蕓香化學(xué)成分及其促黑色素生成作用研究

帕孜萊提·艾尼瓦爾，李作鵬，瑪伊熱·努爾艾合麥提，臧 登，蔣 嵐，阿吉艾克拜爾·艾薩*

1中國科學(xué)院新疆特有藥用資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，烏魯木齊 830011；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

蕓香(RutagraveolensL.)又名臭草，為蕓香科(Rutaceae)蕓香屬(Ruta)植物，原產(chǎn)地中海和亞洲西南部，在我國中部和北部作為一種草本植物被種植在花園中[1]。文獻(xiàn)調(diào)研表明蕓香中含有多種化學(xué)成分，包括黃酮類、生物堿、香豆素、萜類、揮發(fā)油[2]。記載于《中華本草維吾爾藥卷》《中國民間生草藥原色圖譜》《天然藥8404種詮釋》《中國民族藥辭典》《中藥大辭典》等[3]。蕓香可用于治療小便不利，關(guān)節(jié)疼痛，耳痛，智力下降，癱瘓，抽搐，白癜風(fēng)及月經(jīng)失調(diào)等[4]。蕓香在新疆地區(qū)維吾爾語稱“蘇扎甫”民間用作為原料藥入藥治療牛皮癬、白癜風(fēng)等治療[5]，但對于具體的有效成分還未明確，有待于進(jìn)一步深入地研究。

黑色素生成減少及黑色素細(xì)胞破壞是白癜風(fēng)發(fā)生的主要原因，其特點(diǎn)是皮膚出現(xiàn)白色斑塊[6]。酪氨酸酶(TYR)是黑色素生物合成途徑中的主要限速酶，黑色素形成的多少取決于其活性，激活或者抑制酪氨酸酶活性能夠調(diào)節(jié)黑色素生成[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蕓香石油醚部位分離到的單體化合物對酪氨酸酶活性有激活作用，從而促進(jìn)黑色素的生成。

本文對蕓香的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，旨在于尋找能夠促進(jìn)黑色素產(chǎn)生的活性成分。B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑色素含量及酪氨酸酶活性進(jìn)行測定，采用現(xiàn)代色譜手段，從蕓香地上部分乙醇提取物的乙酸乙酯部位進(jìn)行分離，并評價(jià)化合物對促進(jìn)黑色素生成的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Varian超導(dǎo)核磁共振波譜儀(美國Varian公司)；QStar Elite LC-MS/MS譜儀(美國AB Sciex公司)；半制備型高效液相色譜儀(系統(tǒng)SPD-20A，日本島津公司)；制備型色譜柱為X-BridgeTMC18柱(250 mm×10 mm，5 μm，Waters公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；Sephadex LH-20(GE Healthcare，瑞典)；柱色譜硅膠(100～200、200～300目，青島海洋化工有限公司)；ODS(日本YMC公司)；薄層色譜硅膠板(青島海洋化工有限公司)；乙腈、甲醇為色譜純(德國默克公司)；水為超純水(Milli-Qwater水凈化系統(tǒng))；顯色劑：香草醛濃硫酸溶液(5%)；DMEM培養(yǎng)基(批號：8120490，生產(chǎn)商：美國Sigma公司)；青霉素/鏈霉素(批號：2199843，生產(chǎn)商：美國Gibco公司)；胎牛血清(批號：2168080RP，生產(chǎn)商：美國Gibco公司)；胰蛋白酶(批號：2177715，含0.25% EDTA，生產(chǎn)商：美國Gibco公司)；DMSO(貨號：D4540-500 ml，生產(chǎn)商：美國Sigma公司)；BCA蛋白定量試劑盒(生產(chǎn)商：北京博邁德基因技術(shù)有限公司)；L-DOPA(批號：SLCB0627，生產(chǎn)商：美國Gibco公司)；NaOH(生產(chǎn)商：天津市百世化工有限公司)。

1.2 材料

蕓香于2018年6月采摘地是中國新疆伊犁州察布查爾錫伯族自治縣。并經(jīng)中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所魯春芳副研究員鑒定為蕓香(RutagraveolensL.)，憑證標(biāo)本(No.WY02260)，植物標(biāo)本保存于中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取與分離

