基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接及實驗驗證探討蠶梅方治療結(jié)直腸癌的作用機制

周亞秋，周紅光,2*

1南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，南京 210046；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210009

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)認為是男性第三大常見癌癥，女性第二大常見癌癥，也是全球第二大癌癥死亡原因。結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率正在迅速上升，尤其是在低收入和中等收入國家，據(jù)估計，到2030年，結(jié)直腸癌的全球負擔將增加60%，超過220萬新病例和110萬癌癥死亡[1]。傳統(tǒng)的治療方法有手術(shù)、藥物、化療等，但總體生存率并不理想。

中醫(yī)藥作為一種重要的抗腫瘤藥物，已被臨床研究證實。以往的研究表明，中醫(yī)藥結(jié)合化療或放療，可顯著提高患者1～3年的生存率，減輕不良反應(yīng)，改善生活質(zhì)量，延長生存時間[2]，是治療結(jié)直腸癌尤為重要的一種方法。古醫(yī)籍中并無結(jié)直腸癌病名的確切記載，現(xiàn)多將其歸為“鎖肛痔”“腸風(fēng)”“積聚”等范疇?！侗静菥V目》記載：“腸風(fēng)下血，僵蠶炒去嘴足，烏梅肉焙各一兩，為末，米糊丸梧子大。每服百丸，食前白湯下，一日三服。”其中僵蠶性平，味咸、辛，歸肝、肺、胃經(jīng)，祛風(fēng)止驚、化痰散結(jié)；烏梅性平，味酸、澀，歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)，斂肺、澀腸、祛腐。兩藥分走陰陽，酸收辛散，遂組方取名為蠶梅方(Canmei Decoction，CMF)[3]。研究表明[4]，CMF提取物對AOM/DSS誘發(fā)小鼠腺瘤性腸息肉具有防治作用，能顯著降低AOM/DSS小鼠腺瘤性息肉的發(fā)生率。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)、整體角度探索藥物與機體相互作用的一門新學(xué)科[5]，為了探討中藥復(fù)方發(fā)揮藥效的潛在活性成分和分子機制，該學(xué)科基于現(xiàn)代生物信息學(xué)研究方法，深層次解析了成分-成分、成分-靶點以及靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)之間的協(xié)同作用機制，反映了中藥復(fù)方多成分、多靶點作用特點，體現(xiàn)了系統(tǒng)性和整體性的突出優(yōu)勢[6,7]。已有學(xué)者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討CMF抗結(jié)直腸腺瘤(colorectal adenoma，CRA)的潛在作用機制[4]，但尚沒有采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討CMF抗CRC作用機制的研究報道。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，探討其產(chǎn)生作用的信號通路，為CMF多成分、多靶點治療的作用機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 篩選CMF的活性成分與靶標

一、通過化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)及文獻挖掘等方式，對僵蠶成分進行收集整理，建立僵蠶化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.Swisstargetprediction.ch/)篩選并獲取候選活性成分。經(jīng)ADME篩選后，依據(jù)可能性由大到小，選取Probability>0.1的成分蛋白作為靶點。二、利用TCMSP預(yù)測的烏梅全部成分靶點，設(shè)定藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件。在Uniprot(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中剔除非人源及未經(jīng)驗證的靶點基因，建立所有靶標的基因信息庫，將匯總的靶標名去重導(dǎo)入信息庫進一步標準化。

1.2 篩選結(jié)直腸癌的靶點

利用人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM(https://omim.org/)、人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards(https://www.genecards.org/)，以“colorectal cancer”為關(guān)鍵詞，收集結(jié)直腸癌相關(guān)的人類疾病基因，根據(jù)score大于中位數(shù)對潛在靶點進行篩選，匯總后去除重復(fù)值，獲得疾病靶點。

1.3 PPI數(shù)據(jù)采集與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

在韋恩圖繪制網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)上傳疾病和藥物靶點，取交集獲得核心靶點。再將上述核心靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，篩選條件為score>0.7。借助CytoScape3.7.2軟件及其內(nèi)置工具計算此網(wǎng)絡(luò)的拓撲參數(shù)，分析連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closenesss)數(shù)據(jù)得到起核心作用的靶點。

1.4 GO和KEGG富集分析

將核心靶點導(dǎo)入Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)行GO和KEGG富集分析。篩選前十個具有顯著性差異的GO和KEGG數(shù)據(jù)予可視化處理。構(gòu)建“基因-通路”網(wǎng)絡(luò)以進一步詮釋CMF治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵靶基因。

