侗藥馬卡列丙提取物對成骨細胞增殖、分化、礦化的影響

1.湖南醫(yī)藥學院侗醫(yī)藥研究湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418000；2.湖南醫(yī)藥學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，湖南 懷化 418000；3.湖南醫(yī)藥學院藥學院，湖南 懷化 418000

馬卡列丙又稱毛秀才，為菊科植物顯脈旋覆花屬顯脈旋覆花Duhaldeanervosa(Wallich ex Candolle)A.Anderberg的全草，具有通經(jīng)活絡(luò)止痛、祛風除濕、活血化瘀、消腫散血等作用，主要用于跌打損傷、骨折的治療，可顯著縮短骨折愈合的病程，是侗族從古至今常用的跌打損傷特效良藥[1-4]。迄今為止，從馬卡列丙藥材提取分離的化合物已報道有60多個，主要有揮發(fā)油類、甾體、萜類、黃酮等成分[5-8]。但是馬卡列丙促進骨折愈合相關(guān)的藥理活性研究未見報道，主要有抗炎、抗氧化等作用[9-11]。小鼠成骨細胞MC3T3-E1是研究骨形成的重要細胞模型，骨折愈合和骨質(zhì)疏松癥相關(guān)藥物研究多采用該細胞進行藥效評價[12-13]。實驗將馬卡列丙的根莖粉碎后用不同的溶劑和方法得到8種提取物，利用小鼠成骨細胞對該提取物進行活性篩選，確定有活性的部位。實驗結(jié)果有助于侗藥馬卡列丙的進一步研究和開發(fā)，為其治療跌打損傷和促進骨折愈合的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供藥理實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材及其制備 馬卡列丙藥材購自于云南，經(jīng)湖南醫(yī)藥學院汪冶教授鑒定為菊科顯脈旋覆花Duhaldeanervosa(Wallich ex Candolle)A.Anderberg的根和根莖，其提取物制備方法如下所示。

1.1.1 揮發(fā)油和剩余水提物 藥材粉碎，過3號篩，稱取200 g，加入6倍量的純化水，采用2015版《中國藥典》2204揮發(fā)油測定法，蒸餾提取6 h，蒸餾液經(jīng)油水分離器分離出油層，加10%的無水硫酸鈉脫水，濾過，即得揮發(fā)油(I)，得率為0.23%，將上述提取液過濾，續(xù)濾液備用，殘渣，繼續(xù)加6倍量的純化水，加熱回流提取2 h，過濾，合并續(xù)濾液，減壓回收至干，即得剩余水提物(Ⅱ)，得率為37.96%。

1.1.2 石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位 藥材粉碎，過3號篩，稱取200 g，加熱回流提取3次，每次均加入6倍量的95%乙醇溶液，回流提取1 h，合并續(xù)濾液，減壓回收至干，即得醇提物(Ⅲ)，得率為5.41%，取部分醇提物，加適量水溶解，分別依次用2/3倍體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，減壓回收石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和剩余水液，即得石油醚部位(Ⅳ)、乙酸乙酯部位(Ⅴ)、正丁醇部位(Ⅵ)、水部位(Ⅶ)，得率分別為0.34%、0.56%、1.24%和2.89%。

1.1.3 粗多糖 藥材粉碎，過3號篩，稱取50 g，加熱回流提取3次，每次均加入10倍量的純化水，回流提取1 h，合并續(xù)濾液，減壓回收至50 mL，即得水提液濃溶液。以1 mL/min的速度，加入無水乙醇，邊加邊攪拌，使其最終醇濃度為80%，靜置，過濾，取沉淀，干燥即得粗多糖(Ⅷ)，得率為5.2%。

1.1.4 藥物配制 分別稱取適量提取物用二甲基亞砜進行溶解配置成200 mg/mL的母液，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 α-MEM培養(yǎng)液、胰酶、青霉素/鏈霉素(Hyclone公司)；胎牛血清(四季青公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、 β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松(Dexamethasone，DEX)，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)購自sigma公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。

1.3 細胞株和細胞培養(yǎng) 小鼠成骨細胞MC3T3-E1購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫?；A(chǔ)培養(yǎng)液為α-MEM，添加10%的胎牛血清和1%的青霉素與鏈霉素做為生長培養(yǎng)液。誘導分化培養(yǎng)液在生長培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加10 mM β-甘油磷酸鈉和50 μg/mL的維生素C。MC3T3-E1用生長培養(yǎng)液進行傳代，3～4 d傳代一次，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 儀器 倒置相差顯微鏡(Motic AE2000)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo scientific)；多功能酶標儀(Biotek)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.5 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)期的MC3T3-E1細胞用胰酶消化后制備成單細胞懸液，計數(shù)后按5×103個細胞每孔接種于96孔板，培養(yǎng)過夜待細胞貼壁生長狀態(tài)良好進行藥物處理，藥物處理時間分別為24 h、48 h和72 h，處理完后每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去掉上清液，每孔加入100 μL DMSO溶解形成紫色甲瓚，充分振蕩混勻后用酶標儀檢測490 nm的吸光值。