蕓香(R.graveolens)地上部分(約20 kg)，粉碎后用70%乙醇回流提取3次，提取液減壓濃縮得到乙醇提取物，將提取物加水混懸，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到四個(gè)萃取部位。乙酸乙酯萃取物(171.3 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(1∶0→0∶1)梯度洗脫，得到10個(gè)流分(Fr.1～Fr.10)。Fr.1經(jīng)反相flash柱色譜(甲醇)得到8個(gè)流分(Fr.1.1～Fr.1.8)，其中流分Fr.1.4(133.3 mg)，F(xiàn)r.1.5(731.2 mg)和Fr.1.6(329.9 mg)，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)和制備高效液相(乙腈)反復(fù)純化分離得到化合物9(49.3 mg)、17(9.6 mg)、3(14.6 mg)；流分Fr.3(23.2 g)通過結(jié)晶得到化合物8(18.4 g)。Fr.5經(jīng)反相flash柱色譜(甲醇)得到10個(gè)流分(Fr.5.1～Fr.5.10)，其中流分Fr.5.2(1.7 g)，F(xiàn)r.5.8(2.5 g)，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)和制備高效液相(乙腈)反復(fù)純化分離得到化合物4(17.3 mg)、21(4.8 mg)、5(6.9 mg)、1(26.8 mg)；Fr.6經(jīng)反相flash柱色譜(甲醇)得到12個(gè)流分(Fr.6.1～Fr.6.12)，其中流分Fr.6.8(320.8 mg)經(jīng)減壓硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)和制備高效液相(乙腈)反復(fù)純化分離得到化合物15(3.0 mg)、16(9.1 mg)、18(14.2 mg)、7(9.5 mg)、10(9.5 mg)、2(2.2 mg)、20(4.5 mg)、11(15 mg)、6(7.1 mg)；Fr.8經(jīng)反相flash柱色譜(甲醇)得到6個(gè)流分(Fr.8.1～Fr.8.6)，其中流分Fr.8.2(2.1 g)、Fr.8.4(2.0 g)、Fr.8.6(1.0 g)、經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)和制備高效液相(乙腈)反復(fù)純化分離得到化合物23(1.9 mg)、13(31.2 mg)、14(4.6 mg)、22(4.5 mg)、12(5.1 mg)；Fr.10經(jīng)反相flash柱色譜(甲醇)得到9個(gè)流分(Fr.10.1～Fr.10.9)，其中流分Fr.10.5(1.0 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)和制備高效液相(乙腈)反復(fù)純化分離得到化合物19(7.2 mg)。

1.3.2 細(xì)胞內(nèi)黑色素含量測定

小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16(中國科學(xué)院、上海)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法，取對數(shù)生長期的B16黑色素瘤細(xì)胞以2×105的密度接種于6孔板。實(shí)驗(yàn)設(shè)立陰性對照組(negative control，NC)(DMSO 2 μL/孔)、終濃度為1、10、50 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組(50 μmol/L的8-甲氧基補(bǔ)骨脂素)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，用PBS清洗兩次，每孔加入100 μL RIPA裂解液，細(xì)胞提取液上清用BCA法檢測總蛋白濃度，在沉淀中加入190 μL的1N NaOH裂解液，置80 ℃水浴中1 h后，酶標(biāo)儀405 nm波長下測定OD值。按照下式求得相對黑色素含量。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性測定

采用酪氨酸酶多巴速率氧化法[9]，取對數(shù)生長期的B16黑色素瘤細(xì)胞(3.5×105個(gè)/孔)接種于6孔板中。陰性對照組(DMSO 2 μL/孔)、終濃度為1、10、50 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組[50 μmol/L的8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)]，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，用PBS清洗兩次，每孔加入100 μL含有1%脫氧膽酸鈉+0.1%TritonX-100溶液的PBS緩沖液中裂解。轉(zhuǎn)移3 μL上清至96孔酶標(biāo)板用BCA試劑檢測總蛋白濃度C；轉(zhuǎn)移90 μL上清至96孔酶標(biāo)板，再加入10 μL 10 mmol/L的L-Dopa，37 ℃避光孵育至各孔有淺棕褐色出現(xiàn)，迅速在490 nm處測各孔吸光度。按下式計(jì)算細(xì)胞相對酪氨酸酶活性：

