頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測定白術(shù)不同部位揮發(fā)性成分

易紫容，張睿胤，王佳玲，李可愛，張譽湘，陳淼芬，鄭亞杰*，唐 其*

1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長沙 410128；2湖南宏富農(nóng)牧業(yè)發(fā)展有限公司，平江 414509

白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)，菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，以根莖入藥，具健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白術(shù)具有改善胃腸功能、抗癌、保護神經(jīng)等藥理作用，并對免疫力低下、腦缺血、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抑郁、糖尿病等疾病具有潛在的治療效果[2]，揮發(fā)性成分是其藥理藥效作用的重要組成部分[3]。其中倍半萜類化合物蒼術(shù)酮(atractylon)，是白術(shù)主要藥效成分之一，具有抗腫瘤、降血壓、保護呼吸系統(tǒng)等藥理作用[4]。

目前針對白術(shù)蒼術(shù)酮的提取與分析主要采用水蒸氣蒸餾法，存在提取效率較低、化合物易損失等缺點。頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction technology，HS-SPME-GC-MS)是一種快速簡單的揮發(fā)性成分提取技術(shù)，無需經(jīng)過溶劑萃取等繁瑣的前處理過程[5]，具有萃取效率高、萃取時間短、樣品消耗量少、揮發(fā)性化合物損失少的優(yōu)勢。目前已廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果、酒類等樣品中揮發(fā)性成分的提取[6-8]。Guo等[9]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法分離鑒定了白術(shù)中的揮發(fā)性成分，并與采用傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法(steam distillation)提取的揮發(fā)性成分進行了比較，兩種方法所提取出的主要組分基本一致；Liu等[10]采用頂空液液萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對白術(shù)中揮發(fā)性成分進行測定，并與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)性成分進行對比。結(jié)果表明，兩種方法所提取的組分基本相同，可用于白術(shù)揮發(fā)性成分的測定。頂空固相微萃取結(jié)合氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)更加適合應(yīng)用于白術(shù)中揮發(fā)性物質(zhì)的提取。

Zhang等[11]通過比較不同產(chǎn)地白術(shù)蒼術(shù)酮含量，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自湖南平江的白術(shù)蒼術(shù)酮含量較多。目前，對白術(shù)中蒼術(shù)酮的研究與開發(fā)主要集中在其主根部位中，對于白術(shù)其它非藥用部位的相關(guān)研究較少，因此本實驗首次以平江白術(shù)主根、須根、莖、葉四個部位為原料，采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析白術(shù)四個部位蒼術(shù)酮成分含量差異，并比較其不同部位的揮發(fā)性成分組成差異，為白術(shù)非藥用部位揮發(fā)性成分的研究及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

GCMS-QP2010 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)，配有GC/MS solution色譜工作站和NIST.14、NIST.17質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫；HP-88(100 m×0.25 mm，0.20 μm，安捷倫公司)固相微萃取裝置(上海安譜實驗科技股份有限公司)，包括萃取纖維針頭(65 μm-PDMS/DVB、50/30 μm-DVB/Carboxen-PDMS)、固相微萃取手動進樣手柄、頂空樣品瓶；YB-1500A 型粉碎機(永康市速鋒工貿(mào)有限公司)；PL203 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；MM400混合型球磨儀(廣州艾威儀器科技有限公司)；Milli-Q Advantage A10 超純水制備系統(tǒng)(美國MILLPORE公司)。

1.2 實驗樣品

實驗用白術(shù)樣品于2020年11月10日在湖南省岳陽市平江縣湖南宏富農(nóng)牧業(yè)發(fā)展有限公司白術(shù)種植基地采集，選擇3個基地，每個基地采樣20株，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉塔斯教授鑒定為白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)，按部位分為白術(shù)的主根(AM-MR)、須根(AM-FR)、莖(AM-S)、葉(AM-L)。對照品蒼術(shù)酮(普思生物科技有限公司(成都)，純度≥98%)。

