鹽酸小檗堿明膠微球的制備及其性能表征

楊紅艷，周中流，夏加亮

1嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院；2粵西特色生物醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心，湛江 524048

鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride，BH)又稱為黃連素，是一種黃色結(jié)晶粉末，味道極苦，具有抗癌、抗菌、降血糖、降膽固醇、舒張血管等作用[1-3]。因其具有顯著的抑菌作用，常用來治療細(xì)菌性痢疾、胃腸炎等疾病，療效確切[4]。但其味極苦，患者依從性差，將其制成微球可改善藥物口感、掩蓋其苦味，還能減小鹽酸小檗堿對胃黏膜的刺激[5]。明膠微球以其生物可降解、低毒等優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于藥物新劑型的研究[6]。微球制劑還具有緩釋、提高穩(wěn)定性、掩味和靶向作用[7,8]。本實(shí)驗(yàn)以乳化-化學(xué)交聯(lián)固化法將鹽酸小檗堿制成親水明膠微球，并優(yōu)化制備工藝，進(jìn)行表征分析，考察釋放性能，以期為相關(guān)制劑的研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司)；T9紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；DL-5M低速冷凍離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；BT25S電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；GWA-UP1-F超純水器(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；X’pert Pro MPD X射線衍射儀(PANalytical儀器有限公司)；Nicolet6700傅里葉變換紅外光譜分析儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；STA 6000綜合熱分析儀(美國PerkinElmer公司)；XL-30掃描電子顯微鏡(荷蘭PHILIPS儀器有限公司)；WJL-602型激光粒度分析儀(上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司)；RCZ-6C3藥物溶出度儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿(四川協(xié)力制藥有限公司，批號：C025A131109)；鹽酸小檗堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-201613)；明膠(生化試劑，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；Span-80(脂肪酸山梨坦)(化學(xué)純，廣東光華化學(xué)廠有限公司)；液狀石蠟(化學(xué)純，廣州化學(xué)試劑)；異丙醇(分析純，廣東光華科技股份有限公司，批號：20171226)；25%戊二醛溶液(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，廣東光華科技股份有限公司)；KBr(光譜純，Aladdin)；超純水(自制)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿明膠微球的制備

稱取適量過100目篩的鹽酸小檗堿置于乳缽中，加入適量60 ℃的12%明膠水溶液研磨制成藥物明膠混懸液，再與剩余的明膠溶液混合均勻，保溫。然后用注射器將混懸液緩慢滴入一定攪拌速度的含Span-80的液體石蠟中(50 ℃恒溫)，制成穩(wěn)定的W/O型乳劑。立即置于0～4 ℃冰浴降溫，攪拌10 min，加入適量25%戊二醛溶液，低速攪拌交聯(lián)固化1 h，靜置，在3 500 r/min下離心沉降，用異丙醇離心洗滌3次，抽濾，再用異丙醇洗滌至無戊二醛氣味，抽干去除殘余異丙醇，50 ℃下干燥即得鹽酸小檗堿微球。

2.2 鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Pgranfsil-STC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈:0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液=40∶60(以磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5)；檢測波長：266 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃。色譜圖見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿HPLC色譜圖

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品11.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液(0.11 mg/mL)。從中精密量取1.0 mL置于10 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿明膠微球約0.05 g，置于25 mL量瓶中，加入6 mg/mL胰蛋白酶溶液3 mL[9]，密塞，置于40 ℃恒溫水浴鍋酶解4 h，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，取1.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備

取空白明膠微球按照“2.2.3”項(xiàng)下的供試品溶液處理方法制備得陰性樣品溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密量取鹽酸小檗堿對照品貯備溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，按照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件，各精密吸取20 μL注入液相色譜儀，以峰面積積分值(Y)對鹽酸小檗堿溶液質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得線性方程Y=67 729X-24 314(R2=0.999 6)，表明鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在11～55 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，分別測定其峰面積，得出RSD值為1.70%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新制備的供試品溶液于0、2、4、6、12、24 h，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件，進(jìn)樣20 μL，測定鹽酸小檗堿的峰面積，得出RSD值為0.82%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批鹽酸小檗堿明膠微球，精密稱取5份，按“2.2.3”項(xiàng)下操作制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件，進(jìn)樣20 μL，測定其峰面積，分別計(jì)算鹽酸小檗堿含量，并計(jì)算得出RSD值為1.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的鹽酸小檗堿明膠微球樣品0.05 g，稱取9份，分為三組，每組分別加入相當(dāng)于鹽酸小檗堿含量80%、100%、120%的對照品，按“2.2.3”項(xiàng)方法制備，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，其鹽酸小檗堿的平均加樣回收率為101.33%，RSD值為2.08%，表明該法準(zhǔn)確度高。