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無定形粉末；分子式C19H32O7；ESI-MS：m/z395.2[M+Na]+；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：5.71(1H，s，H-4)，4.15(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1′)，3.69(1H，dd，J= 11.7，5.4 Hz，H-6′b)，3.67(1H，m，H-9)，3.63(1H，m，H-5′)，3.42(1H，dd，J= 11.7，5.4 Hz，H-6′a)，3.08(1H，m，H-4′)，2.95(1H，m，H-3′)，2.90(1H，dd，J= 9.0，7.8 Hz，H-2′)，2.50(1H，d，J= 17 Hz，H-2b)，2.37(1H，d，J= 17 Hz，H-2a)，1.96(1H，d，J= 1.4 Hz，H-13)，1.82(1H，m，H-6)，1.64(2H，m，H-7)，1.46(1H，m，H-8)，1.14(3H，d，J= 6.4 Hz，H-10)，1.00(3H，s，H-12)，0.93(3H，s，H-11)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：35.7(C-1)，47.0(C-2)，198.1(C-3)，124.2(C-4)，165.9(C-5)，50.4(C-6)，26.8(C-7)，36.0(C-8)，74.9(C-9)，21.6(C-10)，28.5(C-11)，24.7(C-12)，24.1(C-13)，102.5(C-1′)，73.6(C-2′)，76.8(C-3′)，70.1(C-4′)，76.7(C-5′)，61.1(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為布盧門醇 C 葡糖苷。

化合物2淡黃色油狀物；分子式C19H30O8；ESI-MS：m/z409.2[M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：5.99(1H，d，J= 15.5 Hz，H-7)，5.89(1H，br s，H-4)，5.75(1H，dd，J= 15.6，7.3 Hz，H-8)，4.55(1H，m，H-9)，4.29(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1′)，3.87(1H，dd，J= 11.9，2.3 Hz，H-6′a)，3.65(1H，dd，J= 11.8，6.2 Hz，H-6′b)，3.31(4H，m，H-2′～5′)，2.63(1H，d，J= 16.9 Hz，H-2a)，2.19(1H，d，J= 16.5 Hz，H-2b)，1.96(3H，s，H-13)，1.31(3H，d，J= 6.4 Hz，H-10)，1.06(3H，s，H-11)，1.03(3H，s，H-12)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：42.4(C-1)，50.8(C-2)，201.5(C-3)，127.1(C-4)，167.1(C-5)，78.4(C-6)，133.8(C-7)，133.7(C-8)，74.6(C-9)，24.7(C-10)，22.2(C-11)，23.5(C-12)，19.6(C-13)，101.3(C-1′)，71.7(C-2′)，78.2(C-3′)，70.1(C-4′)，75.0(C-5′)，62.8(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為(6S，9R)-玫瑰花苷。

化合物3褐色粉末；分子式C14H14O6；ESI-MS：m/z277.1[M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.85(1H，d，J= 9.5 Hz，H-4)，7.13(1H，s，H-5)，6.21(1H，d，J= 9.5 Hz，H-3)，5.37(1H，d，J= 5.9 Hz，H-3′)，4.38(1H，d，J= 5.9 Hz，H-2′)，1.51(1H，s，H-3″)，1.49(1H，s，H-2″)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：163.1(C-2)，112.6(C-3)，146.7(C-4)，115.5(C-4a)，116.3(C-5)，129.7(C-6)，152.3(C-7)，130.6(C-8)，145.9(C-8a)，93.1(C-2′)，73.0(C-3′)，73.2(C-1″)，26.5(C-2″)，27.1(C-3″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為8-hydroxysmyrindiol。

