葉麗芳,馬志國(guó),3,張 英,3,廖鵬程,黃天賜,付 偉,曹 暉,3*,吳孟華,3*
1暨南大學(xué)嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心,廣州 511400;2廣東省中醫(yī)藥信息化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510632;3國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心嶺南資源分中心,廣州 511400;4九州天潤(rùn)中藥產(chǎn)業(yè)有限公司,武漢 430050
中藥材切制前常須軟化,使其質(zhì)地由硬變軟,便于切制,潤(rùn)法是最常用的軟化方法。“潤(rùn)在適中”“少泡多潤(rùn),藥透水盡”是老藥工的經(jīng)驗(yàn)總結(jié),軟化程度主要借助人的眼觀、手感等感受來判斷,具有一定的主觀性。潤(rùn)制過程中,隨著水分的滲透,藥材內(nèi)部多個(gè)指標(biāo)出現(xiàn)了明顯的變化,這些指標(biāo)的量化表征對(duì)闡明中藥傳統(tǒng)潤(rùn)制經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)內(nèi)涵具有重要意義。低場(chǎng)核磁共振(LF-NMR)和磁共振成像(MRI)具有靈敏度高、分析速度快、無創(chuàng)性、無破壞性和低成本特點(diǎn)[1],用于物性分析的質(zhì)構(gòu)儀具有客觀性、易操作等優(yōu)點(diǎn)[2],這兩種技術(shù)可分別從水分和物性角度對(duì)食品加工過程與產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行量化表征,在食品研究領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用[2,3]。近年來,LF-NMR/MRI和物性分析技術(shù)在中藥的產(chǎn)地加工和炮制研究中也得到了應(yīng)用[4-9],為中藥傳統(tǒng)潤(rùn)制經(jīng)驗(yàn)科學(xué)內(nèi)涵的研究提供了重要技術(shù)手段。
厚樸為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.或凹葉厚樸MagnoliaoffcinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮,具有燥濕消痰、下氣除滿的功效。作為皮類藥材的代表之一,厚樸由藥材到飲片的制備方法為“刮去粗皮,洗凈,潤(rùn)透,切絲,干燥”[10]。切制前,厚樸潤(rùn)制程度的把握目前尚缺乏科學(xué)客觀的指引,關(guān)于厚樸炮制的研究多以炮制前后化學(xué)成分變化為主[11,12]。本研究在厚樸潤(rùn)制吸水率變化曲線的基礎(chǔ)上,對(duì)潤(rùn)制過程中水分分布、藥材質(zhì)構(gòu)特性和主要有效成分含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行直觀量化表征與相關(guān)性分析,旨在闡釋厚樸潤(rùn)制“少泡多潤(rùn),藥透水盡”傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)內(nèi)涵,為中藥潤(rùn)制終點(diǎn)的準(zhǔn)確判斷提供依據(jù)。
MesoMR23-060H-1中尺寸核磁共振成像分析儀(上海紐邁分析儀器股份有限公司);TA-HD plus 物性測(cè)定儀(英國(guó)Stable Micro System公司);XGQ-2000型恒溫培養(yǎng)箱(余姚市星辰儀表廠);101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);Thermo Ultimate 3000 液相色譜儀,DAD檢測(cè)器,四元低壓梯度泵,在線真空脫氣機(jī),自動(dòng)進(jìn)樣器,柱溫箱(賽默飛世爾科技公司);FA 2204B型萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司);EX225DZH 十萬分之一天平(奧豪斯儀器有限公司);KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
