基因工程菌Streptomyces bingchenggensis BCJ60的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

李建宋，李 亞，郝之奎，張明濤，王繼棟，向文勝

1臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)與制藥工程學(xué)院；2浙江海正藥業(yè)股份有限公司，臺(tái)州 318000；3湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖州 313000；4東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030

聚酮類化合物主要是由聚酮合酶催化將低級(jí)羧酸通過連續(xù)的縮合反應(yīng)產(chǎn)生的一類天然產(chǎn)物，包括大環(huán)內(nèi)酯、四環(huán)素、蒽醌和聚醚等[1，2]。從藥理學(xué)的角度來看，聚酮類化合物是新型藥物的重要來源，主要用作抗生素、免疫抑制劑、抗寄生蟲、降膽固醇和抗腫瘤藥物[3]。聚酮合酶每個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能都與最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，因而，可以利用這種對(duì)應(yīng)關(guān)系來編輯生物合成基因，從而設(shè)計(jì)合成產(chǎn)物，由此產(chǎn)生出一個(gè)嶄新的研究領(lǐng)域——聚酮合酶的組合生物學(xué)[4]。學(xué)者們主要通過減少、增加或者替換聚酮合酶的模塊及模塊中的結(jié)構(gòu)域來組合產(chǎn)生新的產(chǎn)物，如通過對(duì)鏈霉菌Streptomycesavermitilis中聚酮合酶基因簇aveLAT-ACP進(jìn)行改造獲得一株基因工程菌，從該工程菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離獲得兩個(gè)新的阿維菌素衍生物25-甲基伊維菌素和25-乙基伊維菌素[5]。

本課題組在前期的研究中，對(duì)冰城鏈霉菌StreptomycesbingchenggensisBC-120-4中編碼聚酮合酶的milF基因進(jìn)行改造得到基因工程菌株StreptomycesbingchenggensisBCJ60，該菌株不能編碼C-5酮基還原酶，從而阻斷米爾貝霉素 A3/A4/B2/B3的合成[6]。通過基因定向改造，生物合成基因簇發(fā)生改變，有可能激活了某些生物合成途徑得到新的代謝產(chǎn)物。因此，本研究主要對(duì)基因工程菌株StreptomycesbingchenggensisBCJ60的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，以期獲得具有應(yīng)用價(jià)值的高效殺蟲抗生素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀Agilent 1260(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；超導(dǎo)核磁共振儀Bruber AVANCE-400(德國(guó)Bruker公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE2000(上海亞榮儀器有限公司)；發(fā)酵罐100 L(上海保興生物設(shè)備有限公司)；凝膠Sephadex LH-20(美國(guó)Pharmacia 公司)；正相硅膠(100～200目)(青島海洋化工廠)；薄層層析(TLC)用硅膠板(煙臺(tái)新諾化工有限公司)；甲醇、乙醇、二氯甲烷等試劑均為分析純，購(gòu)于臺(tái)州市椒江中西化工有限公司；酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、大豆餅粉等培養(yǎng)基購(gòu)于中國(guó)新興化工試劑研究所；NaCl、KNO3等無機(jī)鹽購(gòu)于浙江臨安化工試劑廠。

1.2 菌株來源

基因工程菌株StreptomycesbingchenggensisBCJ60，由本實(shí)驗(yàn)室保存，該菌株是由冰城鏈霉菌Streptomycesbingchenggensis經(jīng)誘變和基因改造獲得[6]。

1.3 菌株培養(yǎng)

1.3.1 斜面培養(yǎng)

培養(yǎng)基組成：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，接種后在28 ℃下培養(yǎng)7天。

1.3.2 種子培養(yǎng)

培養(yǎng)基組成：蔗糖10 g，脫脂奶粉1 g，酵母提取物5 g，蛋白胨3.5 g，K2HPO40.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。用1 000 mL的三角瓶每瓶分裝250 mL的上述培養(yǎng)基。向長(zhǎng)有孢子的斜面上，加入9 mL無菌水，用無菌的接種鏟刮下培養(yǎng)基表面的孢子制成孢子懸浮液接于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28 ℃，250 rpm震蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

