jìn)行數(shù)據(jù)存儲及處理的測繪儀器,從20世紀(jì)70年代初發(fā)明至今,已成為測繪生產(chǎn)單位的最基本儀器,在各種測繪生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。與傳統(tǒng)測繪儀器一樣,全站儀作為測量距離、角度及坐標(biāo)的工具,在使用前必須進(jìn)行檢定,以確認(rèn)全站儀的精度能否達(dá)到出廠標(biāo)準(zhǔn)。

    圖1 (a) β-TCP,Co/β-TCP和 (b) Ag@Co/β-TCP的制備流程示意圖Fig.1 Schematic description of the manufacturing of (a) the β-TCP, Co/β-TCP, and (b) Ag@Co/β-TCP

    圖2(a)、(b)顯示了由β-TCP粉末經(jīng)過壓制成型和煅燒產(chǎn)生的Co摻雜β-TCP塊狀固體的微觀結(jié)構(gòu)。這些固體由聚集的微晶堆疊在一起,具有微孔結(jié)構(gòu)的陶瓷狀團(tuán)聚微晶均勻地分散在Co/β-TCP表面(Co含量為2%)(圖2(a))。在Co含量增加后,β-TCP表面(Co含量為5%)上分布著更多的類陶瓷微晶,晶體顆粒的邊界變得模糊,這種多孔結(jié)構(gòu)和粗糙的表面更有利于細(xì)胞的粘附和生長[21]。然后,使用EDS光譜用于確定其表面元素組成。圖2(c)顯示β-TCP表面的這些陶瓷狀微晶富含Ca、P和Co元素。此外,2% Co/β-TCP表面和5% Co/β-TCP表面除Co的含量有區(qū)別外,峰并沒有顯著差異。

    圖2 2% Co/β-TCP和5% Co/β-TCP的微孔和元素表征:(a) 2% Co/β-TCP表面形貌的SEM;(b) 5% Co/β-TCP表面形貌的SEM;(c) 2% Co/β-TCP和5% Co/β-TCP表面元素的能譜分析Fig.2 Micro-structure and element characterization of 2% Co/β-TCP and 5% Co/β-TCP: (a) SEM for surface morphology of 2% Co/β-TCP; (b) EDS for surface morphology of 5% Co/β-TCP; (c) EDS for the surface element of 2% Co/β-TCP and 5% Co/β-TCP

    圖3(a)顯示了β-TCP和Co/β-TCP的XRD圖譜。β-TCP的圖譜與Ca3(PO4)2(PDF#17-0320)的標(biāo)準(zhǔn)卡片非常一致。其衍射峰分別位于27.70°,30.98°和34.29°,可以很好地對應(yīng)于β-TCP的(214)、(0210)和(220)晶面,表明β-TCP的成功制備。摻雜Co后,Co/β-TCP的峰發(fā)生明顯變化。在25.91°,28.00°,31.23°和34.64°附近的主峰指向Co的(1010)、(214)、(0210)和(220)晶面 (JCPDS#49-1081),明顯的峰移表明加入Co的加入使得β-TCP晶格發(fā)生了膨脹或收縮。

    圖3 (a) 對于β-TCP和Co-doped β-TCP的相表征的XRD譜圖;(b) β-TCP和Co-doped β-TCP的FT-IR譜圖;(c)β-TCP和Co-doped β-TCP的WCAFig.3 (a) XRD patterns for phase characterization of β-TCP and Co-doped β-TCP; (b) FT-IR pattern; (c) The water contact angle of β-TCP and Co-doped β-TCP

    圖3(b)顯示了不同β-TCP的FT-IR譜圖。β-TCP在557和604 cm-1處的特征峰對應(yīng)于PO43-的面內(nèi)彎曲振動。943 cm-1處的峰與PO43-的對稱伸縮振動有關(guān),971.96~1 123.28 cm-1與PO43-的不對稱伸縮振動相匹配[25]。值得注意的是,加入Co后PO43-的不對稱伸縮振動發(fā)生了明顯變化,這可能源于β-TCP晶格的膨脹和收縮。此外,在3 443 cm-1處的吸收帶是因為樣品中的殘留水的存在。

    β-TCP和Co/β-TCP的表面親水性通過測量WCA來表征,以證明樣品改性對材料表面親水性的影響(圖3(c))。純β-TCP的WCA為46°,而2% Co/β-TCP和5% Co/β-TCP的WCA分別為18°和16°,表明Co的加入對材料表面親水性有正向促進(jìn)作用。研究表明,親水性的表面有助于細(xì)胞粘附和增殖[6,21],因此可假設(shè)Co的摻入可以促進(jìn)細(xì)胞粘附以提高骨修復(fù)的效率。