厚樸酚(成都瑞芬思生物科技有限公司,批號(hào):RFS-H00411801016,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%),和厚樸酚(成都瑞芬思生物科技有限公司,批號(hào):RFS-H00511801016,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%);甲醇購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司,為色譜純;水為純凈水(華潤(rùn)怡寶飲料(中國(guó))有限公司);其余試劑均為分析純。
厚樸(批號(hào):HP0101、HP0102、HP0103)購(gòu)自湖北省恩施市宣恩縣,經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院張英副教授鑒定均為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.的干燥干皮。參考《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn) 厚樸》中筒樸的規(guī)格標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合樣品實(shí)際情況,以重量和長(zhǎng)度為指標(biāo),將樣品分檔如下:筒長(zhǎng)大于40 cm,且重量大于200 g者為大檔;筒長(zhǎng)30~40 cm,且重量100~200 g者為中檔;筒長(zhǎng)小于30 cm或重量小于100 g者為小檔。
1.3.1 潤(rùn)制過程水分變化研究
1.3.1.1 吸水率變化考察
稱取不同檔厚樸藥材(含水量約為8%)各三份,每份300 g,洗凈后,將藥材置于泡藥池內(nèi),加5 L水沒過藥材,浸泡0.5 h后,取出,轉(zhuǎn)移至潤(rùn)藥容器內(nèi),覆蓋濕紗布,分別在10、20、30 ℃下堆潤(rùn),潤(rùn)制過程中每1 h稱重1次,計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的吸水率,直至藥材充分軟化。吸水率計(jì)算公式如下:
式中,Mt為不同潤(rùn)制時(shí)間厚樸的質(zhì)量,M0為厚樸浸泡前的質(zhì)量。
1.3.1.2 水分遷移分析
橫向弛豫時(shí)間(T2)測(cè)定 取“1.3.1.1”項(xiàng)下不同潤(rùn)制時(shí)間的中檔厚樸,吸干表面的水,稱重,然后放入低場(chǎng)核磁共振(LF-NMR)久磁場(chǎng)中心位置的直徑為60 mm的玻璃管中,利用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列測(cè)樣品T2,連續(xù)測(cè)定3次,取平均值。采用多脈沖回波序列CPMG掃描采集核磁信號(hào),通過調(diào)整multi-slice spinechoes(MSE)序列中的選層梯度、相位編碼梯度和頻率編碼梯度,分別獲取樣品俯視和正視成像數(shù)據(jù),然后利用 sirt 算法,迭代次數(shù)為100 000次進(jìn)行反演得到T2譜圖。T2試驗(yàn)主要參數(shù):主頻SF=21 MHz,偏移頻率O1=260 kHz,90°脈寬P1=10.00 μs,180°脈寬P2=19.04 μs,累加采集次數(shù)NS=4,回波時(shí)間TE=0.300 ms,回波個(gè)數(shù)NECH=8 000,采樣頻率SW=100 kHz[8]。