培養(yǎng)基組成：黃豆餅粉20 g，蔗糖80 g，脫脂奶粉1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，K2HPO4·3H2O 1 g，CaCO33 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。采用100 L發(fā)酵罐，按8%接種量，將種子液接入到100 L發(fā)酵罐中(60 L培養(yǎng)基)，28 ℃，100 r/min震蕩培養(yǎng)6～7天。

1.4 提取、分離與鑒定

發(fā)酵液60 L經(jīng)離心得到菌絲體12 L，菌絲體用去離子水洗滌后再用40 L甲醇浸提兩次，每次攪拌4 h，過濾合并甲醇浸提液，50 ℃減壓濃縮至干，得到52.0 g油狀物質(zhì)。將所得的油狀物質(zhì)上硅膠(100～200目)層析，石油醚∶丙酮 = 100∶0→60∶40(V/V)梯度洗脫，流速30 mL/min，收集洗脫液，每份250 mL，薄層層析(TLC)檢測(cè)(石油醚∶丙酮 = 2∶1)，得到四個(gè)組分Fr.1～4。Fr.1(12.5 g)上凝膠Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇 = 1∶1)層析獲得化合物3(7.5 mg)、4(6.8 mg)、5(8.3 mg)和6(7.9 mg)。Fr.2(9.7 g)上凝膠Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇 = 1∶1)得到含有化合物1和2的混合物，進(jìn)一步上Agilent 1260高壓液相色譜層析，色譜柱Agilent Zorbax SB C3 column(5 μm，250 mm× 9.4 mm)，洗脫劑甲醇∶乙腈∶水 = 42∶42∶16(V/V/V)，流速1.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)λ= 240 nm，得到化合物1(9.5 mg，tR= 19.4 min)和化合物2(8.3 mg，tR= 23.2 min)。Fr.3(8.3 g)上凝膠Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇 = 1∶1)層析獲得化合物7(6.3 mg)、8(7.3 mg)和9(6.7 mg)。Fr.4(5.6 g)經(jīng)反向硅膠柱色譜梯度洗脫(甲醇∶水 = 30%→90%)得到化合物10(6.5 mg)和11(8.4 mg)?；衔锝Y(jié)構(gòu)采用一維、二維核磁共振、質(zhì)譜、高分辨質(zhì)譜等波譜學(xué)方法以及對(duì)比文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定。

1.5 殺蟲活性測(cè)試

1.5.1 殺螨蟲活性測(cè)試

將化合物用甲醇溶解，用含0.01%表面活性劑烷基酚聚氧乙烯醚的水稀釋10倍，制成100 mg/mL的溶液，再依次稀釋得到1、0.5、0.25、0.1、0.05和0.025 mg/mL的溶液作為樣品溶液。將對(duì)有機(jī)磷類殺蟲藥敏感的朱砂葉螨接種到豇豆的初生葉上。接種一天后，將豇豆的葉子浸泡在樣品溶液中1～2 s。將葉子在25 ℃放置3天后，用顯微鏡觀察存活成蟲的個(gè)數(shù)，計(jì)算死亡率(%)。設(shè)置對(duì)照組，以米爾貝霉素A3和A4(30∶70，V/V)作為陽性對(duì)照。

1.5.2 殺線蟲活性測(cè)試

將化合物用甲醇溶解，再用水稀釋成100 mg/mL的溶液，再依次稀釋得到10、5、2、1、0.5、0.25、0.1和0.05 mg/mL的溶液。分別取不同濃度溶液10 μL加入到90 μL含活松材線蟲水懸液中?；旌弦赫鹗幒笤?5 ℃放置15 h。在顯微鏡下計(jì)數(shù)不動(dòng)線蟲的數(shù)量和測(cè)試線蟲的總數(shù)，計(jì)算測(cè)試線蟲的死亡率(%)。設(shè)置對(duì)照組，以米爾貝霉素A3和A4(30∶70，V/V)作為陽性對(duì)照。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理

以上每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果取平均值。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0計(jì)算半數(shù)致死量LC50(mg/L)，Student’st-test檢驗(yàn)P值，觀察與陽性對(duì)照米爾貝霉素A3/A4的活性差異，如果P>0.05則認(rèn)為無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)

