培元抗癌湯通過調(diào)節(jié)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞抑制H22肝癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的實驗研究*

司海龍 張 潔 馬一鳴 馬仰仰 肖海娟 方 瑜 王惠玲

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 (陜西 咸陽， 712000)

中醫(yī)藥治療惡性腫瘤由來已久，臨床療效肯定，既能增強(qiáng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療效果、緩解治療過程中的副反應(yīng)，又能明顯改善患者生存質(zhì)量、延長生存期。近來大量的研究又證明中醫(yī)藥能通過干預(yù)腫瘤微環(huán)境(TME)抑制惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。陜西省名中醫(yī)、中醫(yī)腫瘤內(nèi)科名家李仁廷教授依據(jù)多年臨床經(jīng)驗組方培元抗癌湯，前期的研究證實該方在動物實驗上能夠抑制H22肝癌細(xì)胞，下調(diào)端粒酶水平[1]；在臨床實驗方面培元抗癌湯聯(lián)合 FOLFOX4化療方案對于中晚期肝癌患者療效明確[2]。本研究是在前期的研究基礎(chǔ)之上，觀察中藥培元抗癌湯對肝癌微環(huán)境中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而對H22肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物和細(xì)胞株 H22肝癌細(xì)胞株(陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供)；CAFs原代細(xì)胞分離、培養(yǎng)并鑒定；雄性昆明小鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK(陜 2017-003)。

1.1.2 藥物及試劑 培元抗癌湯藥物組成：西洋參、黃芪、炒白術(shù)、莪術(shù)、白花蛇舌草、茯苓各15 g，郁金、厚樸、法半夏、焦山楂各12 g，購于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，經(jīng)過醇沉[3]提取，配制成培養(yǎng)抗癌提取物PYAC(200 mg/ml)；濃縮型正常山羊血清(封閉)、熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；Triton X-100、DAPI購自碧云天公司；α-SMA購自Abcam公司；Vimentin購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Mouse GRO α/CXCL1 ELISA Kit、Mouse GROβ/CXCL2 ELISA Kit購自Elabscience公司；HiScript Reverse Transcriptase(RNase H)購自VAZYME公司，SYBR Green Master Mix購自VAZYME公司；引物由天一輝遠(yuǎn)公司合成；GAPDH兔多抗購自杭州賢至生物有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)兔多抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；MMP-9鼠單抗購自Abcam公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；CCK8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自MCE公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物。

1.2 實驗儀器 生物顯微鏡(奧林巴斯，BX53型)全自動酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，Thermo scientific)；實時熒光定量PCR儀(ABI，QuantStudio 6)；微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)；Aquapro超級純水儀(艾科浦，AJY-0501)；PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，EDC-810)；垂直電泳槽(北京六一儀器廠，DYCZ-24DN)；電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠，DYCZ-40)；流式細(xì)胞儀(Beckmancoulter，cytoFLEX)；水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，TS-1)。

1.3 實驗方法

1.3.1 H22荷瘤小鼠模型制備 在無菌環(huán)境下，將鼠源性肝癌細(xì)胞株H22注入BALB/c小鼠腹腔內(nèi),荷瘤小鼠腹水異常增加時,處死小鼠并小心無菌收集腹水，用0.9%氯化鈉洗3次，再用0.9%氯化鈉溶液調(diào)整為1×106/ml濃度癌細(xì)胞懸液,通過臺盼藍(lán)染色證實H22細(xì)胞存活率>95%，5只健康小鼠腋下接種瘤細(xì)胞懸液進(jìn)行造模，腋下有瘤體為造模成功。

1.3.2 小鼠CAFs細(xì)胞的分離培養(yǎng) 無菌條件下分離腫瘤組織，在與正常組織交界處漿膜面盡量多取包括上皮組織及其結(jié)締組織質(zhì)軟組織，無菌 PBS液洗凈；去除多余的上皮、腫瘤、脂肪組織后，將結(jié)締組織剪碎放入培養(yǎng)瓶中，加入膠原酶在培養(yǎng)箱內(nèi)消化，鏡下觀察出現(xiàn)大量細(xì)胞時終止消化；將單細(xì)胞懸液注入培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基后置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代；用第三代傳代細(xì)胞做CAFs鑒定。