2.2.10 檢測限與定量限

依照ICH指導(dǎo)原則Q2(R1)中信噪比(S/N)法分別確定鹽酸小檗堿的檢測限與定量限。取濃度為11 μg/mL對照品溶液加甲醇逐級稀釋，在建立的色譜條件下進(jìn)樣分析，按S/N≥3確定檢測限濃度，測得檢測限為0.011 μg/mL；按S/N≥10確定定量限濃度，測得定量限為0.055 μg/mL。

2.3 包封率與載藥量及粒徑測定

2.3.1 包封率與載藥量測定

取適量鹽酸小檗堿明膠微球，按照“2.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，并依據(jù)以下公式計(jì)算載藥量和包封率。

2.3.2 粒徑測定

將制備得到的鹽酸小檗堿明膠微球，于研缽中研磨后過100目篩，取適量微球，分散于超純水中，用WJL-602型激光粒度分析儀測定其粒徑。

2.4 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方設(shè)計(jì)

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)(單因素試驗(yàn))結(jié)果，選取對鹽酸小檗明膠微球性質(zhì)影響較為顯著的3個因素，即明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、投藥量(%，藥物在藥膠中的質(zhì)量分?jǐn)?shù))(B)、油水比值(C)，以包封率(Y1)、載藥量(Y2)作為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，其因素水平見表1，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.4.2 模型擬合及方差分析結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行擬合，得回歸方程為：Y1=-72.786+4.531A+2.453B+27.614C-0.365AB+0.374AC-0.309BC+0.164A2+0.088B2-2.572C2(R2=0.864 0，P=0.023 5)；Y2=-39.246+2.772A+1.789B+4.728C-0.017 8AB-0.098 8AC+0.014 5BC-0.067 7A2-0.020 0B2-0.391C2(R2=0.983 2，P<0.000 1)。由二項(xiàng)式擬合方程可知，所得模型相關(guān)性好，模型P值均小于0.05，且失擬項(xiàng)P值均大于0.05，說明建立的模型擬合度較高，能用于分析和預(yù)測響應(yīng)值。由表3、表4回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，對包封率Y1的影響大小順序如下：A>B>C；對載藥量Y2的影響大小順序如下：B>A>C。一次項(xiàng)A、B對Y1、Y2均有顯著影響(P<0.01)，除模型Y1中AB交互作用P<0.05有顯著影響外，其余因素間的交互作用P值均大于0.05，說明交互作用均不顯著。

表3 包封率回歸模型方差分析結(jié)果

表4 載藥量回歸模型方差分析結(jié)果

2.4.3 效應(yīng)面優(yōu)化及工藝驗(yàn)證

繪制較顯著的2個因素(A、B)對包封率和載藥量的三維響應(yīng)面圖見圖2、3。通過Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行處方的優(yōu)化組合，得包封率和載藥量的最優(yōu)處方均為：明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，投藥量為25%，油水比值為4.79；包封率預(yù)測值為69.71%，載藥量預(yù)測值為20.90%。按最優(yōu)處方制備3批鹽酸小檗堿明膠微球，測定其載藥量、包封率、粒徑，結(jié)果見表5。按誤差=(預(yù)測值-平均值)/預(yù)測值×100%，將實(shí)測值與模型預(yù)測值對比，其包封率與載藥量的誤差分別為4.45%、2.87%，均小于5%，說明所建模型具有較好的預(yù)測能力，優(yōu)化工藝處方穩(wěn)定可靠。

