生物信息學方法下糖尿病微血管并發(fā)癥關鍵基因與通路篩選及中藥預測研究

榮 旺，朱占蘭，宋亞一

1南京中醫(yī)藥大學附屬連云港醫(yī)院，連云港 222000；2南京醫(yī)科大學康達學院附屬連云港市立東方醫(yī)院，連云港 222042；3連云港市婦幼保健院，連云港 222000

近年來，糖尿病的相關流行病學調查研究顯示，全中國十八周歲以上人群高血糖發(fā)生率已經達到11.2%[1]，糖尿病的發(fā)生率呈持續(xù)上升趨勢。糖尿病是一種復雜的血糖代謝紊亂性疾病，到病程一定階段，可出現(xiàn)多種慢性高血糖的急慢性并發(fā)癥，以微血管及大血管相關并發(fā)癥最為常見。慢性高血糖和遺傳易感性最終會影響微血管，導致主要來自腎臟、眼睛和神經系統(tǒng)的并發(fā)癥[2]。經典的糖尿病微血管并發(fā)癥包括糖尿病腎病(DKD)、糖尿病性視網膜病變(DR)和糖尿病神經病變(DPN)[3]。DKD是僅次于各種腎小球腎炎的終末期腎病(ESRD)的主要病因，DR是影響視力甚至致盲的常見因素，DPN是造成足部潰瘍和進一步截肢的重要高危因素。這三種微血管并發(fā)癥嚴重影響糖尿病患者的健康，給患者及社會造成嚴重的經濟負擔。然而，關于糖尿病微血管并發(fā)癥具體的發(fā)病機制，現(xiàn)代醫(yī)學還不完全了解，以單純的西藥治療機制復雜的糖尿病微血管并發(fā)癥難以獲得良好的效果。中醫(yī)藥源遠流長，臨床療效經過長久的時間驗證，尤其在治療部分慢性病癥方面優(yōu)勢明顯。中醫(yī)講究整體觀念，天人合一，臨床施治強調辨證論治，中藥相對于單一成分的西藥，可以針對人體疾病的復雜多變的情況，通過多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點的整合調節(jié)起到治療作用，但缺少系統(tǒng)的機制闡述。因此需要進一步對糖尿病微血管并發(fā)癥研究，以期獲得疾病發(fā)展和進展相關的病理生理機制，挖掘潛在的中藥治療藥物。

隨著生物信息學的快速發(fā)展，有效利用目前豐富的基因表達芯片和高通量測序數(shù)據(jù)，對臨床樣本進行大數(shù)據(jù)挖掘分析，有助于疾病致病機理的探究，為臨床提供更多的參考。本研究利用高通量測序，從GEO數(shù)據(jù)庫下載關于糖尿病微血管并發(fā)癥的基因表達譜芯片的數(shù)據(jù)進行分析，篩選出長期血糖控制不佳伴有嚴重微血管并發(fā)癥與長期血糖控制不佳不伴有微血管并發(fā)癥之間的DEGs，對DEGs進行功能和通路富集分析以及分析蛋白質間的互作關系，進一步篩選出參與糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)病機制的關鍵靶分子及潛在中藥，為臨床診治及預防提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)

GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，是目前基因表達數(shù)據(jù)最大、最全面的公共資源，廣泛應用于科研的各個領域。使用關鍵詞“microvascular complications of diabetes mellitus”進行搜索，下載GSE43950數(shù)據(jù)集。GSE43950數(shù)據(jù)集位于GPL10379平臺(Rosetta/Merck Human RSTA Custom Affymetrix 2.0 microarray[HuRSTA-2a520709])，表達譜芯片類型為expression profiling by array，種屬為Homo sapiens。GSE43950數(shù)據(jù)集共包含14個樣本，篩選出長期血糖控制不佳并伴嚴重微血管并發(fā)癥的糖尿病患者5例，4例長期血糖控制不佳不伴有微血管并發(fā)癥的對照組樣本。

