紅外尿素氮測(cè)定儀的校準(zhǔn)及牧場(chǎng)應(yīng)用數(shù)據(jù)分析

高星，叢慧敏，張雪林，水明

（北京奶牛中心，奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶牛遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192）

測(cè)定原料乳中的尿素氮（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為MUN）不僅可以監(jiān)測(cè)奶牛日糧能氮平衡、蛋白質(zhì)需要量和氮利用率，還可以作為提高奶牛繁殖性能的指標(biāo)，加快奶牛遺傳育種進(jìn)展，因此MUN的測(cè)定對(duì)奶牛養(yǎng)殖具有重要意義。目前MUN的測(cè)定方法主要有酶法和化學(xué)法、紅外光譜法[1,2]。酶法是一種間接測(cè)定方法，其測(cè)定原理主要是通過(guò)采用酶處理原料乳后產(chǎn)生的氨的變化來(lái)計(jì)算MUN值。即利用尿素酶將尿素分解成氨和二氧化碳，之后加入染色液和激活液形成綠色的絡(luò)合物，其絡(luò)合物顏色的強(qiáng)度與氨的濃度即MUN的濃度成比例。此法雖然操作繁瑣，但是測(cè)定準(zhǔn)確，靈敏度較高?；瘜W(xué)法是通過(guò)加入特定化學(xué)試劑與尿素反應(yīng)生成有色物質(zhì)，然后通過(guò)比色法測(cè)定，是一種直接測(cè)定方法。紅外光譜法是在通過(guò)尿素在某一區(qū)域出現(xiàn)官能團(tuán)的特征吸收峰進(jìn)行測(cè)定，其操作簡(jiǎn)單，雖然使用的分析儀器價(jià)格高，但適合快速分析，是國(guó)內(nèi)外進(jìn)行奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定（DHI）時(shí)普遍采用的方法。這種物理方法檢測(cè)靈敏度低，易受干擾，所以準(zhǔn)確性不高，因此需要利用酶法或者化學(xué)法的測(cè)定值定期對(duì)紅外光譜儀MUN測(cè)定值進(jìn)行校準(zhǔn)。本研究建立了一種對(duì)紅外光譜法快速測(cè)定尿素氮儀器（以下簡(jiǎn)稱(chēng)紅外尿素氮測(cè)定儀）進(jìn)行校準(zhǔn)的方法，并對(duì)校準(zhǔn)后的儀器在牧場(chǎng)的大量測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行了應(yīng)用分析。

1 校準(zhǔn)方法

酶法因?yàn)榭紤]了原料乳中氨的空白影響，因此更適合作為紅外尿素氮測(cè)定儀的校準(zhǔn)方法。本研究通過(guò)對(duì)生乳進(jìn)行稀釋和添加尿素的方法得到一個(gè)合理的線性濃度范圍，先用酶法進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定，得到一系列MUN校準(zhǔn)值，再對(duì)紅外尿素氮測(cè)定儀進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.1 原料乳的選擇

選擇脂肪含量在5%以下的新鮮原料乳3kg左右進(jìn)行稀釋或添加尿素。原料乳的MUN值在10mg/dL左右。

1.2 尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱(chēng)取尿素1g左右，加水定容到100mL。計(jì)算MUN值的濃度為5.0mg/mL左右（尿素中氮元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.62%）。

1.3 MUN校準(zhǔn)系列溶液的配制

分別移取尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL至250mL容量瓶中，用選定的原料乳定容至刻度。在另外兩個(gè)250mL容量瓶中分別加入50mL水和80mL水，再用選定的原料乳定容至刻度，使得校準(zhǔn)系列溶液濃度范圍在6～26mg/dL。這是根據(jù)原料乳中的MUN常見(jiàn)范圍以及美國(guó)、加拿大、歐洲和我國(guó)的參考標(biāo)準(zhǔn)確定的[3]。另外要注意使用酶法定值時(shí)不要加入任何防腐劑，避免因?yàn)榉栏瘎?lái)的顏色影響定值準(zhǔn)確性，因?yàn)樵摲▽?shí)際是一種比色法。用酶法平行測(cè)定以上校準(zhǔn)系列溶液得到的校準(zhǔn)平均值見(jiàn)表1。

