鉤藤內(nèi)生真菌Talaromyces sp.次級代謝產(chǎn)物研究

曾慧婷，葉 琳，易維婷，陳嘉怡，徐珊珊，趙麗娟，曾 禧，袁 濤

江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330022

鉤藤(Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.)為茜草科龍膽目鉤藤屬具鉤刺植物，因節(jié)上有向下單鉤或雙鉤而得名鉤藤，常以干燥帶鉤的莖枝入藥。鉤藤屬植物具有清熱平肝，息風定驚功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明鉤藤屬植物對心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病都有功效，同時在癌癥治療中也呈現(xiàn)較好的效果[2-5]。

植物內(nèi)生真菌由于長期生活在宿主植物內(nèi)，與宿主協(xié)同進化，兩者形成了穩(wěn)定的共生關(guān)系。一方面，內(nèi)生真菌可從宿主植物吸收營養(yǎng)供自己生長；另一方面，內(nèi)生真菌可通過自身的次級代謝產(chǎn)物或借助信號傳導(dǎo)對宿主植物產(chǎn)生正面影響[6]。近年來，大量文獻報道從內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物中分離了一系列活性優(yōu)良的單體化合物，通過真菌代謝獲得天然產(chǎn)物在產(chǎn)率、經(jīng)濟性和環(huán)境保護等方面均具有顯著優(yōu)勢[7-11]。

Talaromycessp.1.88E屬于籃狀菌屬(Talaromyces)真菌，文獻報道從Talaromycessp.的代謝產(chǎn)物中分離得到很多骨架結(jié)構(gòu)新穎，是具抗炎、抗腫瘤、抗菌活性顯著的化合物[12-14]。本研究以鉤藤中分離得到的一株內(nèi)生真菌Talaromycessp.1.88E為研究對象，對其使用大米培養(yǎng)基發(fā)酵，以期從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到具有良好生物活性的單體化合物，這對于篩選新藥以及開發(fā)新的藥用資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌株材料

菌株Talaromycessp.1.88E分離自鉤藤植株Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.莖葉部。通過18S rDNA系列測序，結(jié)合特征對比，該菌株被鑒定為Talaromycessp.1.88E(GenBank序列號No.KP235606.1)。菌株現(xiàn)保存于江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(編號FND098)。

1.1.2 主要試劑

PDA(P8931，BR)和PDB(P9240，BR)培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；大米培養(yǎng)基：使用500 mL三角瓶，裝80 g市售食用大米，120 mL純凈水，121 ℃高溫滅菌20 min。高效液相色譜使用的甲醇、甲酸、乙腈等均為色譜純購自上海泰坦科技股份有限公司；乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、甲醇、氘代試劑等為分析純購自上海泰坦科技股份有限公司；柱色譜硅膠(100～200目、300～400目)和硅膠預(yù)制板(GF254)購自煙臺新諾化工有限公司；實驗用水為娃哈哈純凈水；α-葡萄糖苷酶(G5003-100UN)、阿卡波糖和對硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒(C0038)、一氧化氮檢測試劑盒(S0021S)、脂多糖(S1735)、地塞米松和二甲基亞砜購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

AVANCE 400 MHz核磁共振(瑞士布魯克公司)；N-1210B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社)；Primaide-1430 DAD-1110 Pump高效液相色譜儀(株式會社日立制作社)；Nicolet 6700紅外光譜儀(美國賽默飛公司)；UV2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)；Xevo G2-XS Qtof高分辨質(zhì)譜(美國沃特世公司)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；DW-HL768超低溫冷凍儲存箱(中科美菱低溫科技股份有限公司)；BSC-1100生物安全柜(濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；MCO-18AC二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(PHC株式會社)；Spectra Max M2多功能酶標儀(美谷分子儀器(上海)有限公司)；CENCE L500離心機(廣州瑞豐實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 真菌大量發(fā)酵

將菌株Talaromycessp.1.88E接種至PDA平板，放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，使菌株活化。往裝有100 mL PDB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中接入活化的3方塊(大小約0.5 cm×0.5 cm)菌餅，培養(yǎng)3天即得種子液。往大米培養(yǎng)基中加入種子培養(yǎng)液，每瓶接入種子液15 mL，共發(fā)酵40瓶，于室溫下靜置培養(yǎng)45天。

