鹽黃柏指紋圖譜研究及質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析

劉曉琳，吳文平，潘禮業(yè)，邢菊玲，官永河，楊曉東，龐 偉，李國(guó)衛(wèi)

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佛山 528244

黃柏為蕓香科植物黃皮樹PhelllodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮，習(xí)稱“川黃柏”。剝?nèi)淦ず?，除去粗皮，曬干。黃柏味苦性寒，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡之功用；鹽黃柏為黃柏照鹽水炙法炒干的炮制品，可滋陰降火，用于陰虛火旺，盜汗骨蒸[1]。黃柏的主要化學(xué)成分包括生物堿類、檸檬苦素類、酚酸類及黃酮類[2]。研究發(fā)現(xiàn)，黃柏不同炮制品中化學(xué)成分及其含量、藥理作用有變化及差異，鹽黃柏對(duì)金黃色葡萄球菌及白喉?xiàng)U菌的抑制作用均優(yōu)于黃柏絲[3-5]，此外，鹽黃柏代謝抑制功能優(yōu)于黃柏，該活性被認(rèn)為是黃柏滋陰作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，故經(jīng)鹽炮制后黃柏的滋陰作用加強(qiáng)[6]。2020版《中華人民共和國(guó)藥典》(簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)采用HPLC法測(cè)定鹽黃柏中小檗堿及黃柏堿的含量，并規(guī)定其含量分別不少于3.0%及0.34%，本研究以鹽黃柏為研究對(duì)象，建立了22批鹽黃柏HPLC指紋圖譜，在主成分分析(principal component analysis，PCA)的基礎(chǔ)上運(yùn)用正交偏最小二乘分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)初步篩選出不同批次鹽黃柏的差異性成分，結(jié)合指紋圖譜數(shù)據(jù)分析及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，從化學(xué)、生物信息及數(shù)理統(tǒng)計(jì)相結(jié)合的角度篩選鹽黃柏的活性成分，進(jìn)而確認(rèn)鹽黃柏質(zhì)量標(biāo)志物，為鹽黃柏質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(沃特世公司，Waters e2695，2489 UV/Vis Detector);Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色譜柱;萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司，ME204E);百萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司，XP26);數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-500DE)；超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)。

1.2 試劑和試藥

3-O-阿魏?？鼘幩?四川省維克奇生物科技有限公司，純度：98.4%，批號(hào)：wkq20022003)；5-O-阿魏?？鼘幩?四川省維克奇生物科技有限公司，純度：HPLC≥ 98%，批號(hào)：wkq19100907)；鹽酸小檗堿(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：86.8%，批號(hào)：110713-201613)；鹽酸黃柏堿(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：94.9%，批號(hào)：111895-201504)；甲醇(西隴科技股份有限公司)；乙腈(默克公司，色譜級(jí))；研究所用鹽黃柏飲片Salt-fried Phellodendri Chinensis Cortex(SPCC)來源信息見表1，經(jīng)廣東一方制藥有限公司技術(shù)中心/質(zhì)量中心主任中藥師魏梅鑒定為蕓香科植物黃皮樹PhelllodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮的炮制加工品。

表1 鹽黃柏飲片來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽黃柏指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.4mol/L NH4Cl(B)，梯度洗脫：0～5 min，95% B；5～40 min，95%→75% B；40～45 min，75%→65% B；45～50 min，65%→45% B；50～60 min，45%→10% B；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備

取3-O-阿魏酰奎寧酸對(duì)照品、5-O-阿魏?？鼘幩釋?duì)照品、鹽酸黃柏堿對(duì)照品、鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含3-O-阿魏?？鼘幩釋?duì)照品35 μg、5-O-阿魏?？鼘幩釋?duì)照品75 μg、鹽酸黃柏堿150 μg、鹽酸小檗堿100 μg的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備

取鹽黃柏飲片粉末(過四號(hào)篩)0.1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

方法學(xué)考察

2.1.4.1 專屬性考察

精密吸取50%甲醇(陰性對(duì)照)各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該分析方法能準(zhǔn)確檢測(cè)所指認(rèn)的特征峰，不受提取溶劑的干擾。

圖1 陰性對(duì)照色譜圖

2.1.4.2 精密度考察

取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以與小檗堿參照物相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD < 3%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、4、8、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，以小檗堿峰為S峰，計(jì)算特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD < 3%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.4 重復(fù)性考察