化合物4淡黃色粉末；分子式C18H22O10；ESI-MS：m/z421.1[M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.68(1H，d，J= 1.4 Hz，H-6)，7.10(1H，s，H-3)，6.72(1H，d，J= 1.7 Hz，H-8)，4.11(3H，s，-OCH3)，3.20(6H，m，H-2′～6′)，3.00(2H，m，H-9)，2.61(2H，m，H-10)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：127.0(C-1)，144.5(C-2)，138.9(C-3)，146.6(C-4)，132.5(C-5)，115.7(C-6)，147.1(C-7)，107.6(C-8)，27.6(C-9)，36.1(C-10)，177.9(C-11)，105.3(C-1′)，75.8(C-2′)，78.2(C-3′)，71.5(C-4′)，77.9(C-5′)，61.4(C-6′)，62.5(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為cnidioside B。

化合物5白色無定形粉末；分子式C31H30O16；ESI-MS：m/z657.1[M-H]-；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.06(1H，d，J= 9.5 Hz，H-4′)，7.87(1H，s，H-4)，7.73(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，7.29(1H，s，H-5)，7.25(1H，d，J= 2.4 Hz，H-8′)，7.22(1H，s，H-8)，7.15(1H，dd，J= 8.6，2.5 Hz，H-6′)，6.39(1H，d，J= 9.5 Hz，H-3′)，5.15(1H，d，J= 7.3 Hz，H-1″)，4.24(1H，dd，J= 11.9，2.1 Hz，H-6a″)，4.03(1H，dd，J= 12.1，6.1 Hz，H-6b″)，3.80(3H，s，-OCH3)，3.75(1H，m，H-5″)，3.28(2H，m，H-3″，4″)，2.39(1H，d，J= 13.4 Hz，H-4b?)，2.32(1H，d，J= 13.4 Hz，H-4a?)，2.21(1H，d，J= 15.2 Hz，H-2b?)，1.95(1H，d，J= 15.2 Hz，H-2a?)，1.07(3H，s，-COCH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：159.4(C-2)，137.1(C-3)，130.0(C-4)，109.5(C-5)，146.3(C-6)，148.7(C-7)，102.9(C-8)，146.7(C-9)，112.2(C-10)，160.0(C-2′)，114.0(C-3′)，144.1(C-4′)，129.8(C-5′)，113.6(C-6′)，156.8(C-7′)，104.5(C-8′)，155.0(C-9′)，114.6(C-10′)，99.3(C-1″)，73.0(C-2″)，76.5(C-3″)，69.8(C-4″)，73.7(C-5″)，62.9(C-6″)，170.6(C-1?)，46.8(C-2?，4?)，68.9(C-3?)，175.8(C-5?)，28.2(C-6?)，56.0(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為繸狀蕓香苷酯。

化合物6白色無定形粉末；分子式C20H24O10；ESI-MS：m/z423.1[M-H]-；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.90(1H，d，J= 9.5 Hz，H-4)，6.99(1H，s，H-5)，6.19(1H，d，J= 9.4 Hz，H-3)，4.80(1H，t，J= 8.9 Hz，H-2′)，4.44(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1″)，1.28(3H，s，4′-CH3)，1.24(3H，s，4′-CH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：160.4(C-2)，111.1(C-3)，143.8(C-4)，114.1(C-5)，125.6(C-6)，151.2(C-7)，128.2(C-8)，145.2(C-9)，113.0(C-10)，89.8(C-2′)，29.7(C-3′)，77.0(C-4′)，23.3、21.8(4′-CH3)，97.3(C-1″)，73.5(C-2″)，76.5(C-3″)，70.0(C-4″)，76.9(C-5″)，60.8(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為異蕓香呋喃香豆醇葡萄糖苷。

化合物7白色無定形粉末；分子式C20H24O10；ESI-MS：m/z447.1[M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.86(1H，d，J= 9.5 Hz，H-4)，7.18(1H，s，H-5)，6.23(1H，d，J= 9.5 Hz，H-3)，5.37(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1″)，4.83(1H，t，J= 8.7 Hz，H-2′)，1.37(3H，s，4′-CH3)，1.26(3H，s，4′-CH3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：163.4(C-2)，112.4(C-3)，146.5(C-4)，119.2(C-5)，128.4(C-6)，155.1(C-7)，128.7(C-8)，148.2(C-9)，115.0(C-10)，93.2(C-2′)，30.7(C-3′)，72.4(C-4′)，25.8，25.0(4′-CH3)，103.4(C-1″)，75.5(C-2″)，78.1(C-3″)，71.4(C-4″)，78.5(C-5″)，62.5(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定化合物7為蕓香扔。