表1 校準(zhǔn)系列溶液MUN值 單位：mg/dL

1.4 對(duì)紅外尿素氮測(cè)定儀進(jìn)行校準(zhǔn)

先使用紅外尿素氮測(cè)定儀對(duì)1.3中的MUN校準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定前根據(jù)防腐劑在奶樣中的比例加入到校準(zhǔn)系列溶液中，主要是考慮與樣品測(cè)定時(shí)的背景保持一致。因?yàn)閺哪翀?chǎng)采集的原料乳中通常是需要加入防腐劑的，以防止腐敗。然后再根據(jù)紅外尿素氮測(cè)定儀的校準(zhǔn)軟件程序?qū)?.3中的系列校準(zhǔn)值輸入儀器，進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)結(jié)果如下：線性方程Y=0.9169X+0.6512，相關(guān)系數(shù)R2=0.9864。校準(zhǔn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 MUN校準(zhǔn)曲線圖

1.5 校準(zhǔn)結(jié)果分析

依據(jù)線性方程和相關(guān)系數(shù)，可以看出當(dāng)MUN濃度范圍在6～26mg/dL時(shí)呈線性關(guān)系。MUN是DHI的重要指標(biāo)之一，所以為了保證該數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，一定要定期開(kāi)展對(duì)紅外尿素氮測(cè)定儀的校準(zhǔn)工作。建議每1～3個(gè)月校準(zhǔn)一次。

2 應(yīng)用紅外尿素氮測(cè)定儀對(duì)牧場(chǎng)MUN測(cè)定數(shù)據(jù)的分析

北京奶牛中心生產(chǎn)性能測(cè)定實(shí)驗(yàn)室使用經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)后的紅外尿素氮測(cè)定儀對(duì)首農(nóng)畜牧旗下管理的牧場(chǎng)和自有牧場(chǎng)測(cè)定的MUN數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析。

2.1 季節(jié)因素對(duì)MUN值的影響

本研究對(duì)2021年全年的MUN數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 2021年MUN數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表 單位：mg/dL

MUN的群體平均意義大于個(gè)體值。根據(jù)國(guó)外的標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)將MUN值標(biāo)準(zhǔn)含量范圍設(shè)定在10～14mg/dL；加拿大將MUN值標(biāo)準(zhǔn)含量范圍設(shè)定在8～14mg/dL；歐洲將MUN標(biāo)準(zhǔn)含量范圍設(shè)定在15～30mg/dL。由于我國(guó)在粗飼料質(zhì)量方面與國(guó)外有一定差距，導(dǎo)致能氮不平衡，氮利用率低，使得MUN可能偏高，目前參考標(biāo)準(zhǔn)是10～18mg/dL。結(jié)合圖表中全年的數(shù)據(jù)可以看出，基本都在正常范圍內(nèi)，只是夏季6月份和7月份的MUN值會(huì)偏低一些。作為反映日糧蛋白質(zhì)供需平衡和日糧能氮平衡的指標(biāo)，低MUN表示低的總蛋白吸收。如果是因?yàn)閭€(gè)別牧場(chǎng)日糧蛋白質(zhì)不足，應(yīng)該不會(huì)導(dǎo)致全部牧場(chǎng)的MUN值偏低，而且是6月份和7月份連續(xù)兩個(gè)月都比較低。這可能是因?yàn)橄募靖邷貙?dǎo)致奶牛群體體內(nèi)消化酶活性降低，使蛋白質(zhì)攝入量降低；而冬季牛群為抵抗低溫需要消耗更多能量，從而使蛋白質(zhì)攝入量增加，氨量也增加[4]。