低場(chǎng)核磁共振成像(MRI)試驗(yàn) 采用多層自旋回波序列MSE采集T2測(cè)定項(xiàng)下各樣品橫斷面的H質(zhì)子密度圖像[5],采用MRI成像軟件進(jìn)行MRI成像試驗(yàn)。MRI成像參數(shù):層數(shù)6,層厚2 mm,層間隙2 mm,采集次數(shù)16,重復(fù)時(shí)間260 ms,視野100 mm×100 mm,頻率方向256,編碼步數(shù)192。
1.3.2 潤(rùn)制過程質(zhì)構(gòu)特性分析[6]
2016年初,隆化縣共有建檔立卡貧困村152個(gè),貧困戶3.83萬戶共8.346萬人,全縣貧困人口人均可支配收入2900元。截至2017年底,隆化縣還有貧困村152個(gè),貧困戶1.6484萬戶共4.2852萬人,其中深度貧困村23個(gè),貧困戶2369戶共6585人,兩年減貧40608人。全縣貧困人口人均可支配收入3100元,較2016年增長(zhǎng)200元,同比增長(zhǎng)6.9%,脫貧效果顯著。2017年10月份,隆化縣在河北省第三方評(píng)估中,以錯(cuò)退率1.31%、錯(cuò)評(píng)率1.89%、群眾滿意度98%的優(yōu)異成績(jī)位列河北省脫貧工作第一。
采用TA-HD plus物性測(cè)定儀,選用TA-9探頭測(cè)定“1.3.1.1”項(xiàng)下不同潤(rùn)制時(shí)間中檔厚樸的質(zhì)構(gòu)特性,為保證硬度測(cè)量精度和準(zhǔn)確性,經(jīng)預(yù)試驗(yàn)考察,發(fā)現(xiàn)觸發(fā)、測(cè)試速度和測(cè)試深度為主要影響因素,因此分別對(duì)其進(jìn)行考察,以期建立質(zhì)構(gòu)儀評(píng)價(jià)厚樸軟化程度的方法。
測(cè)時(shí)速度考察:固定觸發(fā)力與測(cè)試深度,測(cè)試速度水平為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mm/s,進(jìn)行測(cè)時(shí)速度的單因素考察,各水平重復(fù)測(cè)定6次,結(jié)果平均硬度值分為:633.0、922.8、1 122.2、1 327.8、15 221.7 g,RSD依次為9.9%、5.8%、4.5%、6.9%、10.0%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同參數(shù)水平的測(cè)時(shí)速度對(duì)平均硬度值略有影響,測(cè)時(shí)速度越快,平均硬度值越大,RSD差異明顯,呈先減少后增大的趨勢(shì)。測(cè)時(shí)速度為1.5 mm/s時(shí),RSD值最小,因此測(cè)時(shí)速度設(shè)置為1.5 mm/s。
測(cè)試深度考察:固定觸發(fā)力與測(cè)時(shí)速度,測(cè)試深度水平為6、8、10、12、14 mm,進(jìn)行測(cè)試深度的單因素考察,各水平重復(fù)測(cè)定6次,結(jié)果平均硬度值分為:583.3、943.3、1 073.7、1 157.3、1 302.8 mm,RSD依次為22.6%、7.1%、6.1%、19.7%、12.8%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同參數(shù)水平的測(cè)時(shí)速度對(duì)平均硬度值影響較大,測(cè)試深度越大,平均硬度值越大,RSD差異明顯。測(cè)試深度為10 mm時(shí),RSD值最小,因此測(cè)試深度設(shè)置為10 mm。