圖2 明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)和投藥量對包封率的響應(yīng)面圖

圖3 明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)和投藥量對載藥量的響應(yīng)面圖

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.5 鹽酸小檗堿明膠微球性能表征

2.5.1 掃描電子顯微鏡(SEM)

取適量明膠微球置于燒杯中，加入適量的乙醇，超聲分散10 min后用滴管均勻滴加到銅臺雙面膠帶上，自然揮干后噴金，采用掃描電子顯微鏡觀察，結(jié)果見圖4。由圖可知，微球形態(tài)圓整，表面相對光滑，大小均勻，有稍許黏連現(xiàn)象。

圖4 鹽酸小檗堿明膠微球掃描電鏡圖

2.5.2 紅外光譜分析(FT-IR)

將鹽酸小檗堿、空白明膠微球、載藥明膠微球、物理混合物分別置于研缽中研磨，KBr壓片處理后，采用傅里葉變換紅外光譜分析儀，在4 000～400 cm-1掃描范圍分別進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果見圖5。由圖5D曲線可知，鹽酸小檗堿在1 389 cm-1和1 505 cm-1處具有苯環(huán)的特征峰，在1 231 cm-1處具有C-O-C的特征峰[10，11]；由圖5A曲線可知，明膠在2 959、2 925和2 855 cm-1處具有氨基的特征峰；由圖5B曲線可知，物理混合物可見明顯的鹽酸小檗堿、空白明膠微球特征峰疊加，說明物理混合物中鹽酸小檗堿以原型藥物形式存在；而由圖5C曲線可見，鹽酸小檗堿的特征峰明顯消失，只存在明膠的特征峰，說明制備成鹽酸小檗堿明膠微球后，藥物進(jìn)入微球內(nèi)部，制備過程中藥物與載體材料之間未發(fā)生明顯的相互作用。

圖5 鹽酸小檗堿明膠微球紅外分析圖譜

2.5.3 X射線-粉末衍射分析(XRD)

由鹽酸小檗堿、空白明膠微球、物理混合物和鹽酸小檗堿明膠微球的XRD圖(見圖6)可見，鹽酸小檗堿在9.19°、25.47°和26.35°處有尖銳、狹窄的衍射峰[12,13]；空白明膠微球只在20°附近有一個較寬的特征峰；物理混合物的XRD圖中明顯出現(xiàn)了鹽酸小檗堿的特征衍射峰，說明物理混合物中鹽酸小檗堿是以原晶型形式存在的；而載藥明膠微球的XRD圖中除了在25.47°處有鹽酸小檗堿的特征衍射峰外，其余均被明膠微球特征圖譜掩蓋，說明鹽酸小檗堿制備成明膠微球后大部分分散在微球內(nèi)部，少量分散粘在微球表面。

圖6 鹽酸小檗堿明膠微球X射線衍射圖譜

2.5.4 差示掃描量熱法及熱重分析(DSC&TG)

分別取鹽酸小檗堿、空白明膠微球、物理混合物和鹽酸小檗明膠堿微球少量，于STA 6000綜合熱分析儀在條件為10 ℃/min，氮?dú)鈿夥罩羞M(jìn)行分析，結(jié)果見圖7。由圖7A的TG曲線及DSC曲線可知，鹽酸小檗堿在40～120 ℃溫度范圍內(nèi)存在兩個失重區(qū)域，其中40～70 ℃為游離水的失重區(qū)域，70～120 ℃為結(jié)晶水的失重區(qū)域；在170～240 ℃溫度范圍內(nèi)也存在兩個失重區(qū)域，為鹽酸小檗堿的晶形熔融分解而失重，由DSC曲線可推測鹽酸小檗堿的熔點(diǎn)為190 ℃及210 ℃，因此該鹽酸小檗堿原料藥為熔點(diǎn)190 ℃和210 ℃兩種晶形的混合物，其以190 ℃晶形為主[14]。由圖7C物理混合物的DSC曲線可知，同時具有鹽酸小檗堿190 ℃、210 ℃熔融峰和空白微球的230 ℃熔融峰，說明物理混合物中鹽酸小檗堿是以原晶型的形式存在的。由圖7D鹽酸小檗堿微球的DSC曲線可知，鹽酸小檗堿在190 ℃的晶型熔融峰明顯消失，只在210 ℃有微弱的晶型熔融峰，結(jié)合X衍射分析結(jié)果可以判斷，鹽酸小檗堿在明膠微球中主要是無定型狀態(tài)。