1.5 CMF核心成分與關(guān)鍵靶基因的分子對接驗證

在PubChem數(shù)據(jù)庫尋找活性成分的SDF文件，利用PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)獲取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前6的靶點蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)。在PyMOL軟件中對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)去除水分子、加氫等處理，轉(zhuǎn)換成PDBQT格式，然后在AutoDockTools1.5.6和Vina軟件中完成分子對接，得到結(jié)合能(affinity)。利用PyMOL軟件對結(jié)果進行可視化操作。

1.6 實驗驗證

1.6.1 實驗細胞

人結(jié)腸癌細胞株HCT-116購自上海中喬新舟生物科技有限公司。細胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6.2 主要試劑

槲皮素(貨號：H-009，HPLC純度≥98%)購自瑞芬思公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒(KGA107)購自keygen公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號：G2003)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：G2026)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號：G2014)、蛋白Marker(貨號：26617)、兔源Bax抗體(貨號：GB11690)、HRP標記的羊抗兔IgG(貨號：GB23303)、鼠源GAPDH抗體(貨號：GB12002)均購自Servicebio公司；鼠源Bcl-2抗體(AFFINITY公司，貨號：BF9103)。

1.6.3 實驗方法

1.6.3.1 MTT檢測細胞活性

將對數(shù)生長期HCT116細胞以每孔1×104/mL個細胞接種于96孔板。待細胞貼壁后，每孔注入不同濃度槲皮素0、50、100、150和200 μmol/L培養(yǎng)液100 μL，每組設(shè)3個平行孔，培養(yǎng)48 h后，加入配制好的MTT(5 mg/mL)試劑20 μL/孔，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，吸去培養(yǎng)上清液后加入200 μL/孔DMSO，放置于搖床上低速避光振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標儀測定490 nm處每孔的OD值。按如下公式計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率=

(OD空白-OD實驗)/OD空白×100%

式中，OD空白為空白組(含有細胞的培養(yǎng)基、MTT、不含藥物)吸光度，OD實驗為實驗組(含有細胞的培養(yǎng)基、MTT、不同濃度的藥物)吸光度。

1.6.3.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

將對數(shù)生長期HCT116細胞以每孔4×105/mL個細胞接種于六孔板，培養(yǎng)24 h后按照槲皮素四個濃度0、50、100和200 μmol/L加入培養(yǎng)液100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，消化、重懸細胞。按照說明書，每管加入500 μL的Binding Buffer輕輕懸浮細胞，加5 μL的Annexin V-FIT混勻后，再加入5 μL的PI輕輕混勻，并在室溫下避光孵育5～15 min，最后分組使用流式細胞儀進行檢測。

1.6.3.3 Western blot法檢測蛋白表達

將對數(shù)生長期HCT116細胞按“1.6.3.2”項方法處理后，加入RIPA裂解液提取總蛋白，利用BCA測試盒測定蛋白濃度，取等量蛋白用10%SDS-PAGE膠電泳后濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜3次，然后加一抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次后加入二抗，4 ℃搖床上孵育1 h后再次洗膜3次，最后按1∶1避光加入增強化學(xué)發(fā)光液(ECL)顯影、定影，分析結(jié)果。

1.6.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CMF活性成分靶獲取

通過對僵蠶成分的2D結(jié)構(gòu)、CAS號進行檢索及篩選，符合條件的化合物有3個，烏梅符合條件的對應(yīng)化合物有8個，為進一步檢索各化合物對應(yīng)靶點做準備。

2.2 CMF化學(xué)成分對應(yīng)靶點的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對符合篩選條件的各化學(xué)成分對應(yīng)靶點進行檢索，其中僵蠶對應(yīng)的靶點有227個，烏梅對應(yīng)的靶點有239個，共466個藥物成分靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制CMF活性成分治療結(jié)直腸癌的網(wǎng)絡(luò)圖(見圖1)。圖中466條連線示意活性成分對共有靶點的作用，黃色表示藥物活性成分與疾病相關(guān)靶點的共有靶點，紫色表示活性化合物。根據(jù)該網(wǎng)絡(luò)拓撲分析的數(shù)據(jù)，槲皮素、山奈酚在CMF治療結(jié)直腸癌過程中發(fā)揮重要作用(見表1)。

表1 CMF關(guān)鍵藥效分子及拓撲參數(shù)(前5位)

將上述各化合物對應(yīng)靶點合并，去除重復(fù)值后得到166個靶點，為進一步研究CMF防治結(jié)直腸癌的潛在機制做準備。

2.3 結(jié)直腸癌對應(yīng)靶點

分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫以“colorectal cancer”為關(guān)鍵詞檢索，得到650、498個靶點，匯總并去除重復(fù)值，共獲得1 028個疾病靶點。應(yīng)用韋恩圖取交集，得到79個共同靶點(見圖2)。