觸發(fā)力考察:固定測(cè)試深度與測(cè)時(shí)速度,觸發(fā)力水平為1、2、4、6、8 g,進(jìn)行觸發(fā)力的單因素考察,各水平重復(fù)測(cè)定6次,結(jié)果平均硬度值分為:1 014.0、1 128、1 334、1 705、1 851.3 g,RSD依次為8.0%、6.6%、6.3%、8.0%、22.0%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同參數(shù)水平的測(cè)時(shí)速度對(duì)平均硬度值影響較大,觸發(fā)力越大,平均硬度值越大,RSD差異明顯。觸發(fā)力為4 g時(shí),RSD值最小,因此觸發(fā)力設(shè)置為4 g。通過對(duì)質(zhì)構(gòu)儀測(cè)試條件的優(yōu)化,確定最終測(cè)試參數(shù)為:測(cè)試速度1.5 mm/s,測(cè)試深度10 mm,觸發(fā)力4 g??色@得物性指標(biāo)有:樣品硬度、壓縮循環(huán)功、粘力、粘性、膠著性等。
1.3.3 潤(rùn)制過程指標(biāo)成分變化考察
將“1.3.1.1”項(xiàng)下20℃下不同時(shí)間的厚樸小檔樣品分別取出,切絲,干燥,參照《中國(guó)藥典》含量測(cè)定方法,分別測(cè)定各樣品厚樸酚與和厚樸酚的含量[10]。
2.1.1 吸水率變化曲線
以潤(rùn)制時(shí)間為橫坐標(biāo),吸水率為縱坐標(biāo)作圖,繪制吸水率變化曲線(見圖1)。
圖1 10 ℃(A)、20 ℃(B)、30 ℃(C)厚樸吸水率變化曲線(n = 3)
2.1.2 潤(rùn)制過程中水分相態(tài)和分布狀態(tài)的變化
通過連續(xù)分布的CPMG弛豫曲線的多指數(shù)擬合獲得的T2分布如圖2所示,每條曲線是3個(gè)樣本的9次獨(dú)立測(cè)量的平均值。T2圖譜是測(cè)量H質(zhì)子弛豫時(shí)間與信號(hào)幅度得到的圖譜,橫向的弛豫時(shí)間代表水分的自由度,H質(zhì)子受束縛力越大或自由度越小,T2時(shí)間越短;束縛力越小或自由度越大,T2時(shí)間越長(zhǎng)。厚樸T2譜圖上主要存在2種相態(tài)的水,其中T21(0.01~1 ms)代表結(jié)合水,T22(1~100 ms)代表自由水[13]。由圖2,表1可知,在潤(rùn)制前,厚樸中T2圖主要呈現(xiàn)的是T21峰,T21峰占比為92.82%,T22峰占比為7.18%,表明此時(shí)厚樸中以結(jié)合水為主,隨著潤(rùn)制時(shí)間增加,T22峰面積快速增加且與T21峰黏連,表明此階段主要增加的是自由水??偡迕娣e可以反映厚樸中水分含量的變化,隨著潤(rùn)制時(shí)間增加,總峰面積不斷呈上升趨勢(shì),表明厚樸內(nèi)的水分含量在快速增加,此結(jié)果與吸水動(dòng)力學(xué)結(jié)果一致。隨著潤(rùn)制時(shí)間的增加,T2時(shí)間逐漸變大,表明厚樸中水分自由度變大,流動(dòng)性增加。
圖2 厚樸不同潤(rùn)制時(shí)間的T2譜
表1 厚樸潤(rùn)制過程中T21、T22和峰面積(A)的變化(n = 3)
2.1.3 潤(rùn)制過程中MRI圖像變化
利用MRI成像技術(shù)可以直觀地觀察樣品內(nèi)部水分信息,H質(zhì)子數(shù)量可以代表樣品中的水分含量[13]。而所成圖像的顏色表示H質(zhì)子密度的高低,隨著成像顏色由藍(lán)色向綠色再向紅色的轉(zhuǎn)變,表示該處水分含量呈增加狀態(tài),顏色越藍(lán)含水量越低,顏色越紅含水量越高。由圖3可知,干樣狀態(tài)的厚樸水分含量較低,幾乎不能被檢識(shí);隨著潤(rùn)制時(shí)間的增加,水分由表皮向內(nèi)滲透,成像越來越清晰并出現(xiàn)紅色區(qū)域,8 h后厚樸內(nèi)部大部分呈綠色,顏色也趨向均勻,此時(shí)與“軟硬適宜、內(nèi)外一致,內(nèi)無干心”的傳統(tǒng)判斷標(biāo)準(zhǔn)一致。表明MRI成像技術(shù)與傳統(tǒng)的終點(diǎn)判斷方法有良好的相關(guān)性,可以作為指示潤(rùn)制終點(diǎn)的新方法。
圖3 厚樸不同潤(rùn)制時(shí)間MRI圖像
