IL-4和IL-17用于異基因造血干細(xì)胞移植后植入綜合征診斷及療效評價研究

向立麗，王 倩，蒙延娜，付春梅，段雅雅，馮 凱，李曉林

(徐州市中心醫(yī)院血液科，江蘇 徐州 221009)

植入綜合征(ES) 是造血干細(xì)胞移植(HSCT) 后中性粒細(xì)胞恢復(fù)早期的并發(fā)癥，是伴有免疫因素參與的一組臨床綜合征[1]。其臨床特征表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、非心源性肺水腫、毛細(xì)血管滲漏綜合征、肝腎功能損害、體重增加等[1-2]。隨著異基因 HSCT的廣泛實(shí)施，ES 發(fā)生率升高至20%～68%[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，有多種血清細(xì)胞因子參與ES發(fā)病過程，其中包括白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-6、IL-8、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，但這些因子在急性移植物抗宿主病(aGVHD)的發(fā)病機(jī)制中也起著重要的作用[5-7]，目前，尚缺乏確切的血漿生物學(xué)標(biāo)志物可用于ES的早期診斷和療效評估。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測HSCT患者的血漿中多種細(xì)胞因子的變化，分析出ES患者特征性改變的細(xì)胞因子IL-4、IL-17，為早期快速判斷ES提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2017—2020年本科住院行異基因HSCT患者38例為研究組，年齡大于18～<68歲，包括急性白血病(AL)20例，骨髓增生異常綜合征(MDS)7例，重型再生障礙性貧血(SAA)11例。同時選取健康者20例為對照組。

1.2方法

1.2.1預(yù)處理方案 研究組AL患者采用白消安(Bu)+環(huán)磷酰胺(Cy)+抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)或依托泊苷(VP-16)+Bu+Cy+ATG方案治療，MDS患者采用地西他濱+Bu+Cy+ATG方案治療，SAA患者采用氟達(dá)拉濱(Flu)+Cy+ATG方案治療。對發(fā)生ES的患者，停用細(xì)胞生長因子，給予糖皮質(zhì)激素治療[甲潑尼龍1～2 mg/(kg·d)，在癥狀好轉(zhuǎn)后迅速減量]，較重者輔以補(bǔ)充白蛋白、羥乙基淀粉擴(kuò)容及改善毛細(xì)血管通透性，并予利尿?qū)ΠY治療。所有患者于移植前(回輸干細(xì)胞前)、移植后10 d及發(fā)生ES時、發(fā)生aGVHD時采集外周血血漿標(biāo)本用于檢測。發(fā)生ES的患者于治療好轉(zhuǎn)后再次采集外周血樣本。收集對照組對象晨起空腹外周血血漿樣本。兩組標(biāo)本采集時均獲得患者知情同意。

1.2.2ES診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]滿足3條主要標(biāo)準(zhǔn)或2條主要標(biāo)準(zhǔn)加1條及以上次要標(biāo)準(zhǔn)確診ES。(1)主要標(biāo)準(zhǔn)：①體溫大于或等于38.5 ℃，無確定的感染灶；②彌漫性肺浸潤的非心源性肺水腫及缺氧癥狀；③非藥物性紅斑性皮疹，累及全身皮膚25%以上。(2)次要標(biāo)準(zhǔn)：①體重增加大于或等于基礎(chǔ)體重的2.5%；②腎功能不全，肌酐大于或等于2倍基值以上；③肝功能異常，總膽紅素大于或等于34 μmol/L或轉(zhuǎn)氨酶大于或等于2倍基值以上；④不能用其他原因解釋的一過性腦病。

1.2.3檢測方法 檢測前先將患者樣本進(jìn)行處理，按照ELISA試劑盒說明書完成工作液和標(biāo)準(zhǔn)液配置，向每個孔中加入 100 μL血漿樣本和50 μL工作抗體，隨后將平板密封并在搖床上室溫孵育1 h。孵育完成后用wash buffer洗滌每個孔3次，最后1次洗滌后將平板翻轉(zhuǎn)并在干凈的吸水紙上扣去多余的液體。然后在每個孔中加入100 μL TMB底物，放在搖床上避光孵育10 min后立即加入100 μL 終止液終止顯色反應(yīng)，在搖床上晃動工作板 1 min 混合均勻后，立即使用酶標(biāo)儀記錄 450 nm處的光密度(OD)值，用于后續(xù)計算。人IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和IFN-α ELISA 試劑盒均購自英國Abcam公司，酶標(biāo)儀型號為 SpectraMax Paradigm，購自美國 SpectraMax 公司。

2 結(jié) 果

2.1研究組患者HSCT后細(xì)胞因子水平變化 研究組38例患者HSCT后有9例發(fā)生ES，13例發(fā)生aGVHD，16例未發(fā)生ES及aGVHD。與aGVHD組、無ES及aGVHD組比較，發(fā)生ES組患者血漿IL-4、IL-17水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。其余細(xì)胞因子水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A.IL-4;B.IL-17;與無ES及aGVHD組、aGVHD組比較，aP<0.05。圖1研究組患者HSCT后血漿IL-4和IL-17水平變化

2.2研究組患者HSCT前與對照組血漿IL-4、IL-17水平比較 與對照組比較，研究組患者移植前血漿IL-4水平[(5.19±0.62)pg/mLvs.(4.78±0.92)pg/mL]和IL-17水平[(11.37±1.24)pg/mLvs.(10.43±1.06)pg/mL]無明顯升高，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3ES患者HSCT前后IL-4、IL-17水平變化 HSCT后，ES患者IL-4、IL-17水平較HSCT前顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012、0.009)。經(jīng)過治療好轉(zhuǎn)后，ES患者IL-4、IL-17水平較發(fā)生ES時下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023、0.003)，與移植前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.168、0.483)，見表1。