1.3 方法

1.3.1 材料準(zhǔn)備及樣品前處理

將白術(shù)放置60 ℃的烘干機中烘干至恒重，使用球磨儀使其粉碎，置于封口袋編號封口保存，備用。精密稱定0.5 g樣品，放置頂空樣品瓶中。

等比例稱取白術(shù)不同部位樣品，并均勻混合，精密稱定0.5 g，放置頂空進樣瓶中，用作質(zhì)量控制樣品。

將對照品使用正己烷稀釋，蒼術(shù)酮濃度為1.0 mg/mL；吸取稀釋后的對照品溶液1 μL于頂空樣品瓶中，擰緊瓶蓋，備用。

1.3.2 萃取頭纖維老化

組裝萃取進樣手柄與萃取纖維針頭，隨后插入氣相色譜儀的氣化室SPL1處并推出萃取纖維針頭，設(shè)定氣化室溫度為240 ℃，40 min后縮回萃取纖維針頭，取出萃取進樣手柄，完成纖維頭老化。

1.3.3 萃取方法

固相微萃取裝置設(shè)定溫度為70 ℃，將裝有樣品的萃取瓶固定在裝置中預(yù)熱40 min，再將萃取進樣手柄插入萃取瓶并推出萃取纖維針頭，40 min后縮回萃取針頭，取出萃取手柄，迅速插入GC進樣器中。

1.3.4 質(zhì)量控制

實驗開始前進行空載、空針、空瓶等空白實驗；正式實驗開始前、結(jié)束后插入質(zhì)量控制樣品，實驗方法同上；實驗樣品每組3個重復(fù)。

1.3.5 GC-MS測試條件

色譜條件：色譜柱為HP-88(100 m × 0.25 mm，0.20 μm)；進樣口溫度240 ℃；載氣高純氦氣(含有量99.99%)；柱流量為1.37 mL/min；分流比5∶1；程序升溫：初始柱溫60 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升到140 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升到210 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升到210 ℃，保持10 min，最后以5 ℃/min升到240 ℃，保持10 min。

接口溫度：220 ℃；離子源：EI源；離子源溫度：200 ℃，電子能量：70 eV；溶劑延遲：9.5 min；檢測器電壓：0.9 kV；質(zhì)荷比掃描范圍：50～600m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取纖維頭的優(yōu)化

不同顏色的固相微萃取纖維頭代表了不同的吸附膜種類，對揮發(fā)性成分的吸附能力存在較大差異。通過比較50/30 μm-DVB/Carboxen-PDMS、65 μm-PDMS/DVB(分別編號為1和2)兩種萃取纖維頭與對白術(shù)主根、須根、莖、葉混合樣品中蒼術(shù)酮的吸附能力，篩選出適合白術(shù)混合樣品中揮發(fā)性成分的萃取纖維頭。通過實驗對比，發(fā)現(xiàn)65 μm-PDMS/DVB萃取纖維頭對蒼術(shù)酮的萃取效果要強于50/30 μm-DVB/Carboxen-PDMS萃取纖維頭(見圖1)，因此本研究選取65 μm-PDMS/DVB纖維頭用于后續(xù)實驗。

圖1 不同萃取頭對蒼術(shù)酮吸附效果影響

2.2 揮發(fā)性成分分析

對白術(shù)不同部位(主根、須根、莖、葉)揮發(fā)性成分進行測定(見圖2)，經(jīng)NIST.14、NIST.14s、NIST.17-1、NIST.17-2等質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并通過查閱相關(guān)文獻、與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照分析標(biāo)準(zhǔn)品比對等方法，使用面積歸一法計算各個積分的色譜峰占總峰面積的百分比，得到白術(shù)不同部位不同化合物相對百分比含量(見表1)。統(tǒng)計分析采用SPSS 26.0軟件，包括方差分析采用單因素ANOVA法，多重比較采用Duncan′s法。

圖2 白術(shù)不同部位揮發(fā)性成分GC-MS TIC圖

對白術(shù)不同部位(主根、須根、莖、葉)干燥樣品中揮發(fā)性成分含量進行測定并分析其主要揮發(fā)性化合物在不同部位中的差異。白術(shù)四個部位共鑒定出70種化合物(見表1)，包括萜類(52種)、酯類(4種)、醛類(4種)、萘類(4種)、酮類(3種)化合物等，且不同部位揮發(fā)性成分的組成與含量差異較大(見圖3、4)。其中共有成分有14種；主根中特有成分有2種；須根中特有成分有11種；葉中特有成分有23種，相對較多；主要以萜烯類、萜烯醇類化合物為主。從主根部位共鑒定27種揮發(fā)性成分，蒼術(shù)酮(37.79%)為主要成分；須根部位共鑒定35種揮發(fā)性成分，主要為蒼術(shù)酮(25.85%)、β-倍半水芹烯(11.68%)、瓦倫亞烯(9.47%)、γ-欖香烯(6.47%)等；莖中鑒定32種揮發(fā)性成分，β-倍半水芹烯(12.09%)、蒼術(shù)酮(11.54%)含量相對較高；葉中共鑒定45種，主要成分為右旋大根香葉烯(18.74%)、D-檸檬烯(12.89%)、γ-依蘭油烯(8.56%)、石竹烯(6.65%)、蒼術(shù)酮(5.98%)等。