取同一批鹽黃柏飲片粉末0.1 g，共6份，精密稱定，按照“2.1.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，記錄色譜圖，以小檗堿峰為S峰，計(jì)算特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD < 3%，該方法的重復(fù)性良好。

2.1.5 特征峰指認(rèn)及共有峰確認(rèn)

采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012.0版)對(duì)22批鹽黃柏飲片指紋圖譜(見圖2)進(jìn)行分析，按平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜(見圖3)，建立各自指紋圖譜并生成指紋圖譜共有模式，共確定9個(gè)共有峰。

圖2 鹽黃柏指紋圖譜疊加圖

圖3 鹽黃柏對(duì)照?qǐng)D譜

按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件分別對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，通過與對(duì)照品保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，確定4個(gè)化學(xué)成分，分別為3-O-阿魏酰奎寧酸(峰2)、5-O-阿魏?？鼘幩?峰3)、黃柏堿(峰6)、小檗堿(峰9)(見圖4)?！吨袊?guó)藥典》2020年版[1]將黃柏堿、小檗堿作為評(píng)價(jià)黃柏質(zhì)量的指標(biāo)性成分，其中小檗堿含量較高且出峰位置適宜，色譜峰較穩(wěn)定，故最終選擇小檗堿作為參照峰S。

圖4 鹽黃柏及對(duì)照品HPLC圖

2.1.6 相似度評(píng)價(jià)

采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012.0版)對(duì)22批鹽黃柏飲片指紋圖譜進(jìn)行疊加，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)(見表2)。結(jié)果顯示，不同批次鹽黃柏飲片樣品的相似度均大于0.95，表明樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度較高，因此，該圖譜可作為鹽黃柏飲片的指紋圖譜。

表2 鹽黃柏指紋圖譜相似度

2.1.7 不同批次鹽黃柏差異性成分研究

2.1.7.1 主成分分析

將共有峰各色譜峰峰面積(見表3)相對(duì)于稱樣量量化，通過SPSS 20.0軟件對(duì)22批鹽黃柏飲片特征圖譜峰面積結(jié)果進(jìn)行主成分分析。由表4、表5可知，前3個(gè)成分累積方差貢獻(xiàn)率為93.699%，基本可以反映鹽黃柏飲片樣品信息。特征圖譜主成分1貢獻(xiàn)率為61.811%，其中峰6(黃柏堿)、峰3(5-O-阿魏酰奎寧酸)在主成分1中貢獻(xiàn)率較大，峰2(3-O-阿魏?？鼘幩?、峰4在主成分2中貢獻(xiàn)率較大，峰8在主成分3中貢獻(xiàn)率最大，因此可以認(rèn)為峰2(3-O-阿魏?？鼘幩?、峰3、峰4、峰6(黃柏堿)、和峰8是影響鹽黃柏飲片質(zhì)量的重要因素。根據(jù)各主成分得分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(見圖5)，對(duì)22批鹽黃柏飲片質(zhì)量進(jìn)行排序，四川省得分均高于其他省份，說明四川省作為黃柏的道地產(chǎn)區(qū)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

圖5 綜合得分圖

表3 22批鹽黃柏指紋圖譜共有峰峰面積

表4 各主成分的特征值及方差貢獻(xiàn)率

表5 主成分分析結(jié)果

2.1.7.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

為尋找鹽黃柏飲片產(chǎn)生差異性的主要標(biāo)記物，在主成分分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用SIMCA 14.1 軟件OPLS-DA分析上述兩組的差異性成分，歸一化方法選擇Par，默認(rèn)自動(dòng)建模(Autofit)，所得結(jié)果顯示R2X= 0.732，R2Y= 0.727，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.597，均大于0.5，說明預(yù)測(cè)結(jié)果良好。采用正交偏最小二乘法分析得到各特征峰的VIP值(見圖6)。結(jié)果顯示，峰6(黃柏堿)、峰9(小檗堿)VIP值均≥ 1.25，表明影響顯著，說明共有峰峰6(黃柏堿)、峰9(小檗堿)是A、B兩組的差異性成分，由于四川省為黃柏的道地產(chǎn)區(qū)，質(zhì)量最佳，且四川省各批次的峰6(黃柏堿)和峰9(小檗堿)峰面積相對(duì)于稱樣量量化后均較其他省份高，因此可以認(rèn)為峰6(黃柏堿)、峰9(小檗堿)可作為鹽黃柏飲片的質(zhì)量控制的標(biāo)志物。