    2.2 Ag@Co/β-TCP的表征

    2.3 體外抗菌能力

    正如引言中所假設(shè)的, Ag@Co/β-TCP可以在體液環(huán)境中釋放Ag+和Co2+,破壞細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì),從而消滅細(xì)菌。為了研究Ag@Co/β-TCP的殺菌能力,在本研究中以S.aureus和E.coli作為代表性病原菌,將不同β-TCP材料固定在LB瓊脂板上培養(yǎng)24 h后,細(xì)菌抑菌圈結(jié)果如圖5所示。觀察到在Ag@Co/β-TCP與病原菌(S.aureus和E.coli)之間存在著較大的抑菌區(qū)域。相反,在β-TCP周圍沒有明顯的抑制區(qū)。而與β-TCP相比,Co/β-TCP的抗菌能力略有提高。由此可知:(1)β-TCP表面釋放的Ag+和Co2+促進(jìn)了β-TCP底物的抗菌活性;(2)Co/β-TCP顯示出微小的抑菌圈,表明Co2+不能獨立抑制病原菌;(3)AgNPs的接枝和Co的摻入使β-TCP具有顯著的抗菌活性。此外,對E.coli和S.aureus的抑菌結(jié)果表明Ag@Co/β-TCP具有廣譜殺菌作用。因此,Ag@Co/β-TCP具有在骨缺損修復(fù)的植入過程中建立無菌微環(huán)境的潛力。

    圖5 不同β-TCP樣品對E. coli和S. aureus的抗菌性能(虛線圓圈代表材料的抑菌區(qū)域)Fig.5 The different β-TCP-based samples against E. coli and S. aureus (the dotted circles represent the inhibition area)

    2.4 Ag@Co/β-TCP的細(xì)胞毒性

    除了殺菌性能以外,生物相容性也是骨植入材料一個關(guān)鍵性指標(biāo)。在本研究中通過CCK-8試劑盒來評估各種樣品對MG63細(xì)胞的影響。由圖6可知,各組中的細(xì)胞數(shù)量隨著時間的增加而增加。相比于β-TCP,由于銀本身具有一定的毒性,在各組中Ag/β-TCP中的細(xì)胞增殖性能最弱。與Ag/β-TCP組相反,由于Co2+具有促進(jìn)組織生長的能力,在Co/β-TCP和Ag@Co/β-TCP組中的細(xì)胞表現(xiàn)出更優(yōu)的活性。

    圖6 MG63細(xì)胞在β-TCP、Co/β-TCP、Ag/β-TCP以及Ag@Co/培養(yǎng)1,3和5天后的細(xì)胞活性Fig.6 CCK-8 kits assay of the MG63 cell proliferation on β-TCP, Co/β-TCP, Ag/β-TCP, as well as Ag@Co/β-TCP after culturing for 1, 3 and 5 d

    在本研究中通過SEM進(jìn)一步觀察了各種樣品上的MG63細(xì)胞形態(tài)。如圖7所示,在β-TCP上培養(yǎng)的細(xì)胞顯示出紡錘狀形狀,細(xì)胞邊緣周圍有絲狀偽足。然而,在Ag/β-TCP上培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出極差的細(xì)胞形態(tài)。值得注意的是,Ag@Co/β-TCP表面的細(xì)胞擴(kuò)散和形態(tài)比Ag/β-TCP更好,這表明Co的摻入會促進(jìn)細(xì)胞增殖,提升細(xì)胞的生物相容性。因此,Ag@Co/β-TCP的殺菌能力并不會影響細(xì)胞增殖,具有一定的生物安全性。

    圖7 MG63細(xì)胞在不同樣品上培養(yǎng)5 d后的SEM形貌圖Fig.7 Morphologies of MG63 detected by FE-SEM after 5 d of culture on different samples

    3 結(jié) 論

    通過壓制成形和PDA輔助改性成功構(gòu)建了Ag@Co/β-TCP植入物。通過SEM、EDS、XRD、FT-IR、接觸角測試儀和XPS對材料進(jìn)行了表征,以S.aureus和E.coli作為代表病原菌測試了Ag@Co/β-TCP的抗菌性能,并評估了其生物相容性,結(jié)果表明:

    (1)通過SEM、EDS、XRD、FT-IR、接觸角測試儀和XPS等一系列表征結(jié)果表明Ag@Co/β-TCP的成功制備,同時Ag@Co/β-TCP具有促細(xì)胞粘附和增殖的潛力。