1.6 堿性磷酸酶活性測定 取對數(shù)期的MC3T3-E1細胞用胰酶消化后制備成單細胞懸液，計數(shù)后按1×105個細胞每孔接種于12孔板，第2天用誘導分化培養(yǎng)液進行藥物處理，藥物處理每3天更換1次，第6天進行堿性磷酸酶活性測定。藥物處理完后，將培養(yǎng)板放在冰上，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗2次，再每孔加80 μL的RIPA裂解液在冰上裂解30 min。用移液槍將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，12000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清液按操作說明進行堿性磷酸酶活性測定，用酶標儀檢測405 nm的吸光值，根據(jù)標準曲線和測定值計算出樣品中的堿性磷酸酶的單位酶活。

1.7 馬卡列丙提取物促進成骨細胞礦化程度評估 細胞懸液計數(shù)后，按5×104/孔接種于24孔板，第二天用誘導分化培養(yǎng)液進行藥物處理，每3天更換新的藥物處理1次，培養(yǎng)14天后進行茜素紅染色。去掉培養(yǎng)液后用PBS洗2次，用95%乙醇固定15 min， PBS洗2次，0.1%茜素紅37 ℃恒溫染色30 min，PBS洗1次，吹干，相差顯微鏡進行拍照。采用10%的氯化十六烷吡啶對礦化結(jié)節(jié)進行溶解，用酶標儀測540 nm吸光值來評估細胞的礦化水平，進行量化評估。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用Graphpad prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析，所有實驗數(shù)據(jù)采用平均值加減標準誤(S.E.M)表示。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05 為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 馬卡列丙提取物對成骨細胞增殖的影響 用馬卡列丙提取物分別對小鼠成骨細胞進行處理，終濃度分別為50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL，處理的時間為24 h、48 h和72 h，其中24 h促進細胞增殖的作用最顯著(圖1)。48 h和72 h藥物促進細胞增殖作用不明顯，因為貼壁細胞會有接觸性抑制作用，24 h內(nèi)是細胞生長旺盛期，增殖作用比較顯著。與溶劑對照組DMSO相比，正丁醇部位(Ⅵ)在50～800 μg/mL藥物濃度作用下都有促進增殖作用。醇提物(Ⅲ)和乙酸乙酯部位(V)在100～800 μg/mL作用下有促進增殖作用。水部位(Ⅶ)在50～100 μg/mL具有促進增殖的趨勢，隨著濃度增高對細胞活力沒有抑制作用。剩余水提物(Ⅱ)沒有表現(xiàn)促進增殖的作用，但是對細胞活力在50～800 μg/mL都沒有影響。揮發(fā)油(I)在100 μg/mL對細胞增殖有促進的趨勢，隨著濃度增高對細胞活力具有抑制作，400～800 μg/mL 有顯著性差異。石油醚(Ⅳ)從50 μg/mL開始對細胞活力有一定抑制作用，800 μg/mL有顯著性差異。從藥物對細胞活力的影響進行綜合評價，醇提物(Ⅲ)和乙酸乙酯部位(Ⅴ)、正丁醇部位(Ⅵ)的增殖活性作用比較好(圖1 F)。

注：與溶劑對照相比，*P<0.05，***P<0.001圖1 不同濃度馬卡列丙提取物處理MC3T3-E1細胞24 h對細胞活力的影響

2.2 馬卡列丙提取物對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響 用分化培養(yǎng)液對成骨細胞MC3T3-E1進行藥物處理，分化過程中細胞的形態(tài)會發(fā)生變化，細胞由扁平變成梭形。堿性磷酸酶是成骨細胞進行分化程度的指標，在早期骨形成中有重要作用。經(jīng)過前期預實驗發(fā)現(xiàn)分化6 d的堿性磷酸酶水平比較高，故分別用不同的提取物進行誘導分化篩選堿性磷酸酶活性比較高的提取物成分，主要篩選25 μg/mL 和50 μg/mL兩個藥物濃度。與溶劑對照組DMSO相比,25 μg/mL時大部分提取物沒有誘導堿性磷酸酶的上升，只有剩余水提物(Ⅱ)的ALP水平上升并有顯著性差異(P<0.001)。在50 μg/mL藥物誘導時，乙酸乙酯部位(Ⅴ)和粗多糖(Ⅷ)具有較好的堿性磷酸酶活性，剩余水提物(Ⅱ)、醇提物(Ⅲ)、石油醚部位(Ⅳ)、正丁醇部位(Ⅵ)和水部位(Ⅶ)的堿性磷酸酶活性與陽性對照地塞米松(DEX)的作用相似，有上升的趨勢。如圖2所示。