采用置換檢驗(yàn)(Permutation test)驗(yàn)證OPLS-DA模型的可靠性，并設(shè)置置換次數(shù)為200。結(jié)果見圖7，A、B兩組回歸線在Y軸截距均< 0，表明模型未出現(xiàn)過擬合，OPLS-DA模型可靠。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1 候選化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP，https://tcmsp-e.com/)、PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫(kù)(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)、Pharm mapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)檢索3-O-阿魏酰奎寧酸、5-O-阿魏?？鼘幩?、小檗堿及黃柏堿等化合物，篩選化合物作用的靶點(diǎn)；并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名。將各數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的靶點(diǎn)蛋白合并，除去重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到與4個(gè)化合物相關(guān)的198個(gè)靶點(diǎn)蛋白。

2.2.2 靶點(diǎn)蛋白與蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

將獲得的198個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入在線STRING軟件(https://cn.string-db.org/)，物種為人(homo sapiens)，設(shè)置最高置信度蛋白交互參數(shù)評(píng)分值> 0.9，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開的節(jié)點(diǎn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖8，degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大)。利用Cytoscape軟件采用MCC計(jì)算方法對(duì)PPI進(jìn)行拓?fù)浞治觯吹梅种蹬琶Y選出前15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分析結(jié)果見表6，這些靶點(diǎn)主要與小檗堿、黃柏堿、3-O-阿魏?？鼘幩峒?-O-阿魏?？鼘幩嵊嘘P(guān)。

圖8 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表6 關(guān)鍵靶點(diǎn)匯總

2.2.3 功能富集分析與通路分析

GO功能富集分析：利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/)對(duì)上述198個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，選擇P值< 0.01。結(jié)果得到生物過程(biological process，BP)條目419個(gè)，主要涉及的生物過程有：細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)、蛋白質(zhì)磷酸化、對(duì)外來刺激的反應(yīng)、MAPK級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)等。細(xì)胞組成(cellular components，CC)條目有67個(gè)，主要富集在突觸前膜、受體、膜筏、磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物、神經(jīng)元、胞質(zhì)核周區(qū)等區(qū)域。分子功能(molecular function，MF)條目有125個(gè)，主要富集在神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、兒茶酚胺結(jié)合、配體門控離子通道活性等功能。P值排名前20條目的BP、CC、MF見圖9。

圖9 GO功能富集分析柱狀圖

KEGG富集分析設(shè)置P值< 0.01，富集得到的主要涉及5-羥色胺能突觸途徑、鈣信號(hào)通路、刺激神經(jīng)組織中的交互、癌癥通路、炎癥介質(zhì)對(duì)TRP通道的調(diào)節(jié)等，由此可知，鹽黃柏是通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮協(xié)同作用的。按照P值從小到大的順序篩選前20條，繪制氣泡圖(見圖10)。

圖10 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.2.4 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將4種化學(xué)成分和分析得到的15個(gè)靶點(diǎn)以及KEGG通路富集分析得到的前20條通路導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行可視化分析，如圖11。根據(jù)分析結(jié)果，以化合物-靶點(diǎn)-信號(hào)通路的連接度(degree)為參考，發(fā)現(xiàn)小檗堿及黃柏堿有較高的連接度，提示小檗堿(degree = 10)及黃柏堿(degree = 3)化合物可能是鹽黃柏的高活性成分；PRKCA(degree = 10)、MAPK14(degree = 6)、ADRB(degree = 5)、AR(degree = 4)、ROCK1(degree = 4)、ROCK2(degree = 4)、RAC1(degree = 4)、JUN(degree = 4)的連接度高于其他7個(gè)靶點(diǎn)，表明活性成分可能是通過PRKCA、MAPK14等多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮作用。癌癥通路(pathways in cancer，degree = 12)、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway，degree = 5)、cGMP-PKG信號(hào)通路(cGMP-PKG signaling pathway，degree = 3)、TRP通道對(duì)炎癥介質(zhì)的調(diào)控(Inflammatory mediator regulation of TRP channels，degree = 3)4條通路的連接度高于其他通路，說明該4條通路可能是鹽黃柏潛在Q-maker的重要信號(hào)通路。