1.2 DEGs的獲取

GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是GEO數(shù)據(jù)庫的在線分析工具，用來進行DEGs的分析。GEO2R基于R程序語言，利用R語言中兩個程序包，即GEOquery和limma，應用t檢驗來篩選DEGs，并利用R語言對篩選結果進行可視化。本研究以P值(P-value)<0.05，|log2 fold change(log2 FC)|≥1.5作為DEGs篩選的標準。

1.3 DEGs的功能和富集分析

用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對篩選出來的DEGs進行基因本體論(GO)功能注釋和通路富集(KEGG)進行在線分析。包括基因產物的功能、參與的生物過程以及相關的代謝通路。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 DEGs的蛋白相互作用網絡分析及獲取關鍵基因

STRING數(shù)據(jù)庫用于蛋白互作(PPI)分析，有助于關鍵基因的挖掘。通過STRING 11.5對DEGs進行蛋白互作網絡分析，利用Cytoscape 3.9.0軟件(https://cytoscape.org/)及插件cytoHubba挖掘關鍵基因(hub genes)。

1.5 關鍵靶點對接及潛在中藥的預測

Coremine medical(http://www.coremine.com/medical/)是我國與挪威、美國等多個機構共同研發(fā)的，可篩選潛在藥物，并構建藥物活性成分及網絡作用靶點的醫(yī)學信息檢索平臺[4]。將糖尿病性微血管并發(fā)癥的hub genes輸入coremine medical進行搜索，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義進行中藥篩選，篩選出hub genes相關的中藥。依據(jù)出現(xiàn)頻次篩選出頻次最高的4味中藥，通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫(TCMSP)搜索中藥的蛋白質成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18篩選有效蛋白質成分，同時通過檢閱文獻補充中藥的有效蛋白質成分，通過UniProt網站匹配出蛋白質成分對應的gene symbol，剔除無法匹配的蛋白質成分，將得到的數(shù)據(jù)整理后導入Cytoscape 3.9.0軟件中，構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖，利用插件cytoHubba可視化，基于degree值選取Top 20靶點。

2 結果

2.1 DEGs的篩選結果

應用GEO2R對數(shù)據(jù)集GSE43950進行分析處理，在GSE43950中獲得692個DEGs，包括121個上調基因和571個下調基因。芯片數(shù)據(jù)中的兩組DEGs用火山圖及熱圖顯示(見圖1)。

圖1 差異表達基因

2.2 DEGs的GO功能和KEGG通路富集分析

利用數(shù)據(jù)庫DAVID對DEGs進行GO功能和KEGG信號通路富集分析。上調的DEGs的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析結果顯示(見圖2A)：在生物過程(biological process，BP)中，上調DEGs主要富集于血液凝固、止血的調節(jié)。在細胞組分(cellular component，CC)中，上調DEGs具有高富集度的GO術語主要與“脂膜”“膜區(qū)”“轉錄因子復合物”相關。在分子功能(molecular function，MF)中，上調DEGs具有高富集度的GO術語主要與核心啟動子序列特異性DNA結合相關。在KEGG中，上調DEGs主要富集于MAPK信號通路、NF-κB信號通路等信號通路、糖尿病微血管并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路。下調的DEGs的GO功能富集分析及KEGG通路富集分析結果顯示(見圖2B)：在BP中，下調DEGs則主要富集于中性粒細胞活化免疫應答、toll樣受體信號通路相關。在CC中，下調DEGs的GO術語主要與“分泌顆粒膜”“溶酶體膜”和“溶解液泡膜”相關。在MF中，下調DEGs具有高富集度的GO術語主要與“模式識別受體活性”“信號模式識別受體活性”和“Toll樣受體結合”相關。在KEGG中，下調DEGs則主要富集于Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、內吞作用等信號通路。

圖2 上調及下調差異基因的生物學功能

2.3 DEGs的PPI分析以及hub基因的獲取

利用STRING數(shù)據(jù)庫對DEGs進行蛋白互作分析，并將DEGs數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.0軟件中，利用插件cytoHubba的MCC算法獲得Top10 hub基因并可視化(見圖3)，其中顏色的深淺代表MCC評分的高低程度，顏色越深代表越重要。Top10 hub基因分別是CD4、IL1B、TLR4、TLR2、ITGAM、CD86、CSF1R、TLR8、CYBB、TLR1。