1.3.3 CAFs鑒定 復(fù)蘇CAFs細(xì)胞并消化傳代，調(diào)整CAFs細(xì)胞濃度1.0×105/ml，每孔400 μl注入24孔板，孔底鋪有細(xì)胞爬片，收集細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，檢測Vimentin、α-SMA表達(dá)，雙陽性表達(dá)的細(xì)胞可鑒定為CAFs。在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min； 0.5% Triton X-100室溫通透20 min；PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗、并放入濕盒，4℃孵育過夜；加熒光二抗：PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中室溫孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min；加熒光二抗后，所有操作步驟在較暗處進(jìn)行。復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5 min染核，PBST浸洗4次、每次5 min；吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.4 CCK8法檢測培元抗癌湯對H22細(xì)胞的增殖抑制作用 復(fù)蘇CAFs細(xì)胞并消化傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度5.0×104/ml，每孔200 μl注入6孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。分組：模型組、中藥組，中藥組細(xì)胞加入PYAC干預(yù)48 h后，換用無血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清，1 000 rpm離心10 min 以去除細(xì)胞及碎屑，保存?zhèn)溆?。?fù)蘇、消化、傳代H22細(xì)胞，取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的H22細(xì)胞，以5×103個/孔，密度接種于96孔板，分別將模型組、中藥組CAFs細(xì)胞上清加入對應(yīng)組別的H22細(xì)胞，每孔20 μl，培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μl CCK8試劑，37℃培養(yǎng)4 h；酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光值。

1.3.5 流式細(xì)胞學(xué)檢測培元抗癌湯對H22細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用 取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的上述H22細(xì)胞，以2×105個/孔密度接種于6孔板，37℃培養(yǎng)過夜；分別將模型組、中藥組CAFs細(xì)胞上清加入對應(yīng)組別的H22細(xì)胞培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，用PBS將細(xì)胞潤洗2次，1 500 rpm離心5 min，按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明進(jìn)行標(biāo)記。加入500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl AnnexinV-FITC混勻后加入5 μl PI混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min(同時設(shè)陰性對照，即正常細(xì)胞不加Annexin和PI；以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照1，只加5 μl AnnexinV；以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照2，只加5 μl PI)，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.6 ELISA法檢測CAFs細(xì)胞上清中CXCL1、CXCL2含量 復(fù)蘇CAFs細(xì)胞并消化傳代，分為模型組、中藥組,每組3個復(fù)孔，藥物干預(yù)方法同上。按試劑盒說明書分別檢測細(xì)胞上清中CXCL1、CXCL2的含量。

1.3.7 PCR檢測CAFs細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá) 復(fù)蘇CAFs細(xì)胞并消化傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度5.0×104/ml，每孔200 μl注入6孔板，分為模型組、中藥組，每組3個復(fù)孔。藥物干預(yù)方法同上，48 h后吸掉培養(yǎng)上清，每孔加入1 ml 4℃預(yù)冷的PBS沿著細(xì)胞板壁緩慢加入，平放輕輕搖動，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作2次，加入1 ml Trizol提取RNA并測定總RNA純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：25℃ 5 min，50℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 10 min。實時熒光定量PCR檢測MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)，反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

表1 引物序列表

1.3.8 Western Blot檢測CAFs細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白質(zhì)表達(dá) 復(fù)蘇CAFs細(xì)胞并消化傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度5.0×104個/ml，200 μl/注入6孔板，分為模型組、中藥組，每組3個復(fù)孔。藥物干預(yù)48 h后，吸掉培養(yǎng)上清，PBS洗3次以洗去培養(yǎng)液。每孔加入1 ml裂解液(含10 μl 100 mM PMSF)，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于一側(cè)，然后將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中，離心取上清測定蛋白濃度。蛋白變性后電泳轉(zhuǎn)膜，封閉后加一抗、二抗，顯色曝光，用BandScan軟件分析膠片灰度值。

