基于質譜及分子對接探究大黃褐變機理

李東輝，吳紅偉，李國峰，楊新榮，司昕蕾，邊甜甜，張育貴，李越峰*

1甘肅中醫(yī)藥大學；2甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，蘭州 730000

大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖[1]，主要含有蒽醌類、鞣質類、酚酸類等成分，具有瀉下、抗炎、抑菌等藥理作用[2]。已有研究表明色度學分析方法和機器視覺技術可客觀評價藥材顏色[3]。近年來，大黃在化學成分、藥理作用及產地加工等方面研究較多，但對大黃顏色研究雖有涉及但并不全面。中藥材如同果蔬類，其顏色變化與酶促褐變及非酶促褐變密切相關[4]。酶促褐變是指在多酚氧化酶、過氧化物酶、氧化酶結合底物在有氧條件下反應形成醌，醌類物質進一步聚合生成黑色素[5]。

多酚氧化酶(polyphenol oxidases，PPO)是存在于動物、植物及微生物中的一類含銅離子蛋白酶。多酚氧化酶主要包括酪氨酸酶(tyrosinases)、兒茶酚氧化酶(catechol oxidases)及漆酶(laccases)具有催化酚類物質生成醌，醌類物質與氨基酸、蛋白質發(fā)生親核反應形成褐色聚合物[6]。過氧化氫酶(catalase)是一類金屬酶，其又是過氧化物酶體(peroxidases，POD)的標志酶，約占過氧化物酶體酶總量的40%[7]。過氧化物酶是植物在逆境條件下防御系統(tǒng)的關鍵酶之一，可調控超氧化物歧化酶及過氧化氫酶水平，具有氧化酚類化合物、清除過氧化氫和酚類、胺類毒性的作用，研究也表明多酚類為過氧化物酶及多酚氧化酶的主要底物[8]。高效液相及質譜具有專屬、靈敏度和準確性高的特點被廣泛用于醫(yī)藥行業(yè)[9，10]。分子對接(molecular docking)是指利用計算機技術，依據計算物理化學參數(shù)來預測配體(蛋白質、DNA/RNA、小分子)與受體蛋白生物大分子的結合模式及親合力[11]。本文采用HPLC技術及色差儀技術研究大黃鮮切過程成分變化及切面顏色，采用UPLC-MS/MS技術對大黃化學成分進行定性分析，采用HPLC技術及LC-MS技術對體外模擬反應體系進行檢測，采用分子對接技術預測酪氨酸酶與沒食子酸、兒茶素、大黃素等的結合能力，這為后續(xù)從多酚類物質褐變反應轉向蒽醌類物質褐變反應研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

新鮮大黃采自隴南市禮縣石橋鎮(zhèn)(采購時間：2021.11)，經甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的新鮮根及新鮮根莖。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈、磷酸(色譜級，天津市大茂化學試劑廠)；無水碳酸鈉(分析純，煙臺市雙雙化工有限公司)；沒食子酸(CAS149-91-7)，由成都普思生物科技有限公司提供，對照品質量分數(shù)均大于98%；多酚氧化酶(CAS#9002-10-2)、過氧化氫酶(CAS#9002-05-2)均由合肥博美生物科技有限責任公司提供。

1.1.3 儀器設備

SHIMADZU Nexera X2超高效液相色譜儀(島津公司)；AB4500 Q TRAP質譜(AB SCIEX公司)；1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；SC-10色差儀(深圳三恩馳科技有限公司)；BT125D型十萬分之一分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；1290-6460液相串聯(lián)三重四極桿質譜儀(美國Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1 大黃樣品制備

將大黃藥材除去泥土、須根，刮去外皮，按《中國藥典》(2020版，一部)規(guī)定及本課題組前期研究基礎[12]切制成厚度為2.5 mm的飲片，將上述飲片分為2.0 g若干份，晾干，在0、1/6、1/2、1、2、4、8、12、24、36 h時間點(0～36 h內，即晾干過程)依次取上述樣品標為1～10號。

1.2.2 基于色差儀的樣品顏色測定

測定光源為D65；色彩空間為CIE，Lab；偵測器為硅光電二極管；測量孔徑Φ = 4 mm；定位方式為光照定位和十字架定位；光源為LED藍光激發(fā)。為減少不同儀器間產生的誤差，故選定一張白紙為標準樣品，將“1.2.1”項1～10號樣進行色度值測量，重復測量3次，取平均值，按公式E*ab=(L*2+a*2+b*2)1/2計算總色差值[13]。