圖3 不同部位白術(shù)揮發(fā)性成分組成

圖4 不同部位白術(shù)揮發(fā)性成分Venn圖

主成分分析法通過降維、變量提取與壓縮數(shù)據(jù)來確定中藥資源的分類和聚類，并從中獲取能用于中藥分析鑒別的重要信息[12]，在中藥質(zhì)量研究上發(fā)揮著重要作用。本研究將測定的白術(shù)四個部位(主根、須根、莖、葉)揮發(fā)性化合物含量數(shù)據(jù)處理后進行主成分分析，共提取到五個主成分，其中第一主成分占比71.6%，第二主成分占比15%，故選取主成分一、二基本能涵蓋樣品的大部分成分信息。如圖5所示，明顯看出各樣品組間呈現(xiàn)出很好的聚集趨勢，組內(nèi)重復(fù)可以很好地聚集在一起，且組間出現(xiàn)明顯分離；不同部位白術(shù)樣品存在明顯的組間差異，表明不同部位白術(shù)揮發(fā)性化學(xué)成分具有顯著變化。其中白術(shù)主根、須根樣品為一大組，莖樣品為一大組，葉樣品為一大組，不同部位揮發(fā)性成分組成差異明顯；結(jié)合表1、圖3發(fā)現(xiàn)白術(shù)葉中萜烯類、萜烯醇類化合物種類、含量均高于其他部位，推測其原因主要為植物不同部位生理生化功能、生長環(huán)境等差異；Zhu等[13]研究藥用部位根莖中的揮發(fā)性成分時發(fā)現(xiàn)光照強度、溫度等因素對揮發(fā)性成分穩(wěn)定性均有影響，光照強度是影響揮發(fā)性成分穩(wěn)定性的主要因素；白術(shù)葉、莖作為白術(shù)的地上部分，其受到的光強和溫度均高于作為地下部分的白術(shù)主根、須根，因此不同部位揮發(fā)性成分的組成、含量產(chǎn)生顯著差異的原因可能也與光照強度、溫度等因素有關(guān)。部分萜類化合物在植物的自身防御與繁衍后代方面發(fā)揮重要作用[14]，如Yang等[15]在研究白術(shù)揮發(fā)油積累因素時表明，在植物防御過程中，白術(shù)體內(nèi)倍半萜類化合物的合成很可能受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，以應(yīng)對蟲害等脅迫。大根香葉烯D[16]和D-檸檬烯[17]等對昆蟲均有引誘作用，可能會對咬食白術(shù)葉昆蟲的天敵昆蟲及幫助白術(shù)花傳粉的昆蟲具有一定的吸引作用。

根據(jù)圖5的結(jié)果，繪制了白術(shù)不同部位揮發(fā)性成分聚類熱圖(見圖6)，通過聚類算法，發(fā)現(xiàn)白術(shù)主根與須根具有較高相關(guān)性，白術(shù)葉與其他部位則具有顯著差異，這與主成分分析結(jié)果一致。揮發(fā)性成分含量累積差異也具有鮮明特征，主要體現(xiàn)在白術(shù)葉與白術(shù)主根、須根之間。白術(shù)不同部位揮發(fā)性成分累積模式可大致分為兩大模塊，第一模塊主要在白術(shù)葉中顯著累積，如D-檸檬烯、芳樟醇等；第二模塊則主要在白術(shù)須根、主根中顯著累積，如蒼術(shù)酮等。另外對揮發(fā)性成分累積情況進行分析，發(fā)現(xiàn)白術(shù)莖中揮發(fā)性成分累積模式較特殊，局部覆蓋兩大模塊，推測可能與其在植物中負責(zé)物質(zhì)交流與運輸?shù)纳韺W(xué)功能有關(guān)。

