基于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析百蕊草醇提物的化學(xué)成分

周思倩，方 艷，譚金桃，田 靜，何 苗，馬丹鳳，龍紅萍*

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410013；3湖南省兒童醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)沙 410007

百蕊草為檀香科(Santalaceae)植物百蕊草(ThesiumchinenseTurcz.)的干燥全草，其味微苦、澀、辛，性寒，具有清熱消炎，止咳化痰，退熱的功效[1]，現(xiàn)代藥理研究表明百蕊草有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎等作用，因而被廣泛用于治療肺炎、扁桃體炎、上呼吸道感染等疾病[2]。百蕊草作為一種民間草藥，1975年收載于《安徽中草藥》一書(shū)，《中國(guó)藥典》1977年版首次將百蕊草收錄，現(xiàn)收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版[3]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道百蕊草中主要含有黃酮類、生物堿類和有機(jī)酸類等有效成分，Zou等[4]對(duì)百蕊草乙醇提物通過(guò)理化常數(shù)測(cè)定和光譜分析鑒定，從百蕊草中分離純化了10個(gè)黃酮類化合物，Wang等[5]從百蕊草總生物堿部位分離得到N-甲基金雀花堿、白金雀兒堿和槐果堿3個(gè)生物堿類成分。然而，盡管在化學(xué)成分分析方面的研究已經(jīng)取得了進(jìn)展，但對(duì)百蕊草化學(xué)成分的了解仍局限于黃酮類和少數(shù)生物堿類成分，尚缺乏對(duì)百蕊草中的有效成分進(jìn)行系統(tǒng)研究。

UPLC-Q-TOF-MS/MS分析技術(shù)是現(xiàn)在中藥成分研究領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛的定性測(cè)定方法，集UPLC高效的色譜分離能力和Q-TOF高分辨質(zhì)譜的高靈敏度于一體，可快速對(duì)中草藥復(fù)雜成分進(jìn)行定性分析[6]。因此，本研究運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)百蕊草醇提物的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，對(duì)于明確百蕊草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，確保臨床用藥安全有效等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1290UPLC-6540 Q-TOF色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent科技公司)；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱；超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；S-23高速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司)；AUW120D電子分析天平(日本SHIMADZU公司)。

1.2 藥物與試劑

色譜甲醇、質(zhì)譜乙腈(均購(gòu)于德國(guó)Merck Millipore公司)；蒸餾水(深圳屈臣氏蒸餾水有限公司)；甲酸銨(質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司)。

氧化苦參堿(批號(hào)110780-201508)；蕓香苷(批號(hào)100080-201811)、山柰酚(批號(hào)110861-202013)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷(百蕊草素Ⅰ)對(duì)照品(19091201)、槐果堿(18032803)、紫云英苷(百蕊草素Ⅱ)對(duì)照品(19092602)，HPLC分析，純度≥98%，均購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

百蕊草購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床中藥學(xué)教研室陳文明鑒定為檀香科植物百蕊草(ThesiumchinenseTurcz.)全草，樣品(201903004)保存于湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床中藥學(xué)教研室。

1.3 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%→15% B；5～10 min，15%～35% B；10～20 min，35%→65% B；20～27 min，65%→85% B；)體積流量0.4 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子分別檢測(cè)，一級(jí)、多級(jí)模式分別掃描。離子源電壓3.5 kV，毛細(xì)管加熱溫度為350 ℃，鞘氣壓力241.3 kPa，輔氣壓力為68.9 kPa，離子源溫度350 ℃，鞘氣、輔助氣均為氮?dú)狻Ｙ|(zhì)譜質(zhì)量軸校準(zhǔn)采用外標(biāo)法(質(zhì)量誤差為5×10-6)，校準(zhǔn)質(zhì)量正離子選擇118.086 255、322.048 121、622.028 960、922.009 798、1 221.990 637和1 521.971 475，負(fù)離子選擇119.036 9、1 033.988 2。一級(jí)全掃質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 700，分辨率30 000；二級(jí)質(zhì)譜采用依賴性掃描，掃描范圍為m/z50～1 000，二級(jí)Fragment電壓為10、20、40 V，在一級(jí)掃描基礎(chǔ)上選取前3強(qiáng)進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞解離(CID)獲取其二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.5 百蕊草溶液的配制

1.5.1 供試品溶液的制備

將百蕊草藥材粉碎過(guò)40目篩，稱取5 g，精密稱定，加30 mL甲醇，稱定重量，超聲提取30 min(2次)后取出，靜置冷卻后，加入甲醇補(bǔ)充到超聲前溶液重量，取上清液，離心5 min(8 000 r/min)，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜濾過(guò)，即得百蕊草的樣品溶液，作為液質(zhì)分析樣品。