1.2.3 基于HPLC技術的大黃樣品測定

1.2.3.1 供試品制備

將“1.2.1”項下1～10號樣品依次切碎研細，加25 mL甲醇于錐形瓶中，稱定質量，超聲40 min，冷卻，甲醇補足減失質量，過0.45 μm濾膜，并儲存在樣品瓶中進行測定分析。

1.2.3.2 色譜條件

色譜柱Eclipse Plus C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～15 min，2%→15% A；15～20 min，15%→20% A；20～30 min，20%→20% A；30～60 min，20%→30% A；60～80 min，30%→55% A；80～90 min，55%→75% A；90～95 min，75%→80% A；95～100 min，80%→100% A；進樣量10 μL；檢測波長為254 nm；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min。將“1.2.3.1”項1～10號樣按“1.2.3.2”條件進樣測定。

1.2.4 基于UPLC-MS/MS技術的大黃樣品定性分析

1.2.4.1 供試品制備

將“1.2.1”項下10號樣品粉碎過50目篩，取1.0 g加25 mL甲醇于錐形瓶中，稱定質量，超聲40 min，冷卻，甲醇補足減失質量，過0.22 μm濾膜，并儲存在樣品瓶中，由上海拜譜生物科技有限公司進行測定分析。

1.2.4.2 色譜條件

Agilent SB-C18(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)。流動相由溶劑A，含0.1%甲酸的純水，以及溶劑B，含0.1%甲酸的乙腈組成。在9 min內，對5% A和95% B進行線性梯度分析，并將5% A和95% B保持1 min。隨后，在1.1 min內調整為95% A，5.0% B的成分，并保持2.9 min。流速設定為每分鐘0.35 mL；柱溫設定為40 ℃；進樣量為4 μL。流出物與ESI-三重四極桿線性離子阱(QTRAP)-MS交替連接。

1.2.4.3 質譜條件

離子源，渦輪噴射；源溫度550 ℃；離子噴射電壓(IS)5 500 V(正離子模式)/-4 500 V(負離子模式)；離子源氣體I(GSI)、氣體II(GSII)、簾氣(CUR)分別設置為50、60和25.0 psi；碰撞激活解離(CAD)為高，碰撞氣體(氮氣)設置為中等，每個離子對是根據優(yōu)化的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)進行掃描。

1.2.4.4 數(shù)據處理及分析

利用軟件Analyst1.6.3 處理質譜數(shù)據。通過篩選出每個物質的特征離子，在檢測器中獲得特征離子的信號強度，用MuliaQuant軟件打開樣本下機質譜文件，進行色譜峰的積分和校正工作。檢索Massbank(http://www.massbank.jp)數(shù)據庫及上海拜譜生物科技有限公司自建數(shù)據庫進行成分結構鑒定。

1.2.5 溶液制備

1.2.5.1 粗酶液制備

將“1.2.1”項下1號樣品迅速切碎研細于(已冰浴)研缽中，加入10 mL預冷的pH 7.0磷酸鹽緩沖液，在4 ℃，10 000 r/min條件下高速離心15 min，得上清液即為粗酶液[14]。

1.2.5.2 多酚氧化酶液及過氧化氫酶液的制備

稱取5.00 mg多酚氧化酶固體及5.00 mg過氧化氫酶固體以蒸餾水分別定容于5 mL容量瓶中即得。

1.2.5.3 反應底物的配制

稱取沒食子酸25.00 mg，加蒸餾水定容至5 mL，即得對照品溶液。取配置好的對照品溶液1 mL以蒸餾水稀釋至2 mL作為沒食子酸反應液。

1.2.6 體外模擬褐變反應體系的構建

將試管標記為A0(反應組)、A1(對照組)。A0：0.5 mL沒食子酸反應液 + 0.5 mL多酚氧化酶液(或粗酶液)+ 2 mL pH 7.0磷酸緩沖液，A1：0.5 mL沒食子酸反應液 + 0.5 mL蒸餾水 + 2 mL pH 7.0磷酸緩沖液，設定反應體系溫度為30 ℃，以構建多酚氧化酶與沒食子酸的體外反應體系。分別在反應0 h、36 h時取樣1 mL，加入等體積的甲醇，終止反應，即為不同反應時間點測定組[15]。