化合物8白色粉末；分子式C7H6O5；ESI-MS：m/z169.0[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.04(2H，s，H-2，6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：122.0(C-1)，110.3(C-2，6)，146.4(C-3，5)，139.6(C-4)，170.4(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為沒食子酸。

化合物9白色粉末；C7H6O3；ESI-MS：m/z137.03[M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.85(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2，6)，6.79(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3，5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：122.8(C-1)，133.0(C-2，6)，116.0(C-3，5)，163.3(C-4)，170.1(C-1′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物9為對羥基苯甲酸。

化合物10黃色粉末；分子式C15H18O8；ESI-MS：m/z325.1[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.59(2H，d，J= 8.3 Hz，H-2，6)，7.04(2H，d，J= 8.1 Hz，H-3，5)，6.56(1H，d，J= 12.7 Hz，H-7)，5.94(1H，d，J= 12.7 Hz，H-8)，4.92(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1″)，3.36(6H，m，Glc-H)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：131.5(C-1)，133.3(C-2，6)，118.5(C-3，5)，160.4(C-4)，135.8(C-7)，124.0(C-8)，174.8(C-9)，103.5(C-1″)，76.3(C-2″)，79.6(C-3″)，72.8(C-4″)，79.4(C-5″)，63.9(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為cis-p-coumaric acid 4-O-β-D-glucopyranoside。

化合物11無色針晶；分子式C21H24O10；ESI-MS：m/z435.1[M-H]-；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.20(1H，m，H～2，6)，7.18(1H，m，H～3，5)，7.14(1H，m，H-4)，6.97(1H，s，H-2″，6″)，4.42(1H，br d，J= 11.8 Hz，H-6′)，4.26(1H，d，J= 7.9 Hz，H-1′)，3.65(2H，m，H-8)，3.40(1H，m，H-5)，3.17(1H，m，H～3′，4′)，3.02(1H，t，J= 8.2 Hz，H-2′)，2.77(2H，m，H-7)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：138.6(C-1)，128.2(C-2，6)，128.9(C-3，5)，126.0(C-4)，35.7(C-7)，70.0(C-8)，103.1(C-1′)，73.4(C-2′)，76.5(C-3′)，69.7(C-4′)，73.7(C-5′)，63.5(C-6′)，119.4(C-1″)，108.7(C-2″)，145.7(C-3″，5″)，138.6(C-4″)，108.6(C-6″)，165.9(C-7″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物11為2-phenylethyl 6-O-galloyl-β-D-glucopyranoside。

化合物12無色針狀結(jié)晶；分子式C7H6O4；ESI-MS：m/z153.0[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.42(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2)，7.40(1H，dd，J= 8.2，2.0 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J= 8.1Hz，H-5)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：123.9(C-1)，117.7(C-2)，146.1(C-3)，151.5(C-4)，115.7(C-5)，123.3(C-6)，170.4(-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物12為原兒茶酸。

化合物13無定形粉末；分子式C17H20O9；ESI-MS：m/z391.1[M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.59(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2)，7.34(1H，s，H-7)，7.32(1H，s，H-4)，6.67(1H，d，J= 2.0 Hz，H-3)，4.92(1H，d，J= 7.6 Hz，H-1″)，3.34(6H，m，H-2″～6″)，2.85(2H，m，H-1′)，2.45(2H，m，H-2′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：145.9(C-2)，107.2(C-3)，99.8(C-4)，155.0(C-5)，127.4(C-6)，122.3(C-7)，155.8(C-8)，123.2(C-9)，27.4(C-1′)，35.8(C-2′)，177.8(C-3′)，103.1(C-1″)，75.0(C-2″)，78.2(C-3″)，71.3(C-4″)，78.1(C-5″)，62.5(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物13為6-羧乙基-5-羥基-苯并呋喃-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物14無定形粉末；分子式C18H22O10；ESI-MS：m/z397.0[M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.59(1H，d，J= 2.2，H-2)，7.09(1H，s，H-7)，6.96(1H，d，J= 1.3，H-3)，4.91(1H，d，J= 7.6 MHz，H-1″)，4.06(3H，s，-OCH3)，3.49(2H，m，H-8)，3.06(2H，dt，J= 8.9，6.1 MHz，H-9)，3.03(5H，m，H-2″～6″)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：144.6(C-2)，105.6(C-3)，114.1(C-3a)，152.3(C-4)，117.3(C-5)，155.7(C-6)，94.7(C-7)，156.9(C-7a)，20.9(C-8)，36.4(C-9)，179.7(C-10)，103.3(C-1″)，75.0(C-2″)，78.1(C-3″)，71.4(C-4″)，78.2(C-5″)，62.5(C-6″)，60.7(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物14為picraquassioside A。