1.5.2 對(duì)照品溶液的制備

取山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷、氧化苦參堿、蕓香苷、山柰酚、槐果堿、紫云英苷6個(gè)對(duì)照品各4.0 mg，精密稱定后置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，靜置后定容到刻度，制成6個(gè)對(duì)照品的貯備液，進(jìn)樣前分別從6個(gè)對(duì)照品貯備液中精確移取200 μL混合均勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)液質(zhì)系統(tǒng)分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)查閱百蕊草藥材化學(xué)成分相關(guān)文獻(xiàn)，收集百蕊草中的化學(xué)成分并建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站中的分子特征提取(MFE)功能和中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)(TCM-DATA)，根據(jù)質(zhì)譜掃描提供化合物的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)譜碎片離子信息進(jìn)行分析，選擇誤差在5×10-6內(nèi)的分子式與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行初步比對(duì)，對(duì)化合物進(jìn)行初步鑒定，其次與自建的數(shù)據(jù)庫(kù)和對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)對(duì)百蕊草醇提物化學(xué)成分進(jìn)一步確定，同時(shí)對(duì)百蕊草醇提物中化合物主要類型的裂解規(guī)律進(jìn)行總結(jié)。自建數(shù)據(jù)庫(kù)化合物信息包括化學(xué)成分名稱、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、CAS號(hào)等信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 百蕊草提取物質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，按“1.5”項(xiàng)下條件檢測(cè)供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)百蕊草提取物中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，得到的正、負(fù)離子模式的總離子流圖(TIC)見(jiàn)圖1。山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷、氧化苦參堿、蕓香苷、山柰酚、槐果堿、紫云英苷6個(gè)對(duì)照品正離子模式下總離子流圖，如圖2所示。根據(jù)質(zhì)譜生成的化合物信息結(jié)合二級(jí)碎片離子，同時(shí)結(jié)合對(duì)照品比對(duì)及相關(guān)參考文獻(xiàn)，對(duì)百蕊草醇提物的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，共鑒定出54個(gè)化學(xué)成分。其中包含16個(gè)黃酮類、10個(gè)生物堿類、5個(gè)二萜類、5個(gè)有機(jī)酸類和其他類化合物，首次鑒定出25個(gè)化合物結(jié)構(gòu)式如圖3所示，化學(xué)成分的保留時(shí)間、分子式、化合物名稱、碎片離子信息等信息數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖3 首次從百蕊草屬中鑒定化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

表1 百蕊草醇提物中的成分結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

圖1 百蕊草醇提物UPLC-Q-TOF-MS/MS分析的總離子流圖

圖2 對(duì)照品正離子模式分析的總離子流圖

2.2 各類化合物結(jié)構(gòu)及裂解特點(diǎn)

2.2.1 生物堿類化合物分析

百蕊草提取物中生物堿類化學(xué)成分主要為喹啉里西啶類生物堿，該生物堿由兩個(gè)蒎啶共用一個(gè)N原子稠合而成，在正離子模式下以[M+H]+的形式存在，其二級(jí)質(zhì)譜碎片離子多是各環(huán)逐漸裂解，易產(chǎn)生m/z150.128 2的特征碎片離子。本品鑒定出的喹啉里西啶類生物堿化合物有N-甲基金雀花堿(2)、槐胺堿(4)、白金雀兒堿(5)、槐果堿(10)、氧化苦參堿(11)等，以槐果堿(10)和氧化苦參堿(11)的解析為例了解喹啉里西啶類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律。

化合物10：經(jīng)對(duì)照品比對(duì)鑒定為槐果堿(C15H22N2O)，在正離子模式下得到m/z247.171 5[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜分析，準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子C3H4O得到m/z176.106 8碎片離子，同時(shí)準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)RDA重排得到m/z為150.128 2的特征碎片離子，再接著斷裂一分子CH2和C2H2產(chǎn)生m/z為136.584 4和110.094 2的碎片離子，其碎片離子的可能裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖4 槐果堿可能裂解途徑

化合物11：經(jīng)對(duì)照品對(duì)比鑒定為氧化苦參堿(C15H24N2O2)，其精確相對(duì)分子質(zhì)量的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z265.190 8，準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子OH得到m/z249.026 6的碎片離子，接著各環(huán)逐漸裂解，分別脫去C2H4、C3H6得到m/z為221.878 3、207.046 1的碎片離子，其中m/z為207.046 1的碎片離子繼續(xù)脫去C2H5形成m/z為177.099 6的碎片離子，m/z為177.099 6的碎片離子斷裂一分子C2H4得到m/z150.128 2的特征離子碎片峰，其碎片離子的可能裂解途徑如圖5所示。