圖3 10個關鍵基因

2.4 潛在中藥篩選結果

在coremine medical中經過篩選發(fā)現(xiàn)，得出作用于糖尿病微血管病變hub基因的頻次最高的4味中藥分別是黃芩、丹參、川牛膝和郁金(以下分別以HQ、DS、CNX、YJ字母簡稱代替)，四味中藥是多個關鍵基因映射的藥物，四味中藥中的相關成分可能是治療疾病的潛在來源。故篩選上述4味中藥，通過TCMSP網站搜索中藥的蛋白質成分，以OB≥30%，DL≥0.18篩選有效蛋白質成分，同時通過檢閱文獻補充中藥的有效蛋白質成分，通過UniProt網站匹配出蛋白質成分對應的gene symbol，剔除無法匹配的蛋白質成分，得到黃芩有效成分32個，丹參有效成分58個，川牛膝有效成分4個，郁金有效成分3個，郁金和黃芩共同活性成分1個，川牛膝、郁金和黃芩共同活性成分1個，具體見表1，將得到的數(shù)據(jù)整理后導入Cytoscape 3.9.0軟件中繪制“藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖(見圖4)。利用插件cytoHubba根據(jù)Degree值選取Top 20靶點并可視化，見圖5，其中顏色的深淺代表degree值的高低。四味中藥中的部分藥物活性成分，如CNX3(Quercetin，槲皮素)、DS8(Luteolin，木犀草素)、HQ2(Wogonin，漢黃芩素)、B(beta-sitosterol，β-谷甾醇)參與調控前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、鈉通道蛋白5型亞單位α(sodium channel protein type 5 subunit alpha，SCN5A)、核受體輔激活因子1(nuclear receptor coactivator 1，NCOA1)、二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP4)等關鍵基因位點，這些中藥可能成為預防治療糖尿病性微血管并發(fā)癥的潛在藥物。

表1 四味中藥有效成分

圖4 “藥物-活性成分-作用靶點”網絡

圖5 中藥治療糖尿病性微血管并發(fā)癥的關鍵靶點網絡

3 討論與結論

糖尿病是一組可由遺傳、環(huán)境等多因素引起的代謝、異質性疾病，多伴有多種急慢性并發(fā)癥。大多數(shù)糖尿病患者到病程的一定階段都會伴有慢性高血糖癥的嚴重并發(fā)癥，包括腎病、視網膜病變、神經病變和心血管疾病。對于微血管并發(fā)癥的發(fā)病機理的研究，目前尚無定論，產生了諸如血流動力學異常、蛋白非酶糖基化、多元醇通道活性增加、組織自身氧化和糖基化等假說。在臨床中我們發(fā)現(xiàn)，盡管血糖長期控制不佳，但仍有一部分糖尿病患者可以免于微血管并發(fā)癥。通過對長期血糖控制不佳伴有嚴重微血管并發(fā)癥與長期血糖控制不佳不伴有微血管并發(fā)癥之間的差異分析，來探索糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)病機理及相關中藥預測，為臨床預防及診治提供新的線索。