化合物15棕色粉末；分子式C21H20O11；ESI-MS：m/z447.1[M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.34(1H，d，J= 2.1 Hz，H-3′)，7.31(1H，dd，J= 8.3，2.1 Hz，H-5′)，6.91(1H，d，J= 8.3 Hz，H-6′)，6.38(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)，5.35(1H，d，J= 1.3 Hz，H-1″)，4.22(1H，dd，J= 3.4，1.7 Hz，H-2″)，3.74(1H，dd，J= 9.5，3.3 Hz，H-3″)，3.40(2H，m，H-4″，5″)，0.94(3H，d，J= 6.2 Hz，H-6″)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：159.3(C-2)，136.2(C-3)，179.7(C-4)，163.2(C-5)，99.8(C-6)，165.9(C-7)，94.7(C-8)，158.5(C-9)，107.5(C-10)，122.9(C-1′)，146.4(C-2′)，116.9(C-3′)，149.8(C-4′)，116.4(C-5′)，123.0(C-6′)，103.6(C-1″)，71.9(C-2″)，72.1(C-3″)，73.3(C-4″)，72.0(C-5″)，17.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物15為桑色素-3-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物16黃色無定型粉末；分子式C29H32O16；ESI-MS：m/z635.2[M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.77(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，6′)，6.96(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，5′)，6.40(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，6.23(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)，5.38(1H，d，J= 1.8 Hz，H-1″)，4.49(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1?)，4.37(1H，dd，J= 11.8，2.2 Hz，H-6?)，4.20(1H，d，J= 11.8 Hz，H-6?)，3.95(1H，m，H-3″)，3.52(1H，m，H-4?)，3.44(1H，m，H-4″)，3.40(1H，m，H-5?)，3.38(1H，m，H-3?)，3.33(1H，m，H-5″)，3.26(1H，m，H-2″)，3.21(1H，m，H-2?)，2.04(1H，s，-CH3COO-)，0.97(1H，d，J= 6.2 Hz，H-6″)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：158.6(C-2)，136.2(C-3)，179.6(C-4)，161.6(C-5)，99.9(C-6)，165.9(C-7)，94.8(C-8)，157.2(C-9)，103.3(C-10)，122.6(C-1′)，131.9(C-2′，6′)，116.6(C-3′，5′)，159.4(C-4′)，100.5(C-1″)，71.8(C-2″)，71.9(C-3″)，83.3(C-4″)，70.5(C-5″)，17.8(C-6″)，105.9(C-1?)，75.9(C-2?)，78.0(C-3?)，72.0(C-4?)，75.3(C-5?)，64.8(C-6?)，172.7(CH3COO)，20.7(-CH3COO-)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物16為山奈酚-3-O-β-D-6′-乙?；?吡喃葡萄糖-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖苷。

化合物17黃色粉末；分子式C15H10O6；ESI-MS：m/z285.0[M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：8.09(1H，d，J= 8.2 Hz，H-2′，6′)，6.91(1H，d，J= 8.4 Hz，H-3′，5′)，6.39(1H，s，H-8)，6.18(1H，s，H-6)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：148.1(C-2)，137.2(C-3)，177.4(C-4)，160.5(C-5)，99.3(C-6)，162.5(C-7)，94.5(C-8)，158.3(C-9)，104.6(C-10)，123.8(C-1′)，130.7(C-2′，6′)，116.3(C-3′，5′)，165.6(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物17為山奈酚。