在NOESY譜中H-2/H-4存在氫氫遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，說明H-2和H-4空間朝向一致；H-3/H3-26存在氫氫遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)，說明H-3和H3-26空間朝向一致；H-10和H-11之間較大的耦合常數(shù)(δH14.3 Hz)以及H3-27/H-10，H3-29/H2-16之間NOESY信號(hào)表明C-8/C-9，C-10/C-11，C-14/C-15是三個(gè)反式雙鍵；H-17/H-25，H3-30/H-25，H-17/H-19之間的NOESY信號(hào)表明H-17、H-19、H-25和H-30有相同的空間朝向。C-6、C-7、C-12和C-21位手性中心的相對(duì)構(gòu)型通過與5-oxomilbemycin A3對(duì)比確認(rèn)。

圖2 化合物1和2的主要1H-1H COSY和HMBC相關(guān)信號(hào)

圖3 化合物1的主要NOESY相關(guān)信號(hào)

表1 化合物1和2的1H和13C NMR數(shù)據(jù)

化合物3白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z509.1[M-H]-，分子式為C31H42O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.77(1H，s，H-3)，7.01(1H，s，H-6)，6.48(1H，d，J= 11.0 Hz，H-9)，6.19(1H，dd，J= 14.8，11.0 Hz，H-10)，5.96(1H，dd，J= 14.8，6.6 Hz，H-11)，5.05(2H，s，H-27)，4.24(1H，m，H-19)，3.60(1H，m，H-17)，3.25(1H，m，H-25)，2.53(1H，m，H-12)，2.28(2H，m，H-16)，2.20(2H，m，H-13)，2.20(3H，s，H-26)，2.11(1H，m，H-18)，2.08(1H，m，H-20)，1.65(1H，m，H-22)，1.62(3H，br s，H-29)，1.54(1H，m，H-22)，1.50(2H，m，H-23)，1.34(1H，br t，J= 12.0 Hz，H-20)，1.24(1H，m，H-24)，1.20(1H，m，H-18)，1.10(3H，d，J= 5.8 Hz，H-31)，1.08(3H，d，J= 6.2 Hz，H-28)，0.82(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：165.8(C-1)，114.5(C-2)，133.2(C-3)，126.1(C-4)，160.5(C-5)，107.5(C-6)，138.2(C-7)，123.6(C-8)，128.0(C-9)，121.7(C-10)，146.4(C-11)，33.8(C-12)，48.2(C-13)，135.4(C-14)，122.3(C-15)，34.3(C-16)，68.1(C-17)，40.3(C-18)，65.8(C-19)，44.7(C-20)，97.6(C-21)，35.8(C-22)，27.8(C-23)，36.6(C-24)，71.3(C-25)，15.6(C-26)，66.7(C-27)，19.4(C-28)，16.1(C-29)，17.9(C-30)，19.4(C-31)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物3為seco-milbemycin C。

化合物4白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z523.3[M-H]-，分子式為C32H44O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.78(1H，s，H-3)，7.02(1H，s，H-6)，6.51(1H，d，J= 11.0 Hz，H-9)，6.17(1H，dd，J= 14.8，11.0 Hz，H-10)，5.97(1H，dd，J= 14.8，6.6 Hz，H-11)，5.11(1H，t，J= 7.0 Hz，H-15)，5.05(2H，s，H-27)，4.24(1H，m，H-19)，3.63(1H，m，H-17)，3.25(1H，m，H-25)，2.53(1H，m，H-12)，2.28(2H，m，H-16)，2.20(2H，m，H-13)，2.20(3H，s，H-26)，2.11(1H，m，H-18)，2.08(1H，m，H-20)，1.65(1H，m，H-22)，1.62(1H，m，H-31)，1.62(3H，br s，H-29)，1.54(1H，m，H-22)，1.50(2H，m，H-23)，1.34(1H，br t，J= 12.0 Hz，H-20)，1.24(1H，m，H-24)，1.25(1H，m，H-31)，1.20(1H，m，H-18)，1.08(3H，d，J= 6.2 Hz，H-28)，0.92(3H，t，J= 6.2 Hz，H-32)，0.82(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：165.6(C-1)，114.5(C-2)，133.1(C-3)，126.2(C-4)，160.6(C-5)，107.4(C-6)，138.3(C-7)，123.5(C-8)，128.1(C-9)，121.8(C-10)，146.6(C-11)，33.7(C-12)，48.3(C-13)，135.5(C-14)，122.5(C-15)，34.2(C-16)，68.0(C-17)，40.1(C-18)，65.7(C-19)，44.8(C-20)，97.5(C-21)，35.7(C-22)，27.8(C-23)，36.5(C-24)，71.4(C-25)，15.6(C-26)，66.8(C-27)，19.5(C-28)，16.1(C-29)，17.9(C-30)，25.6(C-31)，10.3(C-32)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物4為seco-milbemycin A。