圖5 氧化苦參堿可能裂解途徑

2.2.2 黃酮類化合物分析

黃酮類化合物是百蕊草提取物中主要的化合物類型，是一類基本母核為2-苯基色原酮的化合物，大部分以游離形式、與糖結(jié)合成苷類或以碳糖基的形式存在。黃酮類化合物在正離子模式中主要以[M+H]+和[M+Na]+峰形式存在，由于具有較多羥基，在負(fù)離子模式中易形成[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，碎片離子斷裂多脫去糖鏈形成苷元離子和脫去CO、H2O為主，C環(huán)上易發(fā)生RDA裂解反應(yīng)，m/z163.002 7、151.032 0是黃酮類苷元裂解產(chǎn)生的特征離子峰。結(jié)合對(duì)照品比對(duì)與相關(guān)文獻(xiàn)，共鑒定出16個(gè)黃酮類成分，包括14個(gè)黃酮醇類和2個(gè)黃烷酮類，分別為山柰酚-3-槐二糖-7-鼠李糖苷(13)、大薊苷(15)、山柰酚-3，7-二葡萄糖苷(16)、異鼠李素-3,7-O-二葡萄糖苷(25)、蕓香苷(26)、山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷(27)、槲皮素-7-O-葡萄糖苷(28)、紫云英苷(31)、山柰酚-3-O-(6′′-O-乙?；?葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷(32)、山奈酚(46)等。

化合物46：經(jīng)對(duì)照品對(duì)照鑒定為山柰酚(C15H10O6)，其精確相對(duì)分子質(zhì)量的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z285.048 7，準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子CO得到m/z257.052 5碎片離子，接著脫去CO得到m/z229.043 9碎片離子，繼續(xù)脫去一分子H2O得到m/z211.044 2碎片離子，黃酮結(jié)構(gòu)中的A環(huán)易發(fā)生RDA裂解反應(yīng)得到m/z151.032 0碎片離子，其碎片離子的可能裂解途徑如圖6所示。

圖6 山柰酚可能裂解途徑

2.2.2.1 黃酮-O-單糖苷類化合物分析

百蕊草提取物中的黃酮類化合物多為黃酮醇類化合物，且苷元多以山柰酚和槲皮素為主，黃酮-O-單糖苷類化合物苷元含有多個(gè)酚羥基，在負(fù)離子模式下易產(chǎn)生[M-H]-離子，多脫去糖鏈形成苷元離子，易產(chǎn)生C環(huán)開(kāi)環(huán)離子，如m/z255.030 7、227.035 0、211.045 2碎片離子，黃酮-O-單糖苷類化合物以槲皮素-7-O-葡萄糖苷(28)和紫云英苷(31)的解析為例，了解黃酮O-單糖苷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。

化合物28：其精確相對(duì)分子質(zhì)量的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z463.121 9，準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子葡萄糖基得到m/z300.031 2槲皮素苷元碎片離子，連續(xù)脫去一分子CO、CO2、H2O得到m/z271.029 0、255.030 7、243.032 9的碎片離子，接著槲皮素苷元丟失B環(huán)產(chǎn)生m/z193.835 7，A環(huán)發(fā)生RDA重排產(chǎn)生m/z178.999 8碎片離子，接著斷裂一分子CO得到m/z151.003 3的碎片離子，經(jīng)參考文獻(xiàn)[38]推測(cè)為槲皮素-7-O-葡萄糖苷(C21H20O12)，其碎片離子的可能裂解途徑如圖7所示。

圖7 槲皮素-7-O-葡萄糖苷可能裂解途徑

化合物31：與對(duì)照品比對(duì)鑒定為紫云英苷(C21H20O11)，在負(fù)離子模式下形成準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z447.095 1，丟失一分子葡萄糖基，剩下黃酮-O-單糖苷類化合物典型的碎片離子m/z285.038 9，相繼脫去一分子OCH3、CO、CO2得到m/z255.030 6、227.035 0、211.045 2碎片離子峰，以及苷元離子m/z285.038 9發(fā)生RDA重排裂解得到m/z163.002 7和m/z151.003 3，其碎片離子的可能裂解途徑見(jiàn)圖8。

圖8 紫云英苷可能裂解途徑

2.2.2.2 黃酮O-雙糖苷類化合物分析

黃酮-O-雙糖苷類化合物易產(chǎn)生m/z255.027 7、179.001 6的特征碎片離子，以蕓香苷(26)和百蕊草素I(27)為例，了解黃酮O-雙糖苷類化合物裂解規(guī)律。

化合物26：與對(duì)照品比對(duì)鑒定為蕓香苷(C27H30O16)，其精確相對(duì)分子質(zhì)量的準(zhǔn)分子離子峰為[M-H]-m/z609.150 4，準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子鼠李糖基得到m/z463.652 6碎片離子，接著脫去一分子葡萄糖基形成m/z301.034 9的碎片離子，脫去一分子CO2得到m/z207.002 2，其碎片離子的可能裂解途徑如圖9所示。