化合物18黃色粉末；分子式C21H20O11；ESI-MS：m/z447.1[M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.36(1H，d，J=2.1 Hz，H-6′)，7.33(1H，dd，J= 8.3，2.2 Hz，H-2′)，6.93(1H，d，J= 9.3 Hz，H-5′)，6.39(1H，d，J= 3.7 Hz，H-8)，6.22(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)，5.37(1H，s，H-1″)，4.24(1H，m，H-5″)，3.72(1H，m，H-2″)，3.43(1H，m，H-3″)，3.33(1H，m，H-4″)，0.96(3H，d，J= 6.1 Hz，H-6″)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：158.5(C-2)，136.2(C-3)，179.7(C-4)，163.2(C-5)，103.5(C-6)，165.9(C-7)，99.8(C-8)，159.3(C-9)，105.9(C-10)，123.0(C-1′)，116.4(C-2′)，149.8(C-3′)，146.4(C-4′)，116.9(C-5′)，122.9(C-6′)，94.7(C-1″)，72.1(C-2″)，72.0(C-3″)，73.3(C-4″)，71.9(C-5″)，17.6(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物18為槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。

化合物19白色粉末；分子式C15H10O7；ESI-MS：m/z301[M-H]-；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.67(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，7.54(1H，dd，J= 7.6，6.0 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.40(1H，br s，H-8)，6.18(1H，br s，H-6)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：147.8(C-2)，135.7(C-3)，175.8(C-4)，160.7(C-5)，98.2(C-6)，164.2(C-7)，93.4(C-8)，156.2(C-9)，102.9(C-10)，121.9(C-1′)，115.0(C-2′)，145.1(C-3′)，146.7(C-4′)，115.6(C-5′)，120.0(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物19為槲皮素。

化合物20黃色粉末；分子式C20H18O11；ESI-MS：m/z433.1[M-H]-；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.57(1H，d，J= 8.5 Hz，H-2′)，7.53(1H，d，J= 2.3 Hz，H-6′)，6.84(2H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.38(1H，s，H-8)，6.16(1H，s，H-6)，5.34(1H，d，J= 7.3 Hz，H-1″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.0(C-2)，133.0(C-3)，177.4(C-4)，161.3(C-5)，99.0(C-6)，165.7(C-7)，93.7(C-8)，156.4(C-9)，103.4(C-10)，120.7(C-1′)，115.4(C-2′)，145.2(C-3′)，149.0(C-4′)，116.1(C-5′)，121.3(C-6′)，101.8(C-1″)，76.0(C-2″)，73.6(C-3″)，69.4(C-4″)，66.0(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物20為槲皮素-3-O-β-D-木糖苷。

化合物21黃色粉末；C21H20O10；ESI-MS：m/z431.1[M-H]-；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.52(1H，br s，5-OH)，7.69(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3′，5′)，6.16(1H，br s，H-8)，5.98(1H，br s，H-6)，5.29(1H，br s，H-1″)，3.97(1H，br s，H-2″)，3.47(1H，d，J=9.0 Hz，H-3″)，3.06(2H，m，H-4″，5″)，0.78(3H，d，J= 6.0 Hz，H-6″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.1(C-2)，133.7(C-3)，176.7(C-4)，160.2(C-5)，100.1(C-6)，161.1(C-7)，94.5(C-8)，156.9(C-9)，101.7(C-10)，120.6(C-1′)，130.3(C-2′，6′)，115.4(C-3′，5′)，160.2(C-4′)，100.2(C-1″)，70.5(C-2″，3″)，71.2(C-4″)，70.4(C-5″)，17.5(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物21為山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。