    (2)由于Ag+和Co2+的顯著抗菌特性,在植入過程中Ag@Co/β-TCP可以持續(xù)釋放出Ag+和Co2+從而達(dá)到有效抑制病原菌的目的。細(xì)菌抑制區(qū)測試表明,在無抗生素的環(huán)境下Ag@Co/β-TCP具有對E.coli和S.aureus持續(xù)性的殺菌活性。

    (3)體外細(xì)胞實驗證明Ag@Co/β-TCP具有良好的生物相容性,在骨缺損的治療中具有出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。

    猜你喜歡
    生物
    生物多樣性
    生物多樣性
    上上生物
    發(fā)現(xiàn)不明生物
    史上“最黑暗”的生物
    軍事文摘(2020年20期)2020-11-28 11:42:50
    第12話 完美生物
    航空世界(2020年10期)2020-01-19 14:36:20
    最初的生物
    自然生物被直銷
    清晨生物初歷直銷
    生物的多樣性
    中出人妻视频一区二区| 精品国内亚洲2022精品成人| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产 一区 欧美 日韩| 在线播放国产精品三级| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日本三级黄在线观看| 免费黄网站久久成人精品 | 亚洲电影在线观看av| 免费在线观看影片大全网站| 深夜精品福利| 毛片女人毛片| 99热这里只有是精品50| 免费在线观看影片大全网站| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 51国产日韩欧美| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久99热这里只有精品18| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 可以在线观看的亚洲视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| av天堂中文字幕网| 国产精品一及| 欧美黑人巨大hd| 国产精品久久久久久久久免 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 免费看美女性在线毛片视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日韩精品青青久久久久久| 少妇的逼好多水| 禁无遮挡网站| 国产色爽女视频免费观看| 婷婷精品国产亚洲av| 少妇被粗大猛烈的视频| а√天堂www在线а√下载| 亚洲成a人片在线一区二区| 99久久精品一区二区三区| 国产极品精品免费视频能看的| 黄色女人牲交| 午夜福利视频1000在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 嫩草影视91久久| 变态另类丝袜制服| 好男人在线观看高清免费视频| 久久人妻av系列| 国产精品亚洲一级av第二区| 天堂动漫精品| 久99久视频精品免费| 成人美女网站在线观看视频| 91字幕亚洲| 床上黄色一级片| 1024手机看黄色片| 国产激情偷乱视频一区二区| h日本视频在线播放| 日韩精品青青久久久久久| 在线观看一区二区三区| 热99在线观看视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美在线一区亚洲| 欧美色视频一区免费| 美女高潮的动态| 国产综合懂色| 午夜日韩欧美国产| 又黄又爽又免费观看的视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩欧美国产一区二区入口| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产黄a三级三级三级人| 嫩草影院新地址| 精品熟女少妇八av免费久了| 成人永久免费在线观看视频| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲av一区综合| 国产v大片淫在线免费观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日本与韩国留学比较| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美黄色淫秽网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 午夜a级毛片| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日韩中文字幕欧美一区二区| a级毛片a级免费在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 黄片小视频在线播放| 桃红色精品国产亚洲av| 国产色爽女视频免费观看| 国内精品美女久久久久久| 天堂√8在线中文| 欧美日韩福利视频一区二区| 中文字幕高清在线视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲欧美精品综合久久99| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 18美女黄网站色大片免费观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 69av精品久久久久久| 欧美高清性xxxxhd video| .国产精品久久| 国产欧美日韩一区二区三| 99riav亚洲国产免费| 天堂网av新在线| 在线观看av片永久免费下载| 精品免费久久久久久久清纯| 日本三级黄在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美区成人在线视频| 97碰自拍视频| 国产av不卡久久| 性色av乱码一区二区三区2| 午夜福利视频1000在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 日韩有码中文字幕| 好男人在线观看高清免费视频| 99精品久久久久人妻精品| 能在线免费观看的黄片| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜福利视频1000在线观看| www.www免费av| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 麻豆国产97在线/欧美| 国产一区二区激情短视频| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 又黄又爽又免费观看的视频| 91字幕亚洲| 欧美午夜高清在线| 成年女人永久免费观看视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 在线看三级毛片| 午夜久久久久精精品| 色5月婷婷丁香| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品伦人一区二区| 身体一侧抽搐| 狠狠狠狠99中文字幕| 级片在线观看| 亚洲自拍偷在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩欧美 国产精品| 听说在线观看完整版免费高清| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美一区二区精品小视频在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 有码 亚洲区| 国产单亲对白刺激| 91久久精品电影网| 最近中文字幕高清免费大全6 | 波多野结衣巨乳人妻| 五月伊人婷婷丁香| 国产亚洲精品久久久com| 看片在线看免费视频| 亚洲自拍偷在线| 中国美女看黄片| av专区在线播放| 精华霜和精华液先用哪个| 午夜福利视频1000在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久精品国产清高在天天线| 51国产日韩欧美| 国产毛片a区久久久久| 日韩欧美三级三区| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美日韩综合久久久久久 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 麻豆一二三区av精品| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 简卡轻食公司| 国产精品国产高清国产av| 免费看a级黄色片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩国内少妇激情av| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲最大成人av| 欧美成狂野欧美在线观看| 高清在线国产一区| 动漫黄色视频在线观看| 天堂√8在线中文| 99riav亚洲国产免费| 欧美高清性xxxxhd video| 国产探花极品一区二区| 午夜a级毛片| 狠狠狠狠99中文字幕| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品电影一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲,欧美精品.