圖5 白術(shù)不同部位揮發(fā)性成分PCA得分圖

圖6 白術(shù)不同部位揮發(fā)性成分熱圖

3 討論與結(jié)論

實驗發(fā)現(xiàn)，白術(shù)不同部位中揮發(fā)性成分積累具有較大差異。蒼術(shù)酮(見圖7)作為白術(shù)主要藥效成分，主要在白術(shù)根部累積，具有抗腫瘤、降血壓、保護呼吸系統(tǒng)、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、保肝、抗流感病毒、除螨等廣泛良好的藥理活性；本研究發(fā)現(xiàn)，除白術(shù)傳統(tǒng)入藥部位主根、莖外，其須根(25.85%)、葉(5.98%)中蒼術(shù)酮相對含量亦有較高水平；采收季白術(shù)莖葉占整株比例40%，主根占比40%，須根超過占比10%，然而莖、葉等部位多作廢棄物處理，具有較大開發(fā)利用潛力；Shao等[18]通過研究白術(shù)主根與須根的質(zhì)量差異得出，在以白術(shù)揮發(fā)性成分為主要藥效成分時，白術(shù)須根可考慮代替主根入藥；蒼術(shù)酮作為市場需求廣泛的藥效成分，相關(guān)質(zhì)量控制研究相對較少，并因提取技術(shù)、產(chǎn)量等因素一直制約了大規(guī)模的開發(fā)和利用，本研究可為其提取利用提供新的思路。蒼術(shù)酮極不穩(wěn)定，在常溫下易與水發(fā)生氧化反應(yīng)，生成白術(shù)內(nèi)脂I、III等化合物[19]。但在本實驗中四個部位均未發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)脂及相關(guān)化合物，其原因推測為揮發(fā)性成分萃取過程選用頂空固相微萃取法，避免了溶劑、高溫等其他的因素的干擾，且萃取時間較短。結(jié)合本實驗來看，頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有高效、微量、靈敏等特點，能夠更好地反映藥材本身揮發(fā)性成分組成、累積情況，目前在對植物源揮發(fā)性成分檢測分析的領(lǐng)域使用已十分廣泛,如枳殼、黃花菜等[20,21]，可為蒼術(shù)酮等植物源揮發(fā)性成分的檢測分析、生物合成途徑解析等相關(guān)研究提供技術(shù)選擇與參考。

圖7 蒼術(shù)酮化學(xué)結(jié)構(gòu)(左)及3D模型(右)

其次，發(fā)現(xiàn)白術(shù)葉中揮發(fā)性成分種類、相對含量相較于其他三者具有顯著差異；葉中共測定45種揮發(fā)性化合物，萜烯類化合物是白術(shù)葉中主要的揮發(fā)油成分。其中大根香葉烯D的相對含量最高(18.74%)，已被證明是黃花蒿、白花丹參等植物的關(guān)鍵抗菌活性成分[22,23]，被應(yīng)用于艾草精油等相關(guān)產(chǎn)品的制作；同時大根香葉烯D對害蟲、病菌等具有很強的吸引作用，可作為趨避劑的天然先導(dǎo)物[16]。D-檸檬烯是一種天然功能性單萜烯，在白術(shù)葉中有較高相對含量(12.89%)，具有顯著的抗腫瘤、抑菌消炎的活性[24]；此外，在食品領(lǐng)域，D-檸檬烯因其增香和抗氧化的特性常用于食品添加劑[25]；在農(nóng)藥方面，D-檸檬烯對某些昆蟲具有引誘作用，還能抑制部分雜草的生長[26]，因而可應(yīng)用于天然抗蟲、除草劑。綜上所述，白術(shù)葉、莖等部位在天然產(chǎn)物開發(fā)與利用領(lǐng)域具有良好前景。

當(dāng)前，白術(shù)市場需求較大，而對白術(shù)揮發(fā)性成分的研究幾乎都集中在其藥用部位根、莖，對于其葉、須根等非藥用部位研究開發(fā)相對較少，如白術(shù)葉等部位僅當(dāng)作廢棄物處理，若能對白術(shù)非藥用部位進行進一步的研究與開發(fā)，將提高資源利用率，緩解資源緊缺問題。本次實驗運用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)測定白術(shù)不同部位中揮發(fā)性成分，闡明其不同部位間揮發(fā)性成分組成差異，為白術(shù)非藥用部位揮發(fā)性成分的開發(fā)利用提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)；傳統(tǒng)檢測方法中蒼術(shù)酮存有易轉(zhuǎn)化等問題，本研究可為白術(shù)等相關(guān)藥材的質(zhì)量檢測控制提供技術(shù)參考。