應用GEO2R對數(shù)據(jù)集GSE43950進行分析處理，在GSE43950中獲得692個DEGs，包括121個上調基因和571個下調基因。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對DGEs進行GO功能和KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)上調差異基因主要參與血液止血、凝固的調節(jié)，與核心啟動子序列特異性DNA結合及與NF-κB信號通路、AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路等相關。下調差異基因主要參與中性粒細胞活化免疫應答、NOD樣受體信號通路、toll樣受體信號通路、內吞作用等相關。通過研究我們發(fā)現(xiàn)差異基因某些富集功能以及信號通道與糖尿病微血管并發(fā)癥的疾病進程相關。如上調DEGs的KEGG信號通路富集分析中的MAPK信號通路、AGE-RAGE信號通路在糖尿病及其微血管并發(fā)癥的疾病進程緊密聯(lián)系。MAPK通路有4種主要的分支路線：ERK、JNK、p38/MAPK和ERK5。在糖尿病及其晚期并發(fā)癥中，機體MAPK的活動都有所增加，與代謝控制無關[5]。高血糖可以激活MAPK通路，并在介導晚期并發(fā)癥中起重要作用[6]。MAPK通路密切參與了DR疾病進程。通過抑制p38和ERK信號通路，減輕氧化應激引起的損傷，有效延緩DR的進一步發(fā)展。p38/MAPK介導糖尿病腎病的發(fā)生，可能與其促進活性氧(ROS)的產生，介導炎性介質的釋放，激活RAS系統(tǒng)，增加腎小球內壓，加速DKD的疾病進展。晚期糖基化終產物(AGE)-AGE受體(RAGE)信號通路的作用最近已被確定在多種過程的發(fā)病機制中，例如炎癥、惡性腫瘤、糖尿病及糖尿病并發(fā)癥和神經變性[7]。最近的研究表明，AGE與RAGE受體的相互作用在各種類型的細胞中引起氧化和促凋亡反應，參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機制。AGE導致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，主要通過兩種機制：一是在生物分子中相互交聯(lián)，從而改變其生物學結構及功能，二是與細胞表面上的相關受體如RAGE結合，從而刺激導致氧化應激惡化的信號通路[8]。與健康個體相比，糖尿病患者中存在較高濃度的AGE和糖氧化產物，并且被認為通過與其受體(RAGE)的相互作用增加氧化應激，從而促進血管并發(fā)癥[9]。

DEGs主要富集于與血液止血、凝固的調節(jié)、中性粒細胞活化免疫應答、細胞凋亡等方面。利用蛋白互作數(shù)據(jù)庫STRING以及Cytoscape軟件中的cytoHubba分析DEGs，獲取了Top10關鍵基因，IL1B、TLR2、TLR4及CYBB等關鍵基因從多個層面介導了機體的免疫調節(jié)，提示免疫調節(jié)過程是糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)，調節(jié)機體免疫功能可能是防治糖尿病微血管并發(fā)癥的重要靶點。

IL-1B作為白細胞介素-1細胞因子家族一種關鍵的促炎因子，是炎癥反應的主要調節(jié)劑，參與細胞的增殖、分化和凋亡等一系列細胞活動[10]，還與機體的疼痛、自身免疫性反應相關。研究表明IL-1B在T2DM發(fā)展期間是啟動胰島炎癥的關鍵上游分子[11]。大量實驗研究表明炎癥小體激活和IL-1B分泌是驅動動脈粥樣硬化形成的關鍵過程[12]。促炎細胞因子IL-1B、白細胞介素6(IL-6)和白細胞介素8(IL-8)是急性期反應的介質，其通常與氧化應激情況的誘導相關[13]。氧化應激作為介導糖尿病并發(fā)癥的共同作用通路，介導了諸多糖尿病晚期并發(fā)癥，包括糖尿病微血管并發(fā)癥及大血管病變。

TLRs屬于模式識別受體家族，與糖尿病的發(fā)展存在緊密聯(lián)系，TLRs可以激活先天免疫系統(tǒng)，與胰島素抵抗、糖尿病和動脈粥樣硬化的發(fā)病機制有關，尤其是TLR2、TLR4的表達。TLR2主要表達于具有免疫相關功能的細胞內，如樹突狀細胞、單核巨噬細胞以及部分內皮細胞等，通過調節(jié)機體的細胞因子傳遞信號通路，參與了DN的發(fā)病機制。Shao等[14]研究通過使用TLR2敲除小鼠和野生型同窩小鼠研究了芍藥苷對1型糖尿病小鼠腎臟的影響。發(fā)現(xiàn)通過抑制TLR2信號通路，糖尿病小鼠的白蛋白尿顯著減少，腎組織病理學減弱，驗證了TLR2與DN的發(fā)生密切相關。同時，TLR2是響應氧化應激的視網膜變性的介質，是氧化損傷和補體介導的視網膜病變之間的橋梁[15]，這可能提示TLR2與DR的發(fā)生存在密切聯(lián)系。在TLRs家族中，TLR4作為一種跨膜蛋白受體，負責許多信號轉導通路的激活，糖尿病的慢性炎癥被認為與TLR4的激活有關[16]。Aly等[17]研究提示TLR2和TLR4表達增加可能在2型糖尿病患者的DN進展和胰島素抵抗惡化中起重要作用。因此，TLRs家族中的TLR2和TLR4可能是預防或延緩2型糖尿病及其并發(fā)癥的一個有希望的治療靶點。