化合物5白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z541.1[M + H]+，分子式為C33H48O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.42(1H，br s，H-3)，6.25(1H，d，J= 11.8 Hz，H-9)，6.03(1H，dd，J= 14.8，11.8 Hz，H-10)，5.38(1H，d，J= 14.8，9.1 Hz，H-11)，5.36(1H，m，H-19)，4.83(1H，br d，J= 10.0 Hz，H-15)，3.75(1H，m，H-17)，3.61(1H，br d，H-2)，3.38(1H，s，H-6)，3.06(1H，dd，J= 9.6，2.0 Hz，H-25)，2.50(1H，m，H-12)，2.43(1H，m，H-13)，2.42(1H，s，H-6)，2.31(1H，m，H-16)，2.23(1H，m，H-16)，2.01(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-20)，1.94(3H，s，H-27)，1.87(1H，m，H-13)，1.84(3H，s，H-26)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(3H，s，H-29)，1.53(1H，m，H-22)，1.52(2H，m，H-23)，1.50(1H，m，H-31)，1.43(1H，m，H-20)，1.32(1H，m，H-24)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)，0.89(3H，d，J= 6.2 Hz，H-32)，0.84(3H，d，J= 6.2 Hz，H-33)，0.79(1H，q，J= 11.8 Hz，H-18)，0.79(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：173.5(C-1)，49.2(C-2)，118.1(C-3)，139.6(C-4)，198.1(C-5)，41.6(C-6)，75.9(C-7)，124.0(C-8)，123.8(C-9)，126.4(C-10)，144.6(C-11)，36.1(C-12)，48.3(C-13)，137.5(C-14)，122.3(C-15)，34.2(C-16)，67.0(C-17)，36.6(C-18)，70.0(C-19)，41.3(C-20)，97.5(C-21)，35.7(C-22)，27.8(C-23)，31.5(C-24)，78.2(C-25)，18.8(C-26)，19.8(C-27)，14.2(C-28)，16.3(C-29)，17.9(C-30)，28.6(C-31)，14.2(C-32)，20.9(C-33)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物5為米爾貝霉素H。

化合物6白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z509.3[M-H]-，分子式為C31H42O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.38(1H，s，H-3)，6.70(1H，s，H-6)，6.24(1H，dd，J= 14.9，11.0 Hz，H-10)，5.82(1H，d，J= 11.0 Hz，H-9)，5.50(1H，m，H-19)，5.42(1H，dd，J= 14.9，6.6 Hz，H-11)，4.91(1H，t，J= 9.7 Hz，H-15)，4.56(1H，d，J= 10.0 Hz，H-27)，4.53(1H，d，J= 10.0 Hz，H-27)，3.71(1H，m，H-17)，3.30(1H，m，H-25)，2.53(1H，m，H-12)，2.34(1H，m，H-16)，2.25(1H，m，H-13)，2.25(1H，m，H-16)，2.22(3H，s，H-26)，2.14(1H，m，H-18)，2.02(1H，m，H-20)，1.86(1H，br t，J= 12.4 Hz，H-13)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(3H，br s，H-29)，1.54(1H，m，H-22)，1.54(2H，m，H-23)，1.44(1H，br t，J= 12.0 Hz，H-20)，1.24(1H，m，H-24)，1.15(3H，d，J= 6.2 Hz，H-31)，1.07(3H，d，J= 6.2 Hz，H-28)，0.87(1H，m，H-18)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：169.2(C-1)，123.7(C-2)，132.1(C-3)，123.2(C-4)，156.6(C-5)，114.4(C-6)，140.6(C-7)，136.1(C-8)，131.8(C-9)，123.8(C-10)，143.1(C-11)，35.7(C-12)，48.7(C-13)，135.5(C-14)，121.5(C-15)，33.8(C-16)，67.6(C-17)，36.6(C-18)，68.7(C-19)，41.3(C-20)，97.8(C-21)，35.8(C-22)，27.8(C-23)，36.5(C-24)，71.3(C-25)，15.5(C-26)，61.5(C-27)，20.9(C-28)，16.1(C-29)，17.9(C-30)，19.3(C-31)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物6為米爾貝霉素β13。