| 色播亚洲综合网| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲欧美日韩东京热| 波多野结衣高清无吗| 亚洲18禁久久av| 在线观看午夜福利视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲国产精品合色在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 69人妻影院| 国产视频内射| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 美女免费视频网站| 亚洲成人久久爱视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 在现免费观看毛片| 久久国产精品影院| 欧美性感艳星| 美女被艹到高潮喷水动态| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 小说图片视频综合网站| 51午夜福利影视在线观看| 日本一本二区三区精品| 国产不卡一卡二| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲色图av天堂| 国产三级黄色录像| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产精品久久视频播放| 91狼人影院| 在线免费观看的www视频| 久久久国产成人精品二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美性感艳星| 国产在线男女| 免费高清视频大片| 99久久成人亚洲精品观看| 国产高潮美女av| 最近中文字幕高清免费大全6 | 久久久久久久久久成人| 久久中文看片网| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美又色又爽又黄视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品亚洲一级av第二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 成人精品一区二区免费| 精品午夜福利在线看| 久久草成人影院| av在线蜜桃| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久久久久久久中文| 久久中文看片网| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲国产色片| 亚洲精品在线美女| 男女视频在线观看网站免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美又色又爽又黄视频| 免费看美女性在线毛片视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久99热这里只有精品18| 亚洲最大成人手机在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产精品,欧美在线| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产欧美日韩精品亚洲av| bbb黄色大片| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 成人性生交大片免费视频hd| 国产伦精品一区二区三区四那| 男人舔奶头视频| 欧美性感艳星| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美区成人在线视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产精品永久免费网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 无人区码免费观看不卡| 日韩欧美 国产精品| 国产成人影院久久av| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 有码 亚洲区| 九色国产91popny在线| 男女下面进入的视频免费午夜| 免费在线观看亚洲国产| 男人舔奶头视频| 麻豆国产av国片精品| 国产精品1区2区在线观看.| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 18+在线观看网站| 男女床上黄色一级片免费看| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 能在线免费观看的黄片| 12—13女人毛片做爰片一| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产免费男女视频| 观看美女的网站| 久久久久久久久中文| 长腿黑丝高跟| 国产色婷婷99| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 成人美女网站在线观看视频| 五月玫瑰六月丁香| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩欧美在线乱码| 嫩草影院精品99| 看片在线看免费视频| 长腿黑丝高跟| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲内射少妇av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 69人妻影院| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 九九热线精品视视频播放| 日韩大尺度精品在线看网址| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲三级黄色毛片| 精品久久国产蜜桃| 午夜视频国产福利| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国内精品久久久久精免费| 亚洲激情在线av| 精品久久久久久成人av| 久久亚洲精品不卡| 别揉我奶头 嗯啊视频| 少妇丰满av| 特大巨黑吊av在线直播| avwww免费| 如何舔出高潮| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美+日韩+精品| 中文字幕熟女人妻在线| 色5月婷婷丁香| 嫩草影院精品99| 久久久久久久久中文| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 99热只有精品国产| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产一区二区在线av高清观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 男女床上黄色一级片免费看| 免费人成在线观看视频色| 十八禁网站免费在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 最近最新中文字幕大全电影3| 我的女老师完整版在线观看| 久久久精品大字幕| 亚洲av成人av| 成人欧美大片| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 97热精品久久久久久| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲,欧美,日韩| 一个人免费在线观看电影| 欧美+日韩+精品| 性色av乱码一区二区三区2| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 日本a在线网址| 国产精品不卡视频一区二区 | 黄色日韩在线| 俺也久久电影网| 在线天堂最新版资源| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产淫片久久久久久久久 | 午夜福利视频1000在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产av在哪里看| 国产真实乱freesex| 在线观看66精品国产| 窝窝影院91人妻| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日本 欧美在线| 国产综合懂色| 色哟哟哟哟哟哟| 嫩草影院精品99| 国产精品亚洲av一区麻豆| 变态另类丝袜制服| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人欧美在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美bdsm另类| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久精品国产亚洲av天美| 九九在线视频观看精品| 日韩欧美三级三区| 久久午夜亚洲精品久久| 九色国产91popny在线| 小说图片视频综合网站| 亚州av有码| 亚洲成av人片免费观看| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品精品国产色婷婷| 淫妇啪啪啪对白视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 性色avwww在线观看| 免费看光身美女| 欧美性猛交黑人性爽| 十八禁国产超污无遮挡网站| 黄色女人牲交| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美午夜高清在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 嫩草影院入口| 免费在线观看影片大全网站| 色视频www国产| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 九色国产91popny在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美日韩国产亚洲二区| 中亚洲国语对白在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 久9热在线精品视频| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲男人的天堂狠狠| 丰满人妻一区二区三区视频av| 99精品在免费线老司机午夜| 一个人免费在线观看电影| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲精品色激情综合| 精品国内亚洲2022精品成人| 超碰av人人做人人爽久久| 91狼人影院| 嫩草影院精品99| 日本三级黄在线观看| 男女那种视频在线观看| 美女大奶头视频| 久久99热6这里只有精品| 一进一出抽搐gif免费好疼| 老鸭窝网址在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 99热精品在线国产| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲中文字幕日韩| 99国产精品一区二区蜜桃av| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品一及| 日韩欧美在线二视频| 国产男靠女视频免费网站| 久9热在线精品视频| 国产老妇女一区| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲无线观看免费| 久久精品影院6| 精品一区二区三区av网在线观看| 少妇丰满av| 特大巨黑吊av在线直播| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 身体一侧抽搐| 亚洲五月天丁香| 国产精品不卡视频一区二区 | 国产亚洲欧美98| 日韩人妻高清精品专区| 真人一进一出gif抽搐免费| 女同久久另类99精品国产91| 69av精品久久久久久| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 乱码一卡2卡4卡精品| 99久久精品热视频| 日本黄色片子视频| av在线观看视频网站免费| 精品人妻熟女av久视频| 国产三级中文精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产精品影院久久| 国产视频内射| 丁香欧美五月| 国产精品久久电影中文字幕| 久久久成人免费电影| 老司机福利观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美激情在线99| 观看免费一级毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 婷婷精品国产亚洲av在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 麻豆一二三区av精品| 色综合亚洲欧美另类图片| bbb黄色大片| 又紧又爽又黄一区二区| 中文字幕熟女人妻在线| 一本精品99久久精品77| av中文乱码字幕在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲av.av天堂| 美女高潮的动态| 国产极品精品免费视频能看的| 最近中文字幕高清免费大全6 | 欧美性猛交黑人性爽| av黄色大香蕉| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产真实乱freesex| 日本熟妇午夜| 亚洲内射少妇av| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 嫩草影院新地址| 日本熟妇午夜| 成人午夜高清在线视频| 白带黄色成豆腐渣| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 在线观看免费视频日本深夜| 99riav亚洲国产免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品亚洲一级av第二区| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美区成人在线视频| 午夜免费激情av| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 又爽又黄a免费视频| 97超视频在线观看视频| 国产精品一区二区免费欧美| 国产成人福利小说| 国产精品人妻久久久久久| 淫秽高清视频在线观看| 小说图片视频综合网站| 美女高潮的动态| 亚洲18禁久久av| 免费看光身美女| 午夜精品久久久久久毛片777| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 嫩草影院入口| av中文乱码字幕在线| 九色国产91popny在线| 一个人免费在线观看电影| av在线蜜桃| 精品久久久久久成人av| a级毛片a级免费在线| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产欧美日韩一区二区三| 中文字幕av在线有码专区| 午夜老司机福利剧场| 无遮挡黄片免费观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 狠狠狠狠99中文字幕| 在线观看av片永久免费下载| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美性感艳星| 1000部很黄的大片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 午夜两性在线视频| 99久国产av精品| 成年女人永久免费观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品午夜福利在线看| 亚洲av五月六月丁香网| 国内精品久久久久久久电影| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 成人国产综合亚洲| 很黄的视频免费| 精品午夜福利在线看| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 午夜福利在线在线| 如何舔出高潮| 高清日韩中文字幕在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品久久视频播放| 色哟哟哟哟哟哟| 精品无人区乱码1区二区| 日韩中字成人| 日本一本二区三区精品| 有码 亚洲区| 日韩国内少妇激情av| 桃红色精品国产亚洲av| 91字幕亚洲|