表1 ES患者HSCT前后及治療后IL-4、IL-17水平變化

2.4ES患者與無ES患者HSCT后10 d血漿IL-4、IL-17水平比較 9例患者發(fā)生ES(ES發(fā)生時間為12～20 d，持續(xù)時間為3～10 d)，16例患者未發(fā)生ES。與無ES組比較，ES組患者HSCT后10 d血漿IL-4、IL-17水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016、0.005)，見表2。

表2 ES患者與無ES患者HSCT后10 d血漿IL-4、IL-17水平比較

2.5血漿IL-4、IL-17診斷ES的ROC曲線 通過比較未發(fā)生ES組與發(fā)生ES組HSCT后10 d的數(shù)據(jù)繪制ROC曲線，以ROC曲線及其曲線下面積作為某一診斷方法準(zhǔn)確性評價的指標(biāo)，ROC曲線下面積越大，診斷價值越高。IL-4診斷ES曲線下面積為(0.947±0.024)[95%置信區(qū)間(95%CI) 0.900～0.994，P<0.05]，特異度和敏感度分別為0.93%、0.72%，截點(diǎn)概率為1.750。IL-17診斷ES曲線下面積為(0.853±0.056)(95%CI0.799～0.912，P<0.05)，特異度和敏感度分別為0.83%、0.75%，截點(diǎn)概率為0.580。IL-4+IL-17診斷ES曲線下面積為(0.896±0.031)(95%CI0.875～0.929，P<0.05)，特異度和敏感度分別為0.90%、0.73%，截點(diǎn)概率為1.240。說明血漿IL-4和IL-17評估ES的診斷價值均高，而IL-4的診斷價值最高。見圖2。

圖2 血漿IL-4、IL-17診斷ES的ROC曲線

3 討 論

ES多發(fā)生在HSCT后4～22 d，白細(xì)胞升高5 d內(nèi)[8-9]，伴隨中性粒細(xì)胞恢復(fù)。目前獨(dú)立于 GVHD發(fā)生的 ES 越來越常見[10]。在異基因HSCT中，ES與aGVHD臨床表現(xiàn)相似，沒有本質(zhì)區(qū)別，目前主要從發(fā)生時間、臨床特征、皮膚活檢和細(xì)胞因子幾方面進(jìn)行鑒別[11]。LAWRENCE 等[12]報道HSCT后發(fā)生ES提示預(yù)后差。因此，早期快速識別ES并及時干預(yù)治療有助于改善患者預(yù)后。血漿細(xì)胞因子水平檢測方便快捷、耗時短，并且能隨時動態(tài)監(jiān)測其變化，可鑒別診斷ES和aGVHD，對ES早期診斷及療效評估具有臨床應(yīng)用價值，而目前與ES相關(guān)的特異性細(xì)胞因子尚缺乏報道。SHAN等[13]研究了兒童干細(xì)胞移植后ES中降鈣素原(PCT)和細(xì)胞因子變化，結(jié)果顯示PCT升高可作為ES的生物標(biāo)志物。KHANDELWAL等[14]對兒童HSCT受者發(fā)生ES時細(xì)胞因子譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)aGVHD患者相比，單獨(dú)ES患者的血漿IL-1β、IL-6、IL-12、IL-4和IL-13水平顯著升高。本研究首先對38例接受異基因HSCT患者進(jìn)行了包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和IFN-α 在內(nèi)的12種細(xì)胞因子檢測，結(jié)果顯示9例發(fā)生ES患者的血漿IL-4和IL-17水平較發(fā)生aGVHD、未發(fā)生ES及aGVHD患者顯著升高，與無ES組患者比較，ES發(fā)生前即出現(xiàn)血漿IL-4和IL-17的水平升高，表明血漿IL-4和IL-17水平可作為ES的預(yù)測和診斷標(biāo)志物。同時作者對IL-4和IL-17在ES患者中的診斷價值進(jìn)行了評估。本研究中9例發(fā)生ES的患者臨床癥狀多出現(xiàn)在HSCT后12～20 d，而HSCT后10 d，ES組和無ES組血漿IL-4、IL-17水平均具有顯著差異。對血漿中IL-4、IL-17的水平進(jìn)行ROC曲線分析，IL-4診斷ES曲線下面積為(0.947±0.024)，特異度為0.93%，敏感度為0.72%；IL-17診斷ES曲線下面積為(0.853±0.056)，特異度為0.83%，敏感度為0.75%；IL-4+IL-17診斷ES曲線下面積為(0.896±0.031)，特異度為0.90%，敏感度為0.73%。說明IL-4和IL-17可以作為ES的診斷性指標(biāo)，而IL-4診斷價值最高，但是IL-4+IL-17聯(lián)合診斷價值沒有單項(xiàng)IL-4指標(biāo)有優(yōu)勢，考慮可能與IL-17的診斷價值偏低有關(guān)。

綜上所述，血漿IL-4、IL-17水平對評估ES具有較高的預(yù)測和早期診斷價值，為及時干預(yù)治療并改善患者預(yù)后提供依據(jù)。本研究病例數(shù)較少，但仍具有參考意義，可在臨床廣泛開展應(yīng)用。