圖11 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論與結(jié)論

黃柏的化學(xué)成分主要包括生物堿類、黃酮類、甾醇類化合物及揮發(fā)油等，其中生物堿類化合物是黃柏的主要有效化學(xué)成分。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，黃柏經(jīng)鹽制后，其主要有效成分小檗堿及黃柏堿的含量都有所上升，經(jīng)鹽炮制后有利于其生物堿成分的溶出[7]。本研究通過建立指紋圖譜指認(rèn)了小檗堿、黃柏堿、3-O-阿魏?？鼘幩峒?-O-阿魏?？鼘幩?個(gè)化學(xué)成分。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)小檗堿及黃柏堿化合物可能是鹽黃柏的有效活性成分，并篩出潛在的8個(gè)核心靶點(diǎn)(PRKCA(degree = 10)、MAPK14(degree = 6)、ADRB(degree = 5)、AR(degree = 4)、ROCK1(degree = 4)、ROCK2(degree = 4)、RAC1(degree = 4)、JUN(degree = 4))，這些靶點(diǎn)可能作用于癌癥通路(Pathways in cancer)、及cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、cGMP-PKG信號(hào)通路(cGMP-PKG signaling pathway)及TRP通道在炎性介質(zhì)的調(diào)控(Inflammatory mediator regulation of TRP channels)中發(fā)揮重要作用，這與鹽黃柏的藥效滋陰降火可能具有一定相關(guān)性。因此，初步預(yù)測(cè)小檗堿、黃柏堿為鹽黃柏潛在的質(zhì)量標(biāo)志物成分。現(xiàn)代研究結(jié)果表明小檗堿具有抑菌、抗炎等藥理活性，可通過降低磷化ERK/JNK蛋白表達(dá)水平而產(chǎn)生抗炎作用，可通過抑制非小細(xì)胞肺癌中COP9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體5(CSN5)的脫泛素活性，減少細(xì)胞程序性死亡配體1(PD-L1)的表達(dá)，促進(jìn)抗腫瘤免疫[8,9]，此外，小檗堿還具有降糖、降壓、增強(qiáng)腸管張力和振幅以及對(duì)前列腺的滲透作用[10,11]。黃柏堿可抑制ROS引起的炎癥通路上相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制IKK/NF-κB通路，還可顯著降低NF-κB的下游蛋白COX-2的表達(dá)，在體內(nèi)外均有著較好的抗氧化及減輕炎癥損傷的作用[12,13]?？鼘幩嵫苌镌诳垢腥?、抗心血管疾病及降糖等方面具顯著的活性[14]。阿魏?？鼘幩犷惢衔锸且环N有效的酚類抗氧劑，其抗氧化能力要強(qiáng)于咖啡酸、對(duì)羥苯甲酸、阿魏酸、丁香酸等，且具有消除體內(nèi)自由基、抑制突變和抗腫瘤作用等[15]。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜多樣，中藥質(zhì)量是中藥臨床安全有效的基礎(chǔ)，通過高效液相色譜檢測(cè)出中藥含有的所有化學(xué)成分，然后采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，能快速得到其含有的活性化合物，高效研究其中的活性成分，排除與主治無(wú)關(guān)或毒性成分，研究各組分對(duì)多靶點(diǎn)的活性，從而有效的節(jié)省時(shí)間和成本，提高中藥活性成分篩選的效率[16]。為明確鹽黃柏的質(zhì)量標(biāo)志物，本研究采用HPLC法對(duì)22批不同產(chǎn)地的鹽黃柏進(jìn)行研究，建立了鹽黃柏的指紋圖譜，確認(rèn)了9個(gè)共有峰，不同批次鹽黃柏指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相似度在0.958～0.999，表明22批鹽黃柏飲片化學(xué)成分相似度高，質(zhì)量較為穩(wěn)定均一。通過主成分分析結(jié)果可知，四川省飲片主成分綜合排名較其他省份高，說明四川省作為黃柏傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)的科學(xué)性；OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)小檗堿和黃柏堿是不同鹽黃柏飲片的重要差異性成分，再結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可知小檗堿、黃柏堿是鹽黃柏發(fā)揮功效的主要活性成分。由此，可以確認(rèn)小檗堿、黃柏堿是鹽黃柏潛在的質(zhì)量標(biāo)志物。

本研究采用HPLC結(jié)合化學(xué)計(jì)量法與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究從有效性角度預(yù)測(cè)出小檗堿、黃柏堿為鹽黃柏的活性成分和質(zhì)量標(biāo)志物，為鹽黃柏的質(zhì)量控制提供參考。