化合物7白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z539.3[M + H]+，分子式為C32H42O7。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.74(3H，s，H-27)，7.57(1H，s，H-3)，6.83(1H，d，J= 15.6 Hz，H-9)，6.15(1H，dd，J= 15.6，8.9 Hz，H-10)，5.63(1H，m，H-19)，5.33(1H，t，J= 7.7 Hz，H-15)，4.39(1H，d，J= 8.9 Hz，H-11)，3.93(1H，m，H-17)，3.12(1H，m，H-25)，2.42(1H，m，H-16)，2.31(3H，s，H-26)，2.30(1H，m，H-16)，2.16(1H，m，H-20)，2.14(1H，m，H-18)，2.10(2H，m，H-13)，1.84(1H，m，H-12)，1.73(3H，br s，H-29)，1.67(1H，m，H-31)，1.65(1H，m，H-22)，1.54(1H，m，H-22)，1.50(2H，m，H-23)，1.40(1H，m，H-18)，1.35(1H，m，H-31)，1.34(1H，m，H-20)，1.34(1H，m，H-24)，1.03(3H，d，J= 6.9 Hz，H-28)，1.01(3H，t，J= 6.2 Hz，H-32)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：167.3(C-1)，117.2(C-2)，129.6(C-3)，119.6(C-4)，142.4(C-5)，142.3(C-6)，123.5(C-7)，120.0(C-8)，126.8(C-9)，126.4(C-10)，86.6(C-11)，40.1(C-12)，43.3(C-13)，137.5(C-14)，122.3(C-15)，33.2(C-16)，67.0(C-17)，35.6(C-18)，70.0(C-19)，41.3(C-20)，97.5(C-21)，35.7(C-22)，27.8(C-23)，34.5(C-24)，76.2(C-25)，14.8(C-26)，144.4(C-27)，14.2(C-28)，18.3(C-29)，17.9(C-30)，25.6(C-31)，10.2(C-32)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物7為米爾貝霉素ST906。

化合物8白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z495.1[M + H]+，分子式為C31H42O5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.37(1H，s，H-3)，6.61(1H，s，H-6)，6.15(1H，dd，J= 15.0，10.9 Hz，H-10)，5.71(1H，d，J= 10.9 Hz，H-9)，5.49(1H，m，H-19)，5.29(1H，d，J= 15.0，9.1 Hz，H-11)，4.90(1H，br d，J= 10.1 Hz，H-15)，3.63(1H，m，H-17)，3.10(1H，m，H-25)，2.60(3H，s，H-26)，2.50(1H，m，H-12)，2.31(1H，m，H-16)，2.23(1H，m，H-16)，2.21(1H，m，H-13)，2.07(3H，s，H-27)，2.01(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-20)，1.87(1H，m，H-13)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(3H，s，H-29)，1.53(1H，m，H-22)，1.52(2H，m，H-23)，1.43(1H，m，H-20)，1.32(1H，m，H-24)，1.10(3H，d，J= 5.8 Hz，H-31)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)，0.79(1H，q，J= 11.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：169.1(C-1)，123.5(C-2)，132.0(C-3)，123.2(C-4)，156.4(C-5)，114.3(C-6)，140.7(C-7)，136.2(C-8)，131.7(C-9)，123.6(C-10)，143.2(C-11)，35.7(C-12)，48.7(C-13)，135.6(C-14)，121.4(C-15)，33.8(C-16)，67.5(C-17)，36.6(C-18)，68.8(C-19)，41.2(C-20)，97.9(C-21)，35.8(C-22)，27.7(C-23)，36.6(C-24)，71.2(C-25)，15.5(C-26)，16.8(C-27)，20.8(C-28)，16.2(C-29)，17.9(C-30)，19.3(C-31)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物8為米爾貝霉素β3。