將試管標記B0(反應組)、B1(對照組)。B0：0.5 mL沒食子酸反應液 + 0.5 mL過氧化氫酶液(或粗酶液)+ 2 mL pH 8.0磷酸緩沖液，B1：0.5 mL沒食子酸反應液 + 0.5 mL蒸餾水 + 2 mL pH 8.0磷酸緩沖液，設定反應體系溫度為30 ℃，構建過氧化氫酶與沒食子酸的體外反應體系。分別在反應0 h、36 h時取樣1 mL，加入等體積的甲醇，終止反應，即為不同反應時間點的測定組[15]。

1.2.7 基于HPLC技術分析酶促褐變反應

Eclipse Plus C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)。流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～5 min，2% →10% A；5～10 min，10%→15% A；10～40 min，15%→90% A。進樣量10 μL；檢測波長320 nm；柱溫25 ℃；流速為1 mL/min。采用HPLC法對各反應體系0 h及36 h反應體系液的底物與產物進行測定分析。

1.2.8 基于LC-MS技術分析酶促褐變反應

色譜條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm × 50 mm × 1.8 μm)，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量10 μL，流動相為0.1%的甲酸水(A)-甲醇(B)，以10% A及90% B等度洗脫2 min。

質譜條件：AJS ESI 源，正離子模式。干燥氣溫度為325 ℃，干燥氣流速為5 L/min，霧化氣壓力為45 psi，鞘氣溫度為 300 ℃，鞘氣流速11 L/min，毛細管電壓為3 500 V。對36 h時反應體系液褐變產物進行質譜分析。

1.2.9 基于分子對接技術的關鍵酶與底物親合力預測

多酚氧化酶包括酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶及漆酶。酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，tyrosinase，TYR)是一種結構復雜的含多亞基的含銅氧化還原酶，也是調控黑色素生成的限速酶，廣泛存在于微生物、動植物和人體中，這種酶參與黑色素合成可將單酚羥基化為二酚，將鄰二酚氧化為鄰二醌，鄰二醌再反應后為黑色素，如馬鈴薯切片暴露在空氣中出現(xiàn)變黑現(xiàn)象[16]。因此，本文以酪氨酸酶為關鍵酶分別與多酚類成分(沒食子酸、兒茶素、表兒茶素)及蒽醌類成分(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)進行對接。配體與受體可自發(fā)結合的條件為分子與靶標蛋白的最低結合能均小于0，參考相關文獻[17]在PDB數(shù)據庫中查找關鍵蛋白酪氨酸酶的PDB ID為：2Y9X，在Pubchem數(shù)據庫查找活性小分子的2D結構(sdf格式)，采用Maestro 10.2軟件進行對接。

2 結果與分析

2.1 大黃切面顏色

1～10號樣在36 h內，顏色由棕黃色變?yōu)楹诤稚?見圖1)，表明大黃在鮮切晾干過程中發(fā)生酶促褐變導致大黃切面顏色變化明顯。L*值從54.22變?yōu)?8.91，a*值從18.48變?yōu)?0.15，b*值從45.77變?yōu)?0.72，總色度E*ab值從73.32變?yōu)?6.98。(見表1)。實驗結果也表明大黃在鮮切初期，其顏色及水分變化明顯，后期逐漸減慢，這可能是因為鮮大黃體內含水量高新陳代謝活躍，其后在水分快速下降的同時，大黃機體啟動抗干旱機制，促使酶活力降低，顏色變化緩慢。36 h后樣品質量、水分及顏色均不發(fā)生明顯變化，故以36 h為實驗結點。

圖1 大黃切面顏色

表1 各樣品顏色色度值

2.2 各樣品成分動態(tài)變化

由圖2可知，不同晾干時間點的大黃樣品色譜峰峰面積呈不同程度的減少。前30 min內各成分峰面積出現(xiàn)一定程度的增加，其后逐漸減少，這可能是因為組織細胞遭受機械破壞后，細胞內容物流出量增加導致各成分峰面積呈現(xiàn)短暫上升趨勢，同時褐變關鍵酶與內容物相接觸，在氧氣的作用下，酶促褐變反應加快，有效成分減少，其后由于水分流失，大黃機體啟動抗干旱機制，酶活力降低，有效成分變化緩慢。綜上，大黃在此過程中樣品色譜峰峰面積減少。