圖2 成分靶點-疾病靶點韋恩圖

2.4 活性成分靶點-疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

借助String數(shù)據(jù)庫結(jié)合Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建中藥成分靶點-疾病蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)(79個節(jié)點，1 465條邊)，設(shè)置score>0.7，得到CMF治療結(jié)直腸癌靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。圖中蛋白用節(jié)點表示，節(jié)點顏色和大小隨degree值的大小改變，蛋白間的相互聯(lián)系用連線表示，邊的粗細隨Combine score值的大小改變。結(jié)果表明：腫瘤抑制基因P53(TP53)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、白細胞介素-6(IL6)靶點蛋白度值排名靠前，為關(guān)鍵靶點。

圖3 CMF-結(jié)直腸癌靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 關(guān)鍵靶點的GO富集結(jié)果

GO富集分析分為3類：分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞組分(cellular components，CC)。利用Metascape平臺對CMF治療結(jié)直腸癌的潛在靶點進行GO分析，顯示共有1 773個結(jié)果富集，其中BP相關(guān)的條目最多，有520條，主要涉及有凋亡信號通路、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、細胞死亡的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、上皮細胞增殖、對脂多糖的反應(yīng)、活性氧代謝過程等方面，CC相關(guān)的條目有41條，主要涉及細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、細胞器外膜、囊泡腔、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等方面，MF相關(guān)的條目有123條，主要涉及有激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、蛋白激酶活性等方面。將基因GO本體條目按P值進行排序，分別選取BP、CC和MF的前10繪制柱狀圖(見圖4)。

圖4 CMF治療CRC的GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集結(jié)果

為了獲取CMF治療結(jié)直腸癌的潛在靶點主要富集的信號通路，利用Metascape平臺對進行KEGG通路富集分析，以P<0.01作檢驗校正，篩選出富集最為顯著的前20位的信號通路(見圖5)。可見靶點富集得到的主要信號通路包括：癌癥的途徑、膀胱癌、IL-17信號通路、丙型肝炎、PI3K-Akt信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、鉑類耐藥、HIF-1信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、p53信號通路等途徑。

圖5 CMF治療CRC的KEGG信號通路

2.7 “活性成分-靶點”分子對接

將“2.2”項下得到的核心活性成分山奈酚、槲皮素與關(guān)鍵靶點TP53、AKT1、MAPK8、MAPK1、JUN、IL6進行分子對接和結(jié)合能力預(yù)測。自由結(jié)合能越小，則表示受體與配體之間的親和力越大(見表2)。并用PyMOL軟件進行可視化處理(見圖6、7)。結(jié)果顯示，各活性成分與蛋白對接的結(jié)合自由能均小于-6 kJ/mol，表明各活性成分與各蛋白均有較高的親和力，其中MAPK8與山奈酚親和力最高，TP53與槲皮素親和力最高。

圖6 槲皮素與TP53蛋白對接圖

表2 活性成分-靶點結(jié)合能

2.8 槲皮素對結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖的影響

MTT實驗表明，槲皮素對結(jié)腸癌HCT-116細胞的抑制率與空白組比較顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明槲皮素能有效抑制結(jié)腸癌HCT-116細胞的增殖，且呈劑量依賴關(guān)系(見表3)。因高濃度組抑制率相近，故本研究后續(xù)實驗分別采用0、50、100、200 μmol/L作為槲皮素的低、中、高劑量進行體外細胞研究。

圖7 山奈酚與MAPK8蛋白對接圖

表3 不同濃度槲皮素對HCT116增殖的抑制作用

2.9 槲皮素對結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，各濃度槲皮素均可誘導(dǎo)HCT116細胞凋亡，與空白組比較均有顯著差異(P<0.01)，由圖8可知，隨著槲皮素濃度的增加，其誘導(dǎo)凋亡的作用逐漸增強，尤其表現(xiàn)在總凋及晚凋比例，并且呈劑量賴關(guān)系。

圖8 不同濃度槲皮素對HCT116凋亡的抑制

2.10 槲皮素對結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、BAX的影響

Western blot結(jié)果顯示(見圖9)，隨著槲皮素濃度的增加，Bcl-2的蛋白質(zhì)水平明顯減少，BAX的蛋白質(zhì)水平顯著增加，各濃度與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖9 不同濃度槲皮素對HCT116凋亡蛋白的影響

3 討論與結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接及實驗驗證，對CMF治療結(jié)直腸癌的潛在作用機制進行了系統(tǒng)分析，構(gòu)建僵蠶、烏梅活性成分-結(jié)直腸癌靶點網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測潛在作用靶點及信號通路，通過拓撲數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)槲皮素、山奈酚可能在CMF治療結(jié)直腸癌過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

