陳皮藥材HPLC特征圖譜的建立

劉根才 華 杰

浙江維康藥業(yè)股份有限公司，浙江 麗水 323000

陳皮為蕓香科植物橘Citri Reticulatae Pericarpium及其栽培變種的干燥成熟果皮，采摘成熟果實(shí)，剝?nèi)」?，曬干或低溫干燥。陳皮具有理氣健脾，燥濕化痰的功效，用于脘腹脹滿，食少吐瀉，咳嗽痰多[1]。2020年版《中國(guó)藥典》陳皮藥材標(biāo)準(zhǔn)中控制的質(zhì)量屬性有性狀、鑒別、檢查、含量測(cè)定等，未對(duì)初步確定的關(guān)鍵質(zhì)量屬性水溶性浸出物及主要化學(xué)成分(指紋圖譜)進(jìn)行控制。

中藥指紋圖譜是目前中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制主要手段之一，可更全面的反映中藥產(chǎn)品整體特征[2]。指紋圖譜研究常用高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法等[3]，陳皮主要化學(xué)成分為主要有黃酮類化合物、揮發(fā)油類、檸檬苦素類、生物堿類和微量元素等[4- 6]。其中黃酮類橙皮苷是陳皮中最主要活性成分之一，具有維持血壓正常滲透壓、降低血管脆性、降低人體膽固醇含量、抗過(guò)敏、降血壓、抑制癌變和抗病毒，抑菌，消炎，保肝等的作用[7-14]，其檢測(cè)方法主要為高效液相色譜法，檢測(cè)器為因紫外檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器具有靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、有較好的選擇性，應(yīng)用范圍廣，因此選擇高效液相色譜法紫外檢測(cè)器作為陳皮指紋圖譜方法開(kāi)發(fā)的檢測(cè)器。

陳皮藥材可增加指紋圖譜方法進(jìn)行專屬性鑒別，本試驗(yàn)收集了不同產(chǎn)地的陳皮藥材，采用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行專屬性鑒別，建立了陳皮藥材HPLC指紋圖譜，為更好地控制陳皮藥材質(zhì)量提供了可靠的方法依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：110721-201818，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；川陳皮素對(duì)照品(批號(hào)：PS020082，成都普思生物科技股份有限公司)；桔皮素對(duì)照品(批號(hào)：PS010637，成都普思生物科技股份有限公司)；陳皮藥材(CP21060801，廣東省新會(huì)區(qū)；CP21060802，浙江省衢州區(qū)；CP21060803，四川省青白江區(qū)；CP21061101，浙江省開(kāi)化縣；CP21061102，四川省金堂縣；CP21061103，河南省淅川縣；CP21061501，廣東省新會(huì)區(qū)；CP21061502，廣東省新會(huì)區(qū)；CP21061503，湖南省漢壽縣；CP21061504，湖南省漢壽縣；CP21061505，四川省高縣；CP21061506，四川省三臺(tái)縣；CP21061507，湖南省瀘溪縣；CP21062201，湖南省石門(mén)縣；CP21062202，湖南省中方縣；CP21062203，湖南省沅江市；CP21062204，浙江省衢州區(qū))，均購(gòu)自浙江惠松制藥有限公司。乙腈[色譜純，批號(hào)：193478，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]、甲酸(分析純，批號(hào)：1801089)、甲醇(分析純，批號(hào)：20190912)、乙醇(分析純，批號(hào)：20191011)，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，Kromasil 100-5-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，Kromasil)，BK-900B超聲儀(濟(jì)南巴克超聲波儀器有限公司)，MS205DU十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多)，F(xiàn)A2004萬(wàn)分之一電子天平(上海舜宇恒平儀器有限公司)，LD610-2百分之一電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子科技有限公司)，藥典檢驗(yàn)篩(浙江上虞市華豐五金儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 陳皮粉末的制備 取陳皮藥材適量粉碎，過(guò)二號(hào)篩(24目)，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取橙皮苷、川陳皮素、桔皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為0.4 mg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粗粉(過(guò)二號(hào)篩)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量；超聲處理30 min(功率900 W，頻率60 kHz)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Kromasil 100-5-C18型色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為30 ℃；流速為 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。見(jiàn)表1。

表1 陳皮藥材HPLC特征圖譜梯度洗脫表

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 取空白(甲醇)、橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、陳皮藥材CP21061504，按“2.2”“2.3”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)分析。結(jié)果如圖1所示。

從下至上依次為：空白(甲醇)、橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、陳皮CP21061504供試品圖1 專屬性試驗(yàn)對(duì)比圖