化合物9白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z507.4[M-H]-，分子式為C32H44O5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.37(1H，s，H-3)，6.62(1H，s，H-6)，6.14(1H，dd，J= 15.0，10.9 Hz，H-10)，5.72(1H，d，J= 10.9 Hz，H-9)，5.49(1H，m，H-19)，5.28(1H，d，J= 15.0，9.1 Hz，H-11)，4.90(1H，br d，J= 10.1 Hz，H-15)，3.63(1H，m，H-17)，3.10(1H，m，H-25)，2.60(3H，s，H-26)，2.50(1H，m，H-12)，2.31(1H，m，H-16)，2.23(1H，m，H-16)，2.21(1H，m，H-13)，2.07(3H，s，H-27)，2.01(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-20)，1.87(1H，m，H-13)，1.67(3H，m，H-31)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(3H，s，H-29)，1.53(1H，m，H-22)，1.52(2H，m，H-23)，1.43(1H，m，H-20)，1.35(2H，m，H-31)，1.32(1H，m，H-24)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)，1.01(3H，t，J= 6.2 Hz，H-32)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)，0.79(1H，q，J= 11.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：168.9(C-1)，123.9(C-2)，132.1(C-3)，123.4(C-4)，156.7(C-5)，114.4(C-6)，140.8(C-7)，136.3(C-8)，131.8(C-9)，123.9(C-10)，143.0(C-11)，35.7(C-12)，48.8(C-13)，135.6(C-14)，121.6(C-15)，33.8(C-16)，67.6(C-17)，36.7(C-18)，68.8(C-19)，41.4(C-20)，97.6(C-21)，35.7(C-22)，27.9(C-23)，34.4(C-24)，76.3(C-25)，15.5(C-26)，18.5(C-27)，20.9(C-28)，16.1(C-29)，17.9(C-30)，25.8(C-31)，10.1(C-32)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物9為25-ethylmilbemycinβ3。

化合物10白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；ESI-MS：m/z525.3[M-H]-，分子式為C32H46O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.38(1H，s，H-3)，6.28(1H，d，J= 11.9 Hz，H-9)，6.01(1H，dd，J= 15.0，11.9 Hz，H-10)，5.38(1H，d，J= 15.0，9.1 Hz，H-11)，5.34(1H，m，H-19)，4.84(1H，br d，J= 10.1 Hz，H-15)，3.63(1H，m，H-17)，3.59(br d，H-2)，3.38(1H，s，H-6)，3.10(1H，m，H-25)，2.50(1H，m，H-12)，2.40(1H，s，H-6)，2.31(1H，m，H-16)，2.23(1H，m，H-16)，2.21(1H，m，H-13)，2.01(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-20)，1.94(3H，s，H-27)，1.87(1H，m，H-13)，1.84(3H，s，H-26)，1.67(1H，m，H-31)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(3H，s，H-29)，1.53(1H，m，H-22)，1.52(2H，m，H-23)，1.43(1H，m，H-20)，1.35(1H，m，H-31)，1.32(1H，m，H-24)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)，1.01(3H，t，J= 6.2 Hz，H-32)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)，0.79(1H，q，J= 11.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：173.1(C-1)，48.6(C-2)，136.1(C-3)，136.4(C-4)，196.6(C-5)，47.6(C-6)，75.6(C-7)，135.1(C-8)，148.6(C-9)，121.6(C-10)，153.1(C-11)，36.7(C-12)，48.6(C-13)，136.5(C-14)，121.4(C-15)，34.4(C-16)，67.5(C-17)，36.6(C-18)，68.8(C-19)，40.7(C-20)，97.8(C-21)，35.7(C-22)，27.6(C-23)，36.6(C-24)，71.2(C-25)，15.5(C-26)，16.6(C-27)，21.1(C-28)，16.1(C-29)，25.7(C-31)，10.2(C-32)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物10為米爾貝霉素β6。