厚樸潤(rùn)制過程中樣品硬度、壓縮循環(huán)功、粘力、粘性、膠著性測(cè)定結(jié)果見表2;同時(shí),以穿刺時(shí)間X(s)為橫坐標(biāo),穿刺針移動(dòng)過程中的硬度Y(g)為縱坐標(biāo),繪制質(zhì)構(gòu)曲線,見圖4。由表2、圖4可知,吸水后厚樸質(zhì)地隨著潤(rùn)制時(shí)間的增加會(huì)發(fā)生顯著變化,各物性指標(biāo)均明顯下降,但8 h之前,藥材仍切制困難,內(nèi)有干心,8 h時(shí)硬度降為569 g,壓縮循環(huán)功降為31 900 kJ,此時(shí)便于切制,切開后斷面無干心,與“軟硬適宜、內(nèi)外一致,內(nèi)無干心”的傳統(tǒng)判斷標(biāo)準(zhǔn)一致,表明物性指標(biāo)可作為判斷厚樸潤(rùn)制終點(diǎn)的客觀標(biāo)準(zhǔn)。
表2 不同潤(rùn)制時(shí)間厚樸的質(zhì)構(gòu)特性(n=3)
圖4 不同潤(rùn)制時(shí)間厚樸的質(zhì)構(gòu)曲線
厚樸潤(rùn)制過程中指標(biāo)成分含量變化情況見圖5和圖6。
0 h是對(duì)照組,其他不同潤(rùn)制時(shí)間樣品與0 h進(jìn)行對(duì)比,由圖5和圖6可知不同潤(rùn)制時(shí)間樣品的指標(biāo)成分含量與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.05),且潤(rùn)制的時(shí)間越長(zhǎng),其顯著性差異越大,說明潤(rùn)制過程中會(huì)導(dǎo)致指標(biāo)成分流失,且潤(rùn)制時(shí)間越長(zhǎng),流失越多。
圖5 不同潤(rùn)制時(shí)間和厚樸酚含量變化圖
圖6 不同潤(rùn)制時(shí)間厚樸酚含量變化圖
選取大中小檔厚樸藥材各三份,每份300 g,按照“1.3.1.1”項(xiàng)下潤(rùn)制方法在不同溫度下進(jìn)行潤(rùn)制,潤(rùn)透后,按照“1.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)厚樸的質(zhì)構(gòu)特性。驗(yàn)證結(jié)果見表3。由表3結(jié)果可知厚樸大中小檔達(dá)到潤(rùn)制終點(diǎn)時(shí)的吸水率在30%~50%,硬度值<600 g,表明吸水率和硬度可作為確定潤(rùn)制終點(diǎn)的重要客觀指標(biāo)。
表3 厚樸潤(rùn)制過程驗(yàn)證試驗(yàn)(n=3)
利用SPSS軟件對(duì)厚樸潤(rùn)制過程中的吸水率、水分相態(tài)、質(zhì)構(gòu)特性和指標(biāo)成分含量進(jìn)行皮爾遜雙變量相關(guān)性分析(見表4)。
表4 吸水率、水分相態(tài)、質(zhì)構(gòu)特性和指標(biāo)成分含量的相關(guān)性分析
由表4可知,潤(rùn)制時(shí)間、吸水率、自由水和束縛水含量之間具有顯著的正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別在0.882~0.993;硬度、壓縮功和指標(biāo)成分含量之間具有顯著的正相關(guān),相關(guān)系數(shù)在0.885~0.992;潤(rùn)制時(shí)間、吸水率、自由水含量、束縛水含量與硬度、壓縮循環(huán)功之間具有顯著的負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)在0.803~0.993。潤(rùn)制時(shí)間、吸水率、水分相態(tài)、質(zhì)構(gòu)特性和指標(biāo)成分含量之間均有極顯著的相關(guān)性,說明采用LF-NMR/MRI技術(shù)和質(zhì)構(gòu)儀可以較好表征潤(rùn)藥過程的特點(diǎn),考察的指標(biāo)能合理的反映飲片質(zhì)量。