結(jié)果表明，空白溶劑未在供試品色譜相應(yīng)位置出峰，供試品色譜中含有與橙皮苷、桔皮素、川陳皮素對(duì)照品保留時(shí)間且紫外吸收光譜一致的峰(詳見(jiàn)表2)，說(shuō)明該方法專屬性良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取陳皮藥材CP21061504，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5針，每次進(jìn)樣10 μL，將得到5針AIA數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》計(jì)算軟件進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為：以供試品1-1(S1)色譜圖為參照?qǐng)D譜，生成方法中位數(shù)，時(shí)間窗0.3；多點(diǎn)校正；全峰匹配，計(jì)算相似度結(jié)果，并對(duì)指紋圖譜中8個(gè)明顯特征峰進(jìn)行標(biāo)記，計(jì)算7個(gè)標(biāo)記峰與標(biāo)記S峰(橙皮苷)的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，如圖2所示。結(jié)果表明，連續(xù)進(jìn)樣的5針供試品溶液指紋圖譜相似度均大于0.99，各供試品溶液與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，7個(gè)明顯特征峰的峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積小于5.0%，說(shuō)明該儀器精密度良好。

表2 對(duì)照品與陳皮藥材供試品紫外圖譜吸收

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取陳皮藥材CP21061504，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣10 μL，將得到的AIA數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》計(jì)算軟件進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為：以供試品1(S1)色譜圖為參照?qǐng)D譜，生成方法中位數(shù)，時(shí)間窗0.3；多點(diǎn)校正；全峰匹配，計(jì)算相似度結(jié)果，計(jì)算7個(gè)標(biāo)記峰與標(biāo)記S峰(橙皮苷)的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，如圖3所示。結(jié)果表明，6個(gè)供試品呈現(xiàn)出的色譜相似度均大于0.99，各供試品溶液與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，特征峰(同精密度項(xiàng)下)相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

注：從下至上依次為：供試1-1、供試1-2、供試1-3、供試1-4、供試1-5。圖2 儀器精密度試驗(yàn)圖

注：從下至上依次為：供試品1、供試品2、供試品3、供試品4、供試品5、供試品6。圖3 重復(fù)性試驗(yàn)圖

2.5.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取陳皮藥材CP21061504，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0 h、6 h、12 h、18 h、24 h按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣10μL進(jìn)樣檢測(cè)，將得到的AIA數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》計(jì)算軟件進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為以0 h(S1)色譜圖為參照?qǐng)D譜，生成方法中位數(shù)，時(shí)間窗0.3；多點(diǎn)校正；全峰匹配，計(jì)算相似度結(jié)果，計(jì)算7個(gè)標(biāo)記峰與標(biāo)記S峰(橙皮苷)的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，如圖4所示。結(jié)果表明，不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的色譜相似度均大于0.99，各時(shí)間點(diǎn)供試品溶液與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99，特征峰(同精密度項(xiàng)下)相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD均小于7.0%，該供試品溶液在常溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 中間精密度考察 按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取陳皮藥材CP21061504供試品溶液考察隨機(jī)變動(dòng)因素不同日期、不同分析人員、不同儀器對(duì)重復(fù)性的影響，記錄色譜圖。將得到的AIA數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》計(jì)算軟件進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為：以實(shí)驗(yàn)員A供試1(S1)色譜圖為參照?qǐng)D譜，生成方法中位數(shù)，時(shí)間窗0.3；多點(diǎn)校正8個(gè)峰；全峰匹配，計(jì)算7個(gè)標(biāo)記峰與標(biāo)記S峰(橙皮苷)的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，如圖5所示。結(jié)果表明，12個(gè)指紋圖譜之間的相似度均在0.96以上，與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度均在0.99以上，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3.0%，個(gè)別色譜峰相對(duì)峰面積RSD較大，但是不影響整體識(shí)別。說(shuō)明該方法中間精密度良好。

注：從下至上依次為0 h、6 h、12 h、18 h、24 h圖4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)圖

注：S1-S12依次為實(shí)驗(yàn)員A重復(fù)性1-6、實(shí)驗(yàn)員B重復(fù)性1-6圖5 中間精密度試驗(yàn)考察對(duì)比圖

2.6 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的確定 按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，對(duì)17批陳皮藥材供試品溶液進(jìn)行指紋圖譜檢測(cè)，將17批陳皮藥材指紋圖譜與陳皮藥材對(duì)照指紋圖譜AIA數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》計(jì)算軟件進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為：以S1(藥材對(duì)照指紋圖譜)為參照?qǐng)D譜，生成方法中位數(shù)，時(shí)間窗0.3；多點(diǎn)校正8個(gè)峰；全峰匹配，計(jì)算陳皮藥材與藥材對(duì)照指紋圖譜的相似度，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，17批陳皮藥材與陳皮藥材對(duì)照特征圖譜的相似度均在0.90以上，表明陳皮藥材、陳皮藥材特征圖譜具有相關(guān)性。

計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，17批陳皮藥材特征峰相對(duì)保留時(shí)間分別為：峰1在0.476～0.483范圍內(nèi)，峰2在0.895～0.897范圍內(nèi)，峰4在1.387～1.396范圍內(nèi)，峰5在1.871～1.887范圍內(nèi)，峰6在2.013～2.031范圍內(nèi)，峰7在2.176～2.196范圍內(nèi)，峰8在2.307～2.328范圍內(nèi)，均符合陳皮藥材特征圖譜標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。故最終建立陳皮藥材特征圖譜標(biāo)準(zhǔn)同藥材，即供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)8個(gè)特征峰，與參照物(橙皮苷)峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，應(yīng)在規(guī)定值的加減10%范圍內(nèi)。相對(duì)保留時(shí)間規(guī)定值為0.486(峰1)、0.898(峰2)、1.380(峰4)、1.874(峰5)、1.996(峰6)、2.153(峰7)、2.287(峰8)。