化合物11白色粉末狀固體；易溶于氯仿、甲醇、丙酮，難溶于水；HR-ESI-MS：535.306 1[M + Na]+(calcd for C31H44NaO6，535.307 4)，分子式為C31H44O6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.38(1H，s，H-3)，6.28(1H，d，J= 11.9 Hz，H-9)，6.01(1H，dd，J= 15.0，11.9 Hz，H-10)，5.38(1H，d，J= 15.0，9.1 Hz，H-11)，5.34(1H，m，H-19)，4.84(1H，br d，J= 10.1 Hz，H-15)，3.63(1H，m，H-17)，3.59(1H，br d，H-2)，3.38(1H，s，H-6)，3.25(1H，m，H-25)，2.50(1H，m，H-12)，2.40(1H，s，H-6)，2.31(1H，m，H-16)，2.23(1H，m，H-16)，2.21(1H，m，H-13)，2.01(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-20)，1.94(3H，s，H-27)，1.87(1H，m，H-13)，1.84(3H，s，H-26)，1.65(1H，m，H-22)，1.64(1H，s，H-29)，1.53(1H，m，H-22)，1.52(2H，m，H-23)，1.43(1H，m，H-20)，1.23(1H，m，H-24)，1.11(3H，m，H-31)，1.03(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J= 6.5 Hz，H-30)，0.79(1H，q，J= 11.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：173.0(C-1)，48.5(C-2)，136.0(C-3)，136.2(C-4)，196.4(C-5)，47.6(C-6)，75.7(C-7)，135.2(C-8)，148.7(C-9)，121.6(C-10)，153.2(C-11)，36.7(C-12)，48.7(C-13)，136.6(C-14)，121.4(C-15)，34.4(C-16)，67.5(C-17)，36.6(C-18)，68.8(C-19)，40.7(C-20)，97.9(C-21)，35.8(C-22)，27.6(C-23)，36.6(C-24)，71.2(C-25)，15.5(C-26)，16.6(C-27)，21.1(C-28)，16.1(C-29)，17.9(C-30)，19.2(C-31)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，因此鑒定化合物11為米爾貝霉素β7。

2.2 化合物殺蟲活性測(cè)試

對(duì)化合物1和2殺蟲活性測(cè)試結(jié)果(見表2)顯示該兩個(gè)化合物對(duì)朱砂葉螨和松材線蟲都具有顯著的殺滅活性，與陽性對(duì)照組米爾貝霉素A3/A4活性相比無顯著性差異(P> 0.05)。

表2 化合物1和2的殺螨和殺線蟲活性

3 討論與結(jié)論

本文通過對(duì)基因工程菌StreptomycesbingchenggensisBCJ60次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，得到11個(gè)化合物，其中化合物1和2是兩個(gè)新化合物。在之前的研究中，本課題組已對(duì)基因工程菌StreptomycesbingchenggensisBCJ60次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步的研究獲得了12個(gè)新化合物，并且都是米爾貝霉素類化合物[13-18]。這說明通過基因定向改造，生物合成基因簇發(fā)生改變，激活了某些生物合成途徑，得到新的代謝產(chǎn)物，有助于進(jìn)一步了解米爾貝類化合物生物合成機(jī)制。對(duì)新化合物殺蟲活性實(shí)驗(yàn)表明，化合物1和2對(duì)朱砂葉螨和松材線蟲都表現(xiàn)了顯著的殺滅活性，并且與商品化的米爾貝霉素A3/A4無顯著性差異，說明化合物1和2不僅有望作為米爾貝霉素A3/A4的替代殺蟲劑，還有可能通過對(duì)其結(jié)構(gòu)修飾得到活性更高的新一代農(nóng)用或獸用抗生素。