化合物22黃色粉末；C30H26O14；ESI-MS：m/z609.0[M-H]-；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.6(1H，s，5-OH)，7.54(1H，dd，J= 8.3，2.1 Hz，H-6?)，7.52(1H，d，J= 2.2 Hz，H-2?)，7.35(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2?，6?)，7.32(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7?)，6.82(1H，d，J= 8.3 Hz，H-5′)，6.78(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3?，5?)，6.35(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.13(1H，d，J= 7.4 Hz，H-1″)，6.11(1H，d，J= 15.9 Hz，H-8?)，5.49(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，4.27(1H，d，J= 11.3 Hz，H-6a″)，4.03(1H，dd，J= 11.9，6.6 Hz，H-6b″)，3.09(4H，m，H-2″～5″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δc：156.3(C-2)，133.1(C-3)，177.4(C-4)，161.2(C-5)，98.7(C-6)，164.1(C-7)，93.5(C-8)，156.3(C-9)，103.8(C-10)，121.5(C-1′)，115.2(C-2′)，144.8(C-3′)，148.5(C-4′)，116.2(C-5′)，121.1(C-6′)，100.7(C-1″)，74.3(C-2″)，76.3(C-3″)，69.9(C-4″)，166.2(C-9?)，74.0(C-5″)，63.1(C-6″)，124.9(C-1?)，130.2(C-2?，6?)，115.8(C-3?，5?)，159.8(C-4?)，144.6(C-7?)，113.7(C-8?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物22為槲皮素-3-O-(6″-O-反式香豆?；?-β-D-葡萄糖苷。

化合物23黃色粉末；C21H22O10；ESI-MS：m/z433.1[M-H]-；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.38(1H，br s，OH-4′)，7.33(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′)，6.80(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3′，5′)，6.15(1H，d，J= 1.9 Hz，H-6)，6.13(1H，d，J= 2.2 Hz，H-8)，5.49(1H，dd，J= 12.8，4.3 Hz，H-2)，4.97(1H，dd，J= 14.4，7.6 Hz，H-1″)，3.67(6H，m，H-2″～6″)，3.23(1H，dd，J= 17.8，12.7 Hz，H-3a)，2.73(1H，dd，J= 17.2，3.3 Hz，H-3b)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：78.8(C-2)，42.1(C-3)，197.3(C-4)，165.3(C-5)，96.5(C-6)，162.9(C-7)，95.4(C-8)，162.8(C-9)，103.2(C-10)，128.6(C-1′)，128.5(C-2′，6′)，115.2(C-3′，5′)，157.9(C-4′)，99.6(C-1″)，73.0(C-2″)，77.1(C-3″)，69.5(C-4″)，76.3(C-5″)，60.6(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物23為柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

2.2 黑色素生成活性初篩

由圖1可見，與陰性對照組(NC)相比，陽性對照(8-MOP)處理組的相對黑色素含量為130.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性對照組相比，化合物1～7處理組細(xì)胞內(nèi)相對黑色素含量為107.2%、105.9%、111.7%、102.8%、103.3%、109.8%、105.3%。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明，以上化合物對細(xì)胞內(nèi)黑色素含量沒有顯著促進(jìn)作用。

圖1 化合物1～7對B16細(xì)胞黑色素含量的影響

2.3 酪氨酸酶活性的影響

由圖2可見，與NC相比，8-MOP處理組的酪氨酸酶的激活率可達(dá)120.9%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性對照組相比，化合物1～7處理組細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的激活率為108.0%、96.4%、70.4%、102.4%、96.7%、101.8%、93.9%。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明以上化合物對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性沒有顯著促進(jìn)作用。

圖2 化合物1～7對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

通過對蕓香(R.graveolens)地上部分進(jìn)行提取分離，共得到23個(gè)單體化合物，化合物1～5、10、11、13、15、16、18、19、21～23為首次從該植物中分離得到，其中化合物1和2為萜類化合物，3～7為香豆素類化合物，8～12為酚類化合物，13和14為苯并呋喃類糖苷，15～23為黃酮類化合物。天然藥用產(chǎn)物在治療疾病中得到廣泛的肯定，豐富疾病多元化治療方案。由于毒副作用小，天然藥用產(chǎn)物可能成為治療白癜風(fēng)的重要補(bǔ)充?；谑|香通過復(fù)色發(fā)揮治療白癜風(fēng)的傳統(tǒng)應(yīng)用，本研究通過探討蕓香乙酸乙酯部位單體化合物對黑色素含量及酪氨酸酶活性的影響，評價(jià)其促進(jìn)黑色素生成作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乙酸乙酯層分離到的化合物均未表現(xiàn)出促進(jìn)黑色素生成活性。