CYBB編碼gp91phox，它是吞噬細胞中NADPH氧化酶的重要組分，同時是腎臟中氧化應激的主要來源。CYBB介導了ROS的產生，其參與了分化、細胞周期和凋亡相關的細胞信號傳導[18]。糖尿病患者和動物模型均證實，DM的發(fā)病機制可能由ROS的產生介導了機體的氧化應激(OS)[19]，ROS過量被認為是糖尿病并發(fā)癥的主要機制，增加線粒體ROS的產生在糖尿病并發(fā)癥(包括視網膜病變)中發(fā)揮著重要作用。

通過將關鍵基因映射到coremine medical數(shù)據(jù)庫，并構建藥物-活性成分-作用靶點網絡，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)頻次最高的4味中藥(黃芩、丹參、川牛膝和郁金)及其活性成分可靶向作用糖尿病微血管并發(fā)癥的關鍵基因，4味中藥都有一定的活血化瘀功效，丹參和郁金更是臨床上常用的活血化瘀之藥，與“糖尿病久病入絡、久病必瘀”之病機完美契合。糖尿病中醫(yī)病名為消渴，其病機是陰虛為本，燥熱為標。消渴日久，容易累及多個臟腑，影響氣血的正常運行，陰虛燥熱，耗傷津液，致血行不暢，血脈阻滯。血瘀是消渴病的重要病機，與多種慢性并發(fā)癥的疾病進程相關，臨床上在治療消渴病相關并發(fā)癥時經常選用活血化瘀類中藥?，F(xiàn)代藥理學亦證明上述中藥的某些成分在治療糖尿病及微血管并發(fā)癥方面發(fā)揮重要作用。從黃芩根中提取的多種生物活性藥物，如黃芩素和黃芩苷，研究證實黃芩素和黃芩苷都能增加機體葡萄糖消耗，降低血糖[20]。丹參酮IIA是丹參的經典活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等療效。研究表明丹參酮ⅡA通過抑制大鼠背根神經節(jié)電壓型鈉通道的表達和活性，改善痛性糖尿病神經病變[21]，提示丹參酮ⅡA可能是DPN治療的一種有前途的藥物。Yuan等[22]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA可以通過NF-κB誘導的AMPK信號通路改善2型糖尿病大鼠的脂代謝、糖代謝、胰島素抵抗。姜黃素是郁金的主要活性成分，一項系統(tǒng)性回顧分析表明姜黃素具有抑制機體的抑制氧化應激和炎癥過程的能力[23]，基于納米技術的納米姜黃素被認為是糖尿病患者藥物治療管理的潛在藥物[24]。β-蛻皮甾酮主要負責作為川牛膝活性成分之一，具有降低血糖，穩(wěn)定機體NO代謝物水平，從而起到保護腎臟作用[25]。

通過基于生物信息學的信息挖掘技術，對長期血糖控制不佳伴有嚴重微血管并發(fā)癥與長期血糖控制不佳不伴有微血管并發(fā)癥之間進行基因差異分析，篩選出10個差異最大的基因，進一步分析發(fā)現(xiàn)IL1B、TLR2、TLR4及CYBB等基因在糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)展中起重要作用，而丹參、黃芩、郁金、川牛膝等中藥及其活性成分可能成為治療糖尿病微血管并發(fā)癥的新藥物，為進一步探索糖尿病微血管并發(fā)癥的分子機制以及尋找新的治療藥物提供新思路。但本研究尚存在以下不足。第一，本研究數(shù)據(jù)庫中的樣本量較小，也未區(qū)分糖尿病類型，需要進一步擴大樣本量、細化糖尿病分型；第二，缺乏確切的實驗研究論證。因此，需要進一步探索這些關鍵靶分子及潛在藥物在糖尿病微血管并發(fā)癥中的功能作用。