注：從下至上依次為陳皮藥材對(duì)照、CP21060801、CP21060802、CP21060803、CP21061101、CP21061102、CP21061103、CP21061501、CP21061502、CP21061503、CP21061504、CP21061505、CP21061506、CP21061507、CP21062201、CP21062202、CP21062203、CP21062204圖6 17批陳皮藥材特征圖譜

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 以色譜峰個(gè)數(shù)、整體分布、制備難易等為指標(biāo)，采用單因素考察方法，對(duì)供試品溶液提取方法、提取時(shí)間、提取溶媒等進(jìn)行了研究。對(duì)比了加熱回流30 min、超聲處理(功率900 W，頻率60 kHz)30 min兩種提取方式獲得的供試品溶液指紋圖譜情況，結(jié)果表明回流和超聲兩種提取方式所呈現(xiàn)的色譜圖基本一致，考慮到超聲相對(duì)較為簡(jiǎn)便，選擇超聲提取。先對(duì)比甲醇、乙醇、水所提取得色譜峰差異進(jìn)行判斷，再根據(jù)結(jié)果考察不同濃度的溶劑對(duì)呈批指紋圖譜的影響，結(jié)果表明甲醇作為提取溶媒時(shí)色譜峰個(gè)數(shù)明顯多于乙醇和水，隨著提取溶媒中甲醇占比越高，所提取的色譜峰越多，各峰分離度均良好，故選擇甲醇作為樣品前處理提取溶劑。對(duì)比了不同提取時(shí)間(超聲處理15 min、30 min、45 min、60 min)制備的陳皮供試品溶液指紋圖譜差異，不同提取時(shí)間制得的供試品溶液得到的色譜圖基本一致，選擇提取時(shí)間較為適中的30 min。最終確定陳皮指紋圖譜檢測(cè)用供試品溶液制備方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)確定 結(jié)合確定的方法所測(cè)陳皮指紋圖譜的3D圖(時(shí)間-波長(zhǎng)-響應(yīng)值)分析可知，250～350 nm波長(zhǎng)呈現(xiàn)的色譜峰相對(duì)較多，其中部分色譜峰在各波長(zhǎng)下均展示有較強(qiáng)的吸收，分析陳皮中該三種成品含量較高。對(duì)比250～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)指紋圖譜可知，色譜峰283 nm波長(zhǎng)下呈現(xiàn)的色譜峰個(gè)數(shù)較多，比例分布相對(duì)其他更為均勻，且參照峰橙皮苷具有較高的響應(yīng)值，整體譜圖呈現(xiàn)良好，故選擇283 nm為陳皮指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的考察研究 本試驗(yàn)分別考察“乙腈-0.1%甲酸溶液”“乙腈-水”“乙腈-0.1%醋酸溶液”“乙腈-0.1%磷酸溶液”流動(dòng)相體系中對(duì)陳皮指紋圖譜的影響。結(jié)果顯示，不同流動(dòng)性體系對(duì)色譜峰洗脫影響不一致，其中“乙腈-0.1%甲酸溶液”色譜峰明顯多于其他三種流動(dòng)相體系，故選擇“乙腈-0.1%甲酸溶液”為陳皮指紋圖譜流動(dòng)相體系。

3.4 特征峰的確認(rèn) 17批陳皮藥材中共有峰31個(gè)，統(tǒng)計(jì)對(duì)照指紋圖譜中各共有峰中峰面積占共有峰總峰面積百分比可知，除橙皮苷、川陳皮素、橘皮素色譜峰外，其他占總峰面積比值均低于2%，考慮到批次間質(zhì)量化學(xué)成分含量存在差異，峰面積較小、分離度較差的共有峰受檢測(cè)條件等影響較大，不適宜作為特征峰用于藥材的質(zhì)量控制，故選擇占總峰面相對(duì)較大(占總峰面積0.5%)、響應(yīng)值較高、分離度較好的共有峰作為特征峰，經(jīng)評(píng)估，陳皮藥材對(duì)照指紋圖譜中不低于總峰面積0.5%色譜峰有10個(gè)，但其中有兩個(gè)峰分離度較差，在不同批次間呈現(xiàn)較弱，不適宜作為特征峰，故選擇占總峰面較大、響應(yīng)值較高、分離度較好的共有峰作為其特征峰，故本研究建立了以8個(gè)特征峰為指標(biāo)成分的陳皮HPLC指紋圖譜，對(duì)其中3個(gè)峰進(jìn)行了峰歸屬，確定為橙皮苷、川陳皮素、桔皮素，其余5個(gè)色譜峰還需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

綜上，以Kromasil 100-5-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈—0.1%甲酸水溶液(梯度洗脫)為流動(dòng)相；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm，采用HPLC法測(cè)定，該方法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，可用于陳皮藥材的質(zhì)量控制。