干燥的皮類藥材切制成飲片必須經(jīng)過潤(rùn)制,潤(rùn)制的目的主要是使藥材吸收一定量的水分,使藥材質(zhì)地由硬變軟便于切制[14]。在中醫(yī)臨床調(diào)配處方或中成藥生產(chǎn)必須使用飲片,厚樸藥材經(jīng)潤(rùn)制后切制成細(xì)絲狀飲片。如未潤(rùn)制或潤(rùn)制不充分,厚樸藥材硬度大,無法切制成絲,或潤(rùn)制傷水,有效成分大量流失,影響臨床療效,因此,對(duì)厚樸潤(rùn)制過程的研究至關(guān)重要。而傳統(tǒng)潤(rùn)藥終點(diǎn)的確定多以主觀感受來判斷,缺乏客觀評(píng)判指標(biāo),對(duì)操作者的經(jīng)驗(yàn)要求極高。本文將吸水率、水分分布MRI圖、質(zhì)構(gòu)特性作為潤(rùn)制終點(diǎn)判斷的重要指標(biāo),使?jié)欀平Y(jié)果不依賴人為主觀判斷,更加科學(xué)準(zhǔn)確,可為智能化潤(rùn)藥機(jī)的開發(fā)提供參考和數(shù)據(jù)支持。
從厚樸吸水實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,潤(rùn)制溫度越高,潤(rùn)透時(shí)間越短,吸水率越大,可能是因?yàn)闇囟仍礁撸肿舆\(yùn)動(dòng)速率越快,滲入藥材的速度也越快,進(jìn)而導(dǎo)致藥材軟化速度加快,藥材吸收的水分也就越多;檔次越小,潤(rùn)透時(shí)間越短,吸水率越大,除了與不同檔次厚樸大小差異有關(guān)外,還可能與其生長(zhǎng)年限不同而出現(xiàn)的質(zhì)地差異有關(guān),通常生長(zhǎng)年限越長(zhǎng),木質(zhì)化程度越高[15],進(jìn)而影響潤(rùn)制時(shí)的吸水能力。
LF-NMR/MRI技術(shù)可監(jiān)控厚樸潤(rùn)制過程中自由水與束縛水的組成變化,直觀顯示水分由外而內(nèi)的動(dòng)態(tài)遷移行為,MRI成像技術(shù)可直觀顯示水分在藥材中的分布,可直接判斷藥材軟化程度,且與傳統(tǒng)的終點(diǎn)判斷方法有良好的相關(guān)性,可以作為指示潤(rùn)制終點(diǎn)的新方法。質(zhì)構(gòu)特性研究表明,不同潤(rùn)制時(shí)間的厚樸硬度、粘力、膠著性、壓縮循環(huán)功等物性指標(biāo)與潤(rùn)制程度密切相關(guān)且具有明顯的差異,表明實(shí)時(shí)監(jiān)控厚樸潤(rùn)制過程中物性指標(biāo)的變化趨勢(shì),可作為判斷潤(rùn)制終點(diǎn)的重要參考指標(biāo)。這兩種現(xiàn)代技術(shù)可作為潤(rùn)藥過程水分控制和藥材軟化程度評(píng)價(jià)的重要手段。
目前,潤(rùn)藥機(jī)只具備單一的潤(rùn)藥功能,對(duì)潤(rùn)制過程藥材的軟化程度不能控制,缺乏在線檢測(cè)系統(tǒng),LF-NMR/MRI與物性分析技術(shù)可對(duì)軟化程度進(jìn)行評(píng)價(jià),未來將LF-NMR/MRI與物性分析技術(shù)應(yīng)用在潤(rùn)藥機(jī)的在線檢測(cè)設(shè)備中,可實(shí)現(xiàn)智能化潤(rùn)制。
本文采用LF-NMR/MRI、質(zhì)構(gòu)儀等現(xiàn)代技術(shù)對(duì)厚樸潤(rùn)制過程中吸水率、水分相態(tài)與遷移行為、質(zhì)構(gòu)特性變化和指標(biāo)成分含量進(jìn)行了客觀表征和動(dòng)態(tài)檢測(cè),直觀表征了厚樸潤(rùn)制過程,分析了影響潤(rùn)制工藝的關(guān)鍵因素,為闡明厚樸潤(rùn)制傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)內(nèi)涵和優(yōu)選潤(rùn)制工藝提供了科學(xué)依據(jù),為厚樸潤(rùn)制工藝優(yōu)化和終點(diǎn)判斷提供了重要的評(píng)價(jià)指標(biāo),也為其他皮類藥材的潤(rùn)制研究提供了參考借鑒。