圖9 蕓香苷可能裂解途徑

化合物27：與對(duì)照品比對(duì)鑒定為百蕊草素I(C27H30O15)，其精確相對(duì)分子質(zhì)量的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z593.153 0，準(zhǔn)分子離子峰脫去一分子葡萄糖基得到m/z430.092 8碎片離子，接著脫去一分子五碳糖基得到m/z285.038 5碎片離子，相繼脫去一分子CO、C7H8O得到m/z227.031 4、179.001 6的碎片離子，其碎片離子的可能裂解途徑如圖10所示。

圖10 百蕊草素I可能裂解途徑

2.2.3 二萜類

二萜類化合物是百蕊草提取物中另一類化合物，二萜類化合物是由4個(gè)異戊二烯單位構(gòu)成，裂解方式主要以糖苷鍵斷裂為主，共鑒定出的二萜類主要包括rebaudioside F、rebaudioside C、甜菊糖苷、甜茶苷等。以化合物39甜菊糖苷為例，在負(fù)離子模式下得到m/z803.370 7[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜分析，準(zhǔn)分子離子峰在高能碰撞下連續(xù)丟失2分子葡萄糖基(Glc，m/z162)產(chǎn)生m/z641.317 2碎片離子和m/z479.372 8碎片離子，根據(jù)其碎片及斷裂方式以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[26]，推測(cè)其結(jié)構(gòu)式為甜菊糖苷，其碎片離子的可能裂解途徑見(jiàn)圖11。

圖11 甜菊糖苷可能裂解途徑

2.2.4 其他類化合物

化合物1、3、7、8、9、12等分別被鑒定為D-甘露醇、丁二酸、3,4-二羥基苯乙醇葡萄糖苷、3,4,5-Trimethoxyphenyl-O-β-apiofuranosyl(1′′→6′)-β-glucopyranoside、丹皮酚新苷等，相關(guān)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1和表1。

3 討論與結(jié)論

本研究從百蕊草醇提物中共鑒定出54個(gè)化學(xué)成分，包括紫云英苷等16個(gè)黃酮類，白金雀兒堿等10個(gè)生物堿類，甜菊糖苷等5個(gè)二萜類，丁二酸等5個(gè)有機(jī)酸類和其他類化合物，其中槐果堿、氧化苦參堿等6個(gè)化合物經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，其余成分通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜碎片離子結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)鑒定，此研究結(jié)果為研究百蕊草藥理作用和活性成分作用評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)。

從百蕊草醇提物中發(fā)現(xiàn)，百蕊草醇提物中的有效成分尤以黃酮類和生物堿類成分為主，其中所鑒定的14個(gè)化合物歸屬于黃酮醇類如紫云英苷和蕓香苷等，具有許多重要的生物活性和藥理作用，如抗腫瘤、清除自由基、解毒抗炎、提高免疫力等生物活性[38]；5個(gè)生物堿類化合物歸屬于喹啉里西啶類生物堿如苦參堿和氧化苦參堿等，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗細(xì)菌和免疫抑制等多種生物活性[39]，這些成分之間相互配合、相互作用共同發(fā)揮百蕊草“清熱解毒、抗菌消炎”的功效，因而素有“植物抗生素”的美稱。此外通過(guò)對(duì)百蕊草醇提物生物堿類裂解規(guī)律解析，發(fā)現(xiàn)喹啉里西啶類生物堿化合物在正離子模式下有一個(gè)共同的m/z150.128 2的特征裂解碎片；黃酮類化合物在正離子模式中以[M+H]+和[M+Na]+峰形式存在，在負(fù)離子模式中易形成[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，脫去糖鏈形成苷元離子和脫去CO、H2O是黃酮類化合物裂解的質(zhì)譜特點(diǎn)，m/z163.002 7、151.032 0是黃酮醇類苷元裂解產(chǎn)生的特征碎片離子，二萜類化合物裂解多以連續(xù)脫去糖鏈為主。同時(shí)首次從百蕊草醇提物中鑒定出氧化苦參堿、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖-7-O-葡萄糖苷等25個(gè)化學(xué)成分，這些化學(xué)成分均為在百蕊草醇提物中尚未報(bào)道，但后續(xù)這些化合物仍需進(jìn)一步對(duì)其鑒定。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)百蕊草醇提物進(jìn)行分析，依據(jù)化合物分子式信息和二級(jí)碎片離子，結(jié)合對(duì)照品比對(duì)及參考文獻(xiàn)，系統(tǒng)地分析了百蕊草醇提物的化學(xué)成分，為后續(xù)探究百蕊草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制等提供參考。