圖2 1～10號樣品色譜圖

2.3 質譜分析結果

2.3.1 大黃樣品正負離子模式

大黃樣品在正負離子模式下的總離子流圖示于圖3。

圖3 大黃樣品正負離子模式下TIC圖

2.3.2 大黃樣品化學成分鑒定

以正離子模式下相對保留時間為1.83 min的m/z169.01的碎片離子為例，說明大黃樣品中不同化合物的鑒定過程。m/z169.01碎片離子的 MS2光譜如圖4A所示。根據m/z值計算得該化合物的可能元素組成為C7H6O5，在此基礎上與整個數(shù)據庫中的參考化合物進行比較，并將碎片離子m/z169.01、125.02及其相應強度與數(shù)據庫中錄入的參照化合物進行比較。根據上述化合物信息的對比分析，該化合物被鑒定為沒食子酸，其裂解方式如圖4B所示。

圖4 正離子模式下沒食子酸二級質譜圖及裂解方式圖

以正離子模式下相對保留時間為7.88 min的m/z269.05的碎片離子為例，說明大黃樣品中不同化合物的鑒定過程。m/z269.05碎片離子的MS2光譜如圖5A所示。根據m/z值計算得該化合物的可能元素組成為C15H10O5，在此基礎上與整個數(shù)據庫中的參考化合物進行比較，并將碎片離子m/z269.05、225.05及其相應強度與數(shù)據庫中錄入的參照化合物進行比較。根據上述化合物信息的對比分析，該化合物被鑒定為大黃素，其裂解方式如圖5B所示。參照上述大黃素鑒定方法，其他化合物的鑒定結果見表2。

圖5 正離子模式下大黃素二級質譜圖及大黃素裂解方式圖

表2結果所示，大黃樣品中共鑒定出30種化合物，主要包括酚酸類、蒽醌類、黃烷醇類以及其他類。

表2 化合物鑒定及數(shù)據歸屬

2.4 反應體系顏色

由圖6可知，粗酶液與沒食子酸反應前后顏色變化明顯，如圖6A，從黃棕色變?yōu)楹诤稚?，表明酶類與沒食子酸發(fā)生褐變反應導致體系顏色明顯變化。考慮到提取的粗酶種類復雜，因此，分別構建沒食子酸與多酚氧化酶液及過氧化氫酶液的反應體系，以便對后續(xù)底物與產物消長情況進行分析。實驗結果也表明在多酚氧化酶液反應體系中，體系液由近無色轉變?yōu)楹诤稚?，反應?6 h后體系顏色呈黑褐色，如圖6B；同樣過氧化氫酶液反應體系顏色變化如圖6C所示。

圖6 反應體系顏色

2.5 多酚氧化酶液與沒食子酸反應分析

2.5.1 多酚氧化酶液與沒食子酸反應的HPLC分析

由圖7可知，反應0 min的HPLC譜圖上只檢測到了沒食子酸成分的存在，如圖7A，當反應體系在36 h沒食子酸含量比0 min明顯降低，并檢測到新峰的出現(xiàn)，即為多酚氧化酶與沒食子酸反應產生的新物質。如圖7B。隨著時間的延長，A1組因不存在多酚氧化酶且體系液中不發(fā)生酶促褐變反應，沒食子酸含量在不同時間點幾乎不變，而A0組中在不同的時間點沒食子酸含量逐漸減少，36 h后基本檢測不到沒食子酸成分。結合圖8得出，隨著體系反應時間的延長，沒食子酸峰面積從初始的2 801變?yōu)?13.3，最終消耗殆盡，而產物的含量基本保持不變。因此，可以確定多酚氧化酶與沒食子酸發(fā)生了酶促褐變促使整個反應體系顏色加深。

圖7 反應體系HPLC圖譜

圖8 反應體系HPLC局部放大譜圖

2.5.2 基于LC-MS技術分析多酚氧化酶液與沒食子酸的氧化產物

對36 h的反應液進行初步分析發(fā)現(xiàn)，在36 h體系液有m/z130.20、200.20、304.00、418.80、585.10、701.30、814.50的物質(見圖9)，表明反應體系發(fā)生了褐變反應且有新物質生成。

圖9 質譜圖

2.6 過氧化氫酶液與沒食子酸的反應分析

2.6.1 過氧化氫酶液與沒食子酸的HPLC分析

0 h的HPLC譜圖上只檢測到了沒食子酸成分存在(見圖10A)，反應36 h的譜圖上沒食子酸含量比0 h明顯降低。如圖10B，并檢測到2個新峰的出現(xiàn)，即為過氧化物酶與沒食子酸反應的新物質。實驗結果也表明隨著時間的延長，B1組因無過氧化物酶不發(fā)生酶促褐變反應，不同時間點沒食子酸含量幾乎不變，而B0組中沒食子酸含量隨著時間的延長逐漸減少，實驗結果也表明沒食子酸的峰面積從2 701降到152，最終消耗殆盡，而產物的含量基本不變。因此，過氧化氫酶與沒食子酸發(fā)生了酶促褐變導致反應體系顏色變化明顯。