2 結(jié)果

2.1 CAFs鑒定結(jié)果 細(xì)胞爬片免疫熒光單標(biāo)鑒定的結(jié)果顯示Vimentin、α-SMA表達(dá)陽性，提示CAFs分離培養(yǎng)成功。見圖1。

2.2 培元抗癌湯對H22細(xì)胞的增殖抑制作用 與模型組相比，中藥組H22細(xì)胞的增殖被顯著抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(0.95±0.04vs0.99±0.02，P<0.05)。

2.3 培元抗癌湯誘導(dǎo)H22細(xì)胞的凋亡 與模型組，相比中藥組H22細(xì)胞凋亡增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(4.08±0.53vs0.97±0.10，P<0.05)。見圖2。

2.4 培元抗癌湯對CAFs細(xì)胞上清中CXCL1與CXCL2含量的影響 見表2。

表2 2組CAFs細(xì)胞上清CXCL1、CXCL2含量比較

2.5 培元抗癌湯地CAFs細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 見表3。

表3 2組CAFs細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量比較

2.6 培元抗癌湯對CAFs細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響 見表4，圖3。

表4 2組CAFs細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

近年來惡性腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床治療取得了長足的進(jìn)步，大量的靶向藥物、免疫治療藥物被開發(fā)出來應(yīng)用于臨床，患者的生存期和生活質(zhì)量有了很大改善。這些新的藥物和療法的進(jìn)步是基于對惡性腫瘤更深入的認(rèn)識。傳統(tǒng)的理論主要集中于腫瘤細(xì)胞這種“新生物”本身，研究的重點是篩選針對腫瘤細(xì)胞本身的治療方式、藥物，于是手術(shù)、放療、化療成了惡性腫瘤的主要治療方式。但是這些方法已經(jīng)遇到了瓶頸，臨床療效無法明顯提高，手術(shù)范圍不能再擴(kuò)大，放療劑量不能再增加，化療周期不能再增加，局部介入療效、適應(yīng)癥有限。新的理論研究不是只關(guān)注腫瘤本身，而且關(guān)注促進(jìn)其生長、轉(zhuǎn)移的細(xì)胞以及非細(xì)胞成分，這就是TME的概念[4-6]?，F(xiàn)在認(rèn)為TME是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)展的基礎(chǔ)，這些細(xì)胞以及非細(xì)胞成分相當(dāng)復(fù)雜且有獨特的缺氧、高酸的理化環(huán)境[7]。實際上人類對TME中紛繁復(fù)雜成分及其相互作用關(guān)系認(rèn)識有限，但仍是當(dāng)前全世界研究的熱點和前沿。目前文獻(xiàn)研究較多的是：M1和M2巨噬細(xì)胞，CAFs，腫瘤干細(xì)胞(CSC)，髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)，趨化因子(Chemokines)，整合素家族(Integrins)等[8,9]。

隨著惡性腫瘤在我國發(fā)病率逐年的增高，使用中醫(yī)藥治療的人數(shù)也越來越多，由于可靠、可見的臨床療效，受到患者普遍的歡迎。但直到目前為止，其干預(yù)惡性腫瘤機(jī)制，生物學(xué)、藥理學(xué)實質(zhì)仍不清楚，其科學(xué)內(nèi)涵仍需要深入研究。中醫(yī)學(xué)中并無惡性腫瘤的病名，結(jié)合其臨床表現(xiàn)、病因病機(jī)應(yīng)當(dāng)屬于中醫(yī)學(xué)中“癥瘕、積聚、巖、瘤、”等范疇。目前認(rèn)為從中醫(yī)學(xué)角度認(rèn)為癌之成因責(zé)之于虛實兩端，實多為痰凝、氣滯、血瘀、熱毒[10]，虛多為氣血、精液、陰陽、臟腑的不足，如《外證匯編》指出“正氣虛則成巖”?！夺t(yī)宗必讀.積聚》：“初者，病邪初起，正氣尚強(qiáng)，邪氣尚淺，則任受攻；中者，受病漸久，邪氣較深，正氣較弱，任受且攻且補(bǔ)；末者，病魔經(jīng)久，邪氣侵凌，正氣消殘，則任受補(bǔ)?！敝赋鰫盒阅[瘤的治療重點在于扶正祛邪，也是治療的大法。培元抗癌湯為李仁廷教授根據(jù)多年治療惡性腫瘤臨床經(jīng)驗所創(chuàng)制，該方既有扶正的西洋參、黃芪、炒白術(shù)、茯苓等藥物，又有祛邪的莪術(shù)、白花蛇舌草、郁金、厚樸等藥物，全方益氣養(yǎng)陰、培補(bǔ)元氣，理氣活血、清熱解毒，祛邪以抗腫瘤。