圖7 DSC和TG分析曲線

2.5.5 體外釋放考察[15]

參照2020年版《中國藥典》四部0931溶出度與釋放度測定法第二法(槳法)。精密稱取適量鹽酸小檗堿微球分別置于500 mL pH值為2.5和7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，于溫度(37士0.5)℃，轉(zhuǎn)速100 r/min的條件下，分別在0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取樣5 mL，同時補(bǔ)充相同體積新鮮介質(zhì)，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算累積釋放率，繪制累積釋藥曲線見圖8，并分別以零級、一級、Higuchi模型進(jìn)行釋藥曲線擬合，結(jié)果見表6、表7。由模型擬合結(jié)果可知，鹽酸小檗堿及明膠微球在兩種釋放介質(zhì)中均與一級動力學(xué)模型擬合度高，其次是Higuchi模型；由Higuchi模型相關(guān)系數(shù)可知，明膠微球的藥物釋放Higuchi模型擬合度均高于游離藥物，且在酸性條件下擬合度更好，說明鹽酸小檗堿藥物的釋放主要受溶出的影響，而微球中藥物的釋放同時受Fick擴(kuò)散的影響，且在酸性條件下受Fick擴(kuò)散影響更大，再結(jié)合圖8可知，鹽酸小檗堿明膠微球在酸性條件下(pH2.5)的磷酸鹽緩沖溶液中釋放較緩；在兩種pH條件下鹽酸小檗堿0.5 h藥物釋放達(dá)40%左右，4 h后藥物釋放達(dá)90%以上，而鹽酸小檗堿明膠微球0.5 h藥物釋放小于20%，12 h藥物累積釋放可達(dá)90%以上，說明明膠微球?qū)}酸小檗堿具有一定的緩釋作用。

圖8 鹽酸小檗堿明膠微球體外釋藥曲線

表6 在pH2.5的磷酸鹽緩沖溶液中的釋藥曲線擬合結(jié)果(n=3)

表7 在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中的釋藥曲線擬合結(jié)果(n=3)

3 討論與結(jié)論

本研究采用乳化-化學(xué)交聯(lián)法制備鹽酸小檗堿微球，其載藥量為19.97%，包封率為67.71%，體外釋藥顯示藥物釋放較為緩慢。DSC、XRD和紅外光譜分析顯示，微球中鹽酸小檗堿以無定型形式存在，但微球表面含有少量鹽酸小檗堿。掃描電鏡觀察微球外貌形態(tài)發(fā)現(xiàn)微球圓整光滑，大小均勻但有黏連現(xiàn)象，可能與干燥方法、干燥溫度、干燥速度等因素有關(guān)，下一步研究將進(jìn)行干燥條件考察，以改善明膠微球的外觀形態(tài)，提高微球質(zhì)量。

在制備過程中選取合適的乳化劑、交聯(lián)劑對明膠微球的圓整度、大小等有較大影響。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)span-80作為乳化劑乳化效果優(yōu)于Twen-80及混合乳化劑，可得到圓整度較好的微球，故選用span-80為乳化劑。明膠微球常用的交聯(lián)固化劑有甲醛和戊二醛，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)考察發(fā)現(xiàn)戊二醛為交聯(lián)固化劑得到的微球粒徑小且圓整，而甲醛使制備的微球有較大黏連，圓整度差；且用戊二醛為固化劑不要調(diào)節(jié)pH值，可在中性條件下反應(yīng)，操作簡便，故選擇戊二醛為交聯(lián)固化劑。

采用乳化-化學(xué)交聯(lián)法制備鹽酸小檗堿明膠微球，方法簡單可行，只需一種囊材，明膠可生物降解、低毒、價廉易得，制備得到的鹽酸小檗堿明膠微球載藥量大，包封率較高，穩(wěn)定性好，具有較好的應(yīng)用前景。