1.3 提取與分離

內(nèi)生真菌Talaromycessp.1.88E的大米發(fā)酵產(chǎn)物粗提物52 g，采用硅膠柱分離，使用石油醚-乙酸乙酯(20∶1→0∶100，V/V)梯度洗脫，最后使用100%甲醇洗脫，得到8個組分(Fr.A～H)。組分Fr.D(4.6 g)采用MCI柱分離，使用甲醇-水(50∶50→100∶0，V/V)梯度洗脫，得到8個組分(Fr.D1～D8)。組分Fr.D5(974.7 mg)先經(jīng)MCI柱分離，再經(jīng)半制備高效液相色譜(50%甲醇等度洗脫，流速3 mL/min)純化后得到化合物2(10.3 mg)。組分Fr.D6(1716.3 mg)先經(jīng)硅膠柱分離，再經(jīng)半制備高效液相色譜(65 %甲醇等度洗脫，流速3 mL/min)純化后得到化合物5(10.3 mg)。組分Fr.E(0.6 g)采用ODS柱分離，使用甲醇-水(60∶40→100∶0，V/V)梯度洗脫，得到8個組分(Fr.E1～E8)。組分Fr.E4(72 mg)采用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜分離，使用100%甲醇等度洗脫，得到3個組分(Fr.E41～E43)。組分Fr.E42(27.4 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(65%甲醇等度洗脫，流速3 mL/min)純化后得到化合物4(4.1 mg)。組分Fr.E8(100.9 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(85%甲醇等度洗脫，流速3 mL/min)純化后得到化合物7(5.5 mg)。組分Fr.G(13.1 g)采用硅膠柱分離，使用甲醇-二氯甲烷(1∶40→100∶0，V/V)梯度洗脫，得到6個組分(Fr.G1～G6)。組分Fr.G4(1.2 g)采用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜分離，使用100% 甲醇等度洗脫，得到2個組分(Fr.G41-G42)，組分Fr.G42(433.2 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(59%甲醇等度洗脫，流速3 mL/min)純化后得到化合物3(5.4 mg)。組分Fr.G5(1.7 g)采用ODS柱分離，使用甲醇-水(65∶35→100∶0，V/V)梯度洗脫，得到3個組分(Fr.G51-G53)。組分Fr.G52(445.8 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(63%甲醇等度洗脫，流速3 mL/min)純化后得到化合物1(3.9 mg)和6(2.6 mg)。組分Fr.G53(1128.9 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜(61%甲醇等度洗脫，流速3 mL/min)純化后得到化合物8(3.0 mg)。

1.4 活性測定

1.4.1 抗炎活性

參照文獻方法[15]，先采用CCK-8法評估細胞毒性，排除假陽性結(jié)果。通過測定RAW 264.7細胞中的NO生成來篩選抗炎活性。將RAW 264.7細胞以2×104個/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去上清液，加入質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的LPS刺激RAW 264.7細胞，同時加入相應(yīng)濃度的待測樣品，分別設(shè)置空白對照組、LPS組、藥物組，地塞米松為陽性對照品，每組設(shè)3個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取50 μL上清液，順序加入50 μL Griess reagent Ⅰ和Griess reagent Ⅱ，避光反應(yīng)5 min后于酶標儀中波長540 nm下測定吸光度A，并計算IC50值。

1.4.2α-葡萄糖苷酶活性

參考文獻方法[16]，以PNPG為底物，在96孔板上測定α-葡萄糖苷酶活性，并用阿卡波糖作為陽性對照。酶與底物分別溶解于磷酸緩沖液(pH 6.8)。先加入不同濃度待測樣品溶液50 μL，再加入50 μLα-葡萄糖苷酶(0.2 U/mL)，室溫反應(yīng)6 min，加入50 μL PNPG(5 mmol/L)，37 ℃反應(yīng)10 min，加100 μL 0.2 mol/L碳酸鈉終止反應(yīng)，在波長405 nm波長處測吸光度值A(chǔ)。同時設(shè)置對照組與空白組，實驗重復(fù)三次，每次三組平行。計算酶活性抑制率=[1-(A樣品-A樣品空白)/(A對照-A空白)]×100%，使用Graph Pad Prism 8對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以樣品IC50的平均值表示。

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色液體，溶于甲醇；根據(jù)HR-ESI-MS：m/z199.097 6[M-H]-(calcd for C10H15O4，199.097 6)確定化合物分子式為C10H16O4，不飽和度為3；IR(KBr)νmax3 432、2 964、2 881、1 741、1 641、1 444、1 170 cm-1。UV(MeOH)λmax213、223 nm。綜合1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)(見表1)，通過HSQC相關(guān)判斷化合物1含有4個CH2，1個CH3，1個OCH3，1個CH，1個COOH。