隨著關(guān)于TME研究的積累，人類對于TME的認(rèn)識不斷深入，特別是TME與惡性腫瘤細(xì)胞之間關(guān)系。CAFs是TME最重要的細(xì)胞成分之一，或者說關(guān)鍵成分之一[11,12]。大量研究證明TME中蘊(yùn)含有大量的CAFs，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移[13,14]。Huang等[15]研究證明在肝細(xì)胞癌中CAFs通過血管內(nèi)皮生長因子調(diào)節(jié)的EZH2/VASH1信號通路促進(jìn)腫瘤血管增生，并促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展。Ma等[16]利用熒光原位雜交(FISH)和qPCR評估了CAFs、腫瘤組織和非腫瘤細(xì)胞的端粒長度，提出CAFs中端?？s短與生存率降低和復(fù)發(fā)率增加相關(guān)，被認(rèn)為是HCC患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子。這些發(fā)現(xiàn)在腫瘤基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫的371例肝細(xì)胞癌患者中得到了證實。Kubo等[17]總結(jié)了CAFs在肝細(xì)胞癌中免疫抑制、血管生成、治療靶點和化療耐藥等方面的作用。本研究利用原代細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)分離出CAFs，并進(jìn)行了鑒定，Vimentin、α-SMA表達(dá)陽性提示分離培養(yǎng)成功，進(jìn)而采用CAFs培養(yǎng)上清干預(yù)H22細(xì)胞，體外模擬腫瘤微環(huán)境。

CAFs會釋放大量的趨化因子，如CXCL1和CXCL2，趨化因子的主要作用是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生、侵襲和轉(zhuǎn)移。Shi等[18]首次報道了CXCL1和CXCL2能促進(jìn)骨髓細(xì)胞向MDSC分化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和發(fā)展。Miyake等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL1單克隆抗體(HL2401)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管化。本課題實驗結(jié)果與以上文獻(xiàn)結(jié)果一致，經(jīng)過培元抗癌湯干預(yù)后，中藥組CAFs細(xì)胞的CXCL1、 CXCL2表達(dá)較模型組明顯下降(P<0.05)，提示中藥培元抗癌湯可以抑制CAFs分泌CXCL1和CXCL2，進(jìn)而抑制H22細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。Song等[20]發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌中減少miR-532-5p表達(dá)可以通過靶向CXCL2抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。CAFs還可通過誘導(dǎo)和產(chǎn)生MMP促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Bourboulia等[21]總結(jié)分析了MMP的作用，指出MMP-2、MMP-9可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。結(jié)合本實驗的結(jié)果，CAFs細(xì)胞中 MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)一致，經(jīng)過藥物干預(yù)后中藥組CAFs細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)較模型組明顯下降，進(jìn)一步提示中藥培元抗癌湯可以抑制CAFs分泌MMP-2、MMP-9，進(jìn)而抑制H22細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。本研究結(jié)果顯示，培元抗癌湯干預(yù)可抑制H22細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡，原因可能是調(diào)節(jié)CAFs及其分泌的細(xì)胞因子MMP-2/MMP-9與CXCL1/CXCL2。

綜上所述，培元抗癌湯可通過調(diào)節(jié)CAFs抑制其MMP-2/MMP-9與CXCL1/CXCL2表達(dá)，抑制腫瘤生長、發(fā)展，這一結(jié)論與本課題前期研究結(jié)果一致[22，23]。