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2 馬卡列丙提取物誘導MC3T3-E1細胞的堿性磷酸酶活性

2.3 馬卡列丙提取物對成骨細胞礦化鈣鹽沉積的影響 用分化培養(yǎng)液加不同的提取物進行誘導，每3天重新更換藥物進行處理，誘導分化10 d左右開始形成礦化結(jié)節(jié)，細胞成鋪路石樣的形態(tài)，并且有黑色的顆粒物在細胞表面形成。誘導至第14天，礦化結(jié)節(jié)比較明顯，進行茜素紅染色呈橘紅色顆粒，橘紅色的顆粒物的多少體現(xiàn)礦化程度。在低濃度25 μg/mL進行誘導礦化效果比較好，陽性對照地塞米松(DEX)、乙酸乙酯部位(Ⅴ)、正丁醇部位(Ⅵ)和水部位(Ⅶ) 礦化結(jié)節(jié)比較明顯(圖3A)。對礦化結(jié)果進行量化評價，陽性對照DEX和乙酸乙酯部位(Ⅴ)具有顯著性差異，此外醇提物(Ⅲ)、正丁醇部位(Ⅵ)、水部位(Ⅶ)和粗多糖(Ⅷ)鈣鹽沉積有增多的趨勢(圖3B)。

注：與陽性對照組比較，*P<0.05。圖3 馬卡列丙提取物低濃度誘導MC3T3-E1細胞礦化效果

高濃度50 μg/mL進行誘導礦化的時候，在25 μg/mL有礦化效果的提取物的作用大部分下降了。剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)表現(xiàn)出較強的礦化效果，有明顯的礦化結(jié)節(jié)，在量化評價的時候有顯著性差異(圖4)。

注：A.礦化的形態(tài)圖；B.礦化的量化圖；*P<0.05，**P<0.01。圖4 馬卡列丙提取物高濃度誘導MC3T3-E1細胞礦化效果

2.4 馬卡列丙提取物促進成骨細胞骨形成過程的活性篩選結(jié)果 馬卡列丙提取物乙酸乙酯部位(Ⅴ)對成骨細胞增殖、分化、礦化都有促進作用，醇提物(Ⅲ)和正丁醇部位(Ⅵ)促進增殖比較明顯，但是分化和鈣化活性不明顯。剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)雖然不能促進成骨細胞增殖，但是具有明顯的分化和礦化活性。此外，水部位(Ⅶ)有分化和礦化的趨勢，石油醚部位(Ⅳ)在低濃度有微弱的鈣化趨勢(表1)。

表1 馬卡列丙提取物活性篩選比較匯總

3 討論

實驗主要評價了馬卡列丙提取物對小鼠成骨細胞增殖、分化、礦化的影響。結(jié)果表明馬卡列丙提取物有些部分含有促進成骨細胞增殖、分化和礦化的有效成分，其中乙酸乙酯部位(Ⅴ)效果最為明顯，在增殖、分化和礦化過程中都明顯高于陰性對照，與陽性對照組DEX相似。此外，剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)在分化和礦化作用評價時具有比較好的活性，但增殖活性較弱。促進增殖時有較好活性的醇提取物(Ⅲ)和正丁醇(Ⅵ)在分化和礦化的活性篩選較弱。實驗結(jié)果表明雖然有些提取物成分沒有對成骨細胞的增殖、分化和礦化都具有活性，但是在成骨細胞骨形成過程的其中1～2個階段發(fā)揮作用。中藥在促進骨折愈合的作用是多方面的，侗藥馬卡列丙有多個組分對跌打損傷和促進骨折愈合產(chǎn)生作用。綜上所述，侗藥馬卡列丙對跌打損傷和促進骨折愈合具有促進作用的有效成分主要集中在乙酸乙酯(Ⅴ)部位，但是正丁醇(Ⅵ)、剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)等提取物中也含有一些可以促進骨形成的化合物。要明確其促進成骨細胞增殖、分化和礦化的化合物成分，還需要進一步分離純化和藥物活性篩選。

實驗發(fā)現(xiàn)侗藥馬卡列丙提取物乙酸乙酯部位(Ⅴ)對體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖、分化和礦化具有一定的促進作用，為該藥用于治療骨折及骨質(zhì)疏松癥提供了初步的藥效學研究基礎(chǔ)。為馬卡列丙藥材的進一步提取分離和開發(fā)提供了一定的實驗依據(jù)。但是提取物成分復雜，不能完全排除非特異性物質(zhì)對活性的干擾，因此進一步實驗將利用大鼠脛骨骨折動物模型進行整體動