圖10 反應體系HPLC圖譜

2.6.2 基于LC-MS技術分析多酚氧化酶液與沒食子酸的氧化產物

對36 h的反應液分析發(fā)現(xiàn)，在36 h時體系液m/z130.20、200.20、304.00、418.80、531.50、585.10、701.30、814.50(見圖11)。這說明反應體系發(fā)生了褐變反應且有新物質出現(xiàn)，也可能是酶促褐變反應是不斷氧化的過程導致其褐變產物的物質結構及分子量不斷發(fā)生變化的結果。

圖11 質譜圖

2.7 對接結果

對接結果如圖12及圖13所示，其更加直接反應了化合物與蛋白殘基形成的氫鍵作用和疏水(堆積)作用。結果表明最低結合能均小于0，表示酪氨酸酶與沒食子酸等可發(fā)生相互作用(見表3)。

圖12 與酪氨酸分子對接2D圖

圖13 酪氨酸分子對接3D圖

表3 與酪氨酸酶對接結果

3 結論與討論

中藥材采收加工是藥材品質形成的重要環(huán)節(jié)。大黃在采收加工過程中易遭受不同程度的機械破壞，使其有效成分含量、外觀、顏色、水分、質量均發(fā)生顯著變化[3]。實驗結果表明，鮮大黃橫切面呈黃色，其后顏色逐漸加深至黑褐色。色差儀測定結果表明L*、a*、b*及E*ab值變化明顯。UPLC-MS/MS結果表明大黃主要含有酚酸類、蒽醌類、黃烷醇類以及其他類成分。分子對接結果也表明酪氨酸酶與多酚類及蒽醌類均具有強結合力，這也為后續(xù)從蒽醌類成分出發(fā)探究褐變機理提供了思路。結果表明大黃鮮切初期顏色變化明顯，后期逐漸減慢，這可能是因為水分快速下降的同時，大黃機體啟動抗干旱機制，其通過自身調節(jié)來適應干旱脅迫，進而促使酶促反應減弱，顏色變化緩慢，有效成分減少變慢[18]。實驗結果也表明多酚氧化酶液、過氧化氫酶與沒食子酸的體系顏色變化明顯，底物沒食子酸含量逐漸減少直至消失，并有新產物出現(xiàn)。鑒于此，后續(xù)可采用中藥化學手段，采用制備液相分離制備褐變產物，并將分離的褐變產物采用核磁共振光譜及波譜手段確定化合物的結構。

酶促褐變包括多酚氧化酶及過氧化物酶，多酚類成分為過氧化物酶和多酚氧化酶主要褐變底物[19]。大黃含有多糖類成分、氨基酸類成分、酚酸類成分、蒽醌類等成分[1]，這為大黃發(fā)生酶促褐變反應提供了條件。大黃與菊花如同，富含酚酸類成分，在受到機械破壞后，酚類物質、酶及氧氣三者相互接觸發(fā)生褐變反應，顏色變化明顯[15]?，F(xiàn)有研究表明果蔬類及中藥材在加工和儲藏過程也易發(fā)生褐變反應，如富含沒食子酸、兒茶素、表沒食子、兒茶素等成分是蘋果、梨、獼猴桃、馬鈴薯等發(fā)生褐變的主要底物[20]。目前，多酚氧化酶與過氧化物酶被認為是含多酚類物質的藥材及蔬果發(fā)生褐變的主要原因。因此，在大黃的采收加工過程中，可通過抑制關鍵酶活性降低對底物成分的消耗，阻止酶促褐變現(xiàn)象的發(fā)生。多酚氧化酶又包括酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶及漆酶，后續(xù)可分別以酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶及漆酶為關鍵酶分別與底物沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、大黃素等物質反應，以中藥化學手段最終鑒定產物結構，以推測褐變反應的可能機理[21]。本文從宏觀角度采用色差儀量化大黃顏色，其次從化學成分峰面積變化角度出發(fā)說明大黃發(fā)生酶促褐變過程。綜上，多酚氧化酶和過氧化物酶是引起褐變的主要反應，在大黃采收加工過程中可以抑制多酚氧化酶及過氧化物酶的活性，從而有效提升大黃藥材的品質，同時也為其他富含酚類藥材酶促褐變的控制提供思路。