根據(jù)H-3與H-4，H-4與H-5的1H-1H COSY相關(guān)信號確定C-3/C-4/C-5的連接順序，根據(jù)H-1′與H-2′，H-2′與H-3′的1H-1H COSY相關(guān)信號確定C-1′/C-2′/C-3′的連接順序。根據(jù)H-1′與C-1的HMBC相關(guān)，根據(jù)H-2′與C-2的HMBC相關(guān)判斷C-1′與C-2相連。根據(jù)H-3與C-1的HMBC相關(guān)，根據(jù)H-4與C-2的HMBC相關(guān)判斷C-3與C-2相連。根據(jù)6-OCH3與C-6的HMBC相關(guān)，根據(jù)H-4與C-6的HMBC相關(guān)判斷C-5與甲氧基之間通過羰基相連(見圖1)。根據(jù)NOESY譜中H-3與H-1′的相關(guān)判斷雙鍵為Z構(gòu)型。綜合以上分析確定化合物1結(jié)構(gòu)如圖2所示，命名為(Z)-6-methoxy-6-oxo-2-propylhex-2-enoic acid?；衔?的詳細結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始譜圖可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1關(guān)鍵的HMBC(→)和1H-1H COSY()相關(guān)信號

圖2 化合物1～8的化學(xué)結(jié)構(gòu)

化合物2白色固體，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z305.067 2[M-H]-(calcd for C15H13O7，305.066 7)，分子式為C15H14O7；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.03(1H，s，H-6′)，6.88(1H，s，H-3′)，6.57(1H，d，J= 2.5 Hz，H-6)，6.53(1H，d，J= 2.6 Hz，H-4)，5.02(2H，s，H-7′)，3.87(3H，s，5-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：141.4(C-1)，106.9(C-2)，162.5(C-3)，100.1(C-4)，163.9(C-5)，107.0(C-6)，130.8(C-1′)，126.5(C-2′)，114.6(C-3′)，146.0(C-4′)，146.6(C-5′)，115.4(C-6′)，69.0(C-7′)，54.7(5-OCH3)，172.5(COOH)。根據(jù)1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)分析，化合物2總共含有12個芳香碳，一個苯環(huán)為1，2，5-三取代，一個苯環(huán)為1，2，4，6-四取代?；谏鲜鰯?shù)據(jù)判斷化合物2為聯(lián)苯類化合物，根據(jù)H-6′與C-1、C-2′、C-4′、C-5′的HMBC相關(guān)；H-3′與C-1′、C-4′、C-7′的HMBC相關(guān)；H-6與C-1′、C-2、C-5的HMBC相關(guān)；H-4與C-2、C-3、C-5的HMBC相關(guān)；5-OCH3與C-5的HMBC相關(guān)確定化合物2為alteric acid，結(jié)構(gòu)如圖1所示，化合物2系首次報道核磁數(shù)據(jù)。

化合物3棕色固體，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z273.040 3[M-H]-(calcd for C14H13O4，273.040 5)，分子式為C14H14O4；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.67(1H，s，H-3′)，6.64(1H，s，H-6′)，6.32(3H，d，J= 2.6 Hz，H-2，H-4，H-6)，3.75(3H，s，5-OCH3)，2.10(3H，s，2′-CH3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：144.2(C-1)，108.8(C-2)，157.6(C-3)，98.9(C-4)，160.5(C-5)，106.3(C-6)，133.5(C-1′)，126.0(C-2′)，116.8(C-3′)，142.4(C-4′)，143.9(C-5′)，116.2(C-6′)，18.4(2′-CH3)，54.3(5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道一致，故化合物4確定為5′-methoxy-6-methyl-biphenyl-3,4,3′-triol。

化合物4白色固體，溶于氯仿；HR-ESI-MS：m/z371.113 9[M-H]-(calcd for C20H19O7，371.113 6)，分子式為C20H20O7；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：8.48(1H，s，H-6′)，7.08(1H，d，J= 2.3 Hz，H-3)，6.64(1H，d，J= 2.3 Hz，H-5)，6.61(1H，m，H-8′)，6.54(1H，d，J= 15.9 Hz，H-7′)，3.86(3H，s，3′-OCH3)，3.81(3H，s，4-OCH3)，3.78(3H，s，6-OCH3)，3.73(3H，s，7-OCH3)，1.97(3H，dd，J= 6.5，1.3 Hz，H-9′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：126.7(C-1)，130.1(C-2)，105.6(C-3)，161.1(C-4)，103.3(C-5)，144.4(C-6)，166.7(C-7)，192.0(C-8)，126.4(C-1′)，172.6(C-2′)，157.7(C-3′)，154.8(C-4′)，159.3(C-6′)，135.1(C-7′)，118.8(C-8′)，19.1(C-9′)，55.8(4-OCH3)，60.8(6-OCH3)，52.6(7-OCH3)，56.3(3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致，故化合物4確定為3-O-methylfunicone。

化合物5白色固體，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z287.056 6[M-H]-(calcd for C15H11O6，287.056 1)，分子式為C15H12O6；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.05(1H，s，H-5′)，6.91(1H，s，H-3′)，6.60(1H，d，J= 2.5 Hz，H-6)，6.56(1H，d，J= 2.5 Hz，H-4)，4.87(2H，br s，H-7′)，3.90(3H，s，5-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：128.1(C-1)，108.5(C-2)，164.0(C-3)，101.7(C-4)，165.5(C-5)，108.6(C-6)，174.1(C-7)，132.4(C-1′)，147.5(C-2′)，117.0(C-3′)，148.2(C-4′)，116.1(C-5′)，143.0(C-6′)，70.6(C-7′)，56.2(5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致，故化合物5確定為alternariol 1′-hydroxy-9-methyl ether。