圖2 牧場(chǎng)MUN值變化趨勢(shì)圖

2.2 原料乳中脂肪含量對(duì)紅外法MUN測(cè)定值的影響

根據(jù)《NY/T2659-2014牛乳脂肪、蛋白、乳糖、總固體的快速測(cè)定 紅外光譜法》對(duì)一些原料乳進(jìn)行測(cè)定之后，根據(jù)數(shù)據(jù)選取不同乳脂率的原料奶，再使用酶法測(cè)定MUN值，與紅外法MUN測(cè)定值進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 紅外法和酶法測(cè)定MUN的結(jié)果對(duì)比

對(duì)兩種方法MUN測(cè)定差值進(jìn)行對(duì)比研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)差值與乳脂率呈正相關(guān)性（圖3）?？梢钥闯觯S著乳脂率的升高，紅外法MUN測(cè)定值越來(lái)越偏高。實(shí)際上當(dāng)原料乳中脂肪含量大于5%以后，紅外法和酶法的測(cè)定值就存在不小的差距了，之后隨著乳脂率的升高，兩種方法的測(cè)定差值越來(lái)越大，在乳脂率為5%～14%范圍內(nèi)二者呈正相關(guān)。這可能是由于脂肪球的存在影響了MUN官能團(tuán)的紅外特征吸收峰，使得測(cè)定值偏高。相對(duì)于脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖而言，MUN在原料乳中的含量很低，至少與前者相差100多倍，所以很容易受到這些含量高的大分子物質(zhì)的干擾。但鑒于乳脂率大于5%的情況并不多見(jiàn)，所以在進(jìn)行奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定（DHI）時(shí)使用紅外光譜法測(cè)定個(gè)體牛的MUN還是有一定準(zhǔn)確度的。由于本試驗(yàn)中原料乳蛋白質(zhì)和乳糖的含量通常都在正常范圍內(nèi)（2.0%～4.5%和4.0%～6.0%）起伏變動(dòng)，可以認(rèn)為具有相似的背景，避免了上述營(yíng)養(yǎng)成分帶來(lái)的背景差異。但同時(shí)本試驗(yàn)結(jié)果也無(wú)法證明過(guò)高的蛋白質(zhì)和乳糖含量是否會(huì)對(duì)紅外法MUN測(cè)定值有影響，因?yàn)楹苌僖?jiàn)到蛋白質(zhì)和乳糖含量異常的樣品，而脂肪由于采樣不規(guī)范或者其他因素會(huì)導(dǎo)致一些超出正常區(qū)間范圍（2.5%～5.0%）樣品的出現(xiàn)。

圖3 乳脂率與兩種測(cè)定方法差值的關(guān)系圖

從本試驗(yàn)中也可以看出，用酶法測(cè)定MUN不受原料乳中脂肪含量的影響。黃文明[5]對(duì)化學(xué)法測(cè)定MUN的研究也表明，前處理過(guò)程脫脂與否不影響MUN的測(cè)定結(jié)果。另外Godden[6]、Jonker[7]等從奶牛的飼養(yǎng)環(huán)境和生產(chǎn)代謝方面進(jìn)行的研究結(jié)果各不相同，有試驗(yàn)認(rèn)為MUN值隨乳脂率升高而降低，呈非線性負(fù)相關(guān)；也有試驗(yàn)認(rèn)為沒(méi)有強(qiáng)的相關(guān)性。但這些研究結(jié)果與本文的研究?jī)?nèi)容與結(jié)果不相沖突。本文是從兩種不同測(cè)定方法的角度分析和討論了乳脂率對(duì)MUN測(cè)定值的影響。

3 結(jié)論

通過(guò)應(yīng)用紅外尿素氮測(cè)定儀對(duì)牧場(chǎng)MUN測(cè)定數(shù)據(jù)分析，證明依據(jù)應(yīng)用本文建立的校準(zhǔn)方法定期對(duì)紅外尿素氮測(cè)定儀進(jìn)行校準(zhǔn)，紅外法可以用于反映牧場(chǎng)的日糧蛋白質(zhì)水平、氮排泄量狀況等信息。但應(yīng)考慮季節(jié)因素以及個(gè)體牛的奶樣中乳脂率大于5%時(shí)對(duì)紅外法尿素氮測(cè)定值的影響。