研究表明，槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗腫瘤和免疫抑制等藥理學(xué)活性[8]，可以促進細胞凋亡和自噬，以及抑制血管生成和炎癥來抑制結(jié)直腸癌的進展[9]。通過抑制MAPK/Erk、PI3K/Akt和NF-κB等信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡[10,11]。天然黃酮醇山萘酚，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性，并正在應(yīng)用于癌癥化療。上述已有的研究結(jié)果與預(yù)測結(jié)果基本一致，提示CMF主要有效成分對防治結(jié)直腸癌具有確切治療作用。

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果得出，CMF防治結(jié)直腸癌的潛在靶基因有：TP53、AKT1、MAPK8、MAPK1、JUN、IL6。TP53是一種腫瘤抑制蛋白，通過促進細胞凋亡和DNA修復(fù)來嚴格調(diào)節(jié)細胞生長。研究表明，突變的TP53會導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者癌細胞異常增殖和腫瘤進展[12]。AKT1(即AKT)是PI3K/AKT信號通路中的核心靶標，參與腫瘤細胞的生長、增殖、凋亡、代謝、腫瘤耐藥和免疫逃逸[13]。MAPK1、MAPK8均是MAP激酶家族的成員。MAP激酶作為多種生化信號的整合點，參與多種細胞過程，如分化、增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。實驗證明，miR-422a通過靶向MAPK1和AKT1抑制結(jié)腸癌細胞增殖[14]。c-jun是JUN基因的一種蛋白，結(jié)直腸癌患者表現(xiàn)出對c-Jun的易感性，且與生存率密切相關(guān)[15]。IL-6是急性期炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵細胞因子，參與包括癌癥在內(nèi)的多種慢性炎癥疾病的發(fā)病機制。IL-6家族細胞因子已被確定為檢測癌癥的生物標志物[16]。綜上可見，CMF的有效成分靶點與大腸癌的疾病靶點相互作用，充分發(fā)揮中藥治療結(jié)直腸癌多成分、多靶點的獨特優(yōu)勢。

GO功能及KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，CMF參與細胞增殖、細胞周期、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)等生物過程；癌癥通路、IL-17信號通路、PI3K-AKT信號通路、HIF-1信號通路等通路富集的基因數(shù)量最多，表明這些通路可能在CMF治療結(jié)直腸癌的作用機制中發(fā)揮重要作用。

細胞因子是癌癥生長和侵襲的重要炎癥介質(zhì)。IL-17是Th17細胞產(chǎn)生的主要細胞因子，可誘導(dǎo)嗜中性粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子和趨化因子，參與包括宿主防御、組織修復(fù)、炎癥性疾病的發(fā)病機制和癌癥的進展等多種過程，在人類惡性腫瘤中起關(guān)鍵作用[17,18]。在腸道中，IL-17信號通過增強具有Apc突變的腸細胞的增殖和存活來促進腺瘤形成，損害腸道屏障功能，激活腫瘤內(nèi)IL-17反應(yīng)，促進腫瘤生長[19]。此外，IL-17誘導(dǎo)的細胞因子和趨化因子粒細胞動員抑制細胞，其促進血管生成和抑制抗腫瘤免疫[20-22]。PI3K/AKT/mTOR這一經(jīng)典的自噬信號通路，參與了腫瘤細胞的生長、增殖、生存、凋亡、代謝以及腫瘤耐藥和腫瘤免疫逃逸[23]。該信號通路的活化是癌癥發(fā)生的標志[24-26]。在晚期乳腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌等實體癌癥中常見PI3K信號通路激活突變，該突變率增加可達30%～60%[27,28]。CMF有效成分可通過調(diào)控多條通路，影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，這為臨床治療提供了新的思路。

“活性成分-靶點”分子對接結(jié)果顯示CMF的核心活性成分槲皮素與山奈酚與關(guān)鍵靶點展現(xiàn)出較好的親和力，且結(jié)合位點構(gòu)象穩(wěn)定，有較強的結(jié)合能力，也進一步驗證了本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測。

基于上述研究結(jié)果，選擇主要活性成分槲皮素作為后續(xù)細胞實驗，深入探討其潛在的機制。實驗結(jié)果顯示，不同濃度的槲皮素干預(yù)HCT116細胞后可顯著抑制細胞增殖和促進細胞凋亡，降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達、增加促凋亡蛋白BAX表達。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

從系統(tǒng)生物學(xué)角度對CMF防治結(jié)直腸癌潛在機制進行預(yù)測結(jié)果的分析，符合中醫(yī)運用復(fù)方中藥多靶點、多途徑、多系統(tǒng)，整體調(diào)理機體、防治疾病的特點，且有助于揭示中藥復(fù)方科學(xué)內(nèi)涵和指導(dǎo)中藥新藥研發(fā)。中藥在腫瘤的預(yù)防和治療方面有著廣闊的前景，但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法存在一定的局限性，后期仍需開展多維度實驗作進一步驗證。