化合物6白色固體，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z257.045 9[M-H]-(calcd for C14H9O5，257.045 5)，分子式為C14H10O5；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：10.86(1H，br s，4′-OH)，10.32(1H，br s，5-OH)，7.23(1H，d，J= 1.9 Hz，H-6)，6.70(1H，d，J= 2.4 Hz，H-5′)，6.62(1H，d，J= 2.4 Hz，H-3′)，6.36(1H，d，J= 1.9 Hz，H-4)，2.69(3H，s，6′-CH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：138.1(C-1)，97.4(C-2)，164.0(C-3)，100.8(C-4)，165.3(C-5)，104.2(C-6)，164.6(C-7)，108.9(C-1′)，152.6(C-2′)，101.5(C-3′)，158.3(C-4′)，117.5(C-5′)，138.2(C-6′)，25.1(6′-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道一致，故化合物6確定為格鏈孢酚。

化合物7白色固體，溶于丙酮；HR-ESI-MS：m/z271.063 2[M-H]-(calcd for C15H11O5，271.061 2)，分子式為C15H12O5；1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：11.97(1H，s，H-3)，7.30(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)，6.81(1H，d，J= 2.5 Hz，H-5′)，6.71(1H，d，J= 2.5 Hz，H-3′)，6.57(1H，d，J= 2.1 Hz，H-4)，3.98(3H，s，5-OCH3)，2.81(3H，s，6′-CH3)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：138.2(C-1)，98.9(C-2)，165.1(C-3)，99.0(C-4)，165.2(C-5)，103.7(C-6)，166.7(C-7)，109.7(C-1′)，158.5(C-2′)，101.8(C-3′)，153.2(C-4′)，117.5(C-5′)，138.7(C-6′)，55.3(5-OCH3)，24.7(6′-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道一致，故化合物7確定為5-甲氧基格鏈孢酚。

化合物8白色固體，溶于甲醇；HR-ESI-MS：m/z273.040 3[M-H]-(calcd for C14H9O6，273.040 5)，分子式為C14H10O6；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.51(1H，s，H-6′)，7.02(1H，d，J= 1.9 Hz，H-6)，6.77(1H，s，H-3′)，6.53(1H，d，J= 1.9 Hz，H-4)，3.87(3H，s，5-OCH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：137.5(C-1)，98.4(C-2)，163.6(C-3)，99.8(C-4)，164.9(C-5)，97.8(C-6)，166.6(C-7)，108.7(C-1′，C-6′)，149.5(C-2′)，103.2(C-3′)，144.2(C-4′)，143.8(C-5′)，55.9(5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]報道一致，故化合物8確定為altenuisol。

2.2 抗炎活性

在60 μmol/L濃度下化合物4表現(xiàn)較強的細胞毒性，細胞存活率為24%。其余化合物的細胞存活率均大于75%。在60 μmol/L濃度下化合物1～3、5～8對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7產(chǎn)生NO抑制率均低于50%。

2.3 α-葡萄糖苷酶活性

對化合物1～8進行α-葡萄糖苷酶抑制活性測試，化合物2、6對α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出弱的抑制效果，其IC50分別為338.5、375.8 μmol/L，陽性對照阿卡波糖IC50為273.5 μmol/L。其余化合物在450 μmol/L濃度時對α-葡萄糖苷酶抑制率低于40%。

3 討論與結(jié)論

本實驗采用各種色譜法從鉤藤內(nèi)生真菌Talaromycessp.1.88E的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個化合物，其中化合物1為新化合物，化合物2為首次報道核磁數(shù)據(jù)。我們對化合物1～8進行了抗炎活性和α-葡萄糖苷酶活性測試，只有化合物2、6對α-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出抑制效果?；衔?～8同為格鏈孢酚類化合物，格鏈孢酚類化合物取代基微小的差異對其活性產(chǎn)生較大影響[23,24]，只有化合物6對α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出弱的抑制作用，化合物6與化合物7唯一的區(qū)別在于A環(huán)的5號位置OH變成OCH3，化合物5、8的A環(huán)的5號位置也為OCH3，說明該位點的OH對α-葡萄糖苷酶活性可能起決定性作用。綜上所述，該研究為進一步挖掘鉤藤內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中的活性成分奠定基礎(chǔ)，通過測試分離的單體化合物對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞產(chǎn)生NO抑制作用和α-葡萄糖苷酶活性，探討化合物之間的構(gòu)效關(guān)系，為天然活性化合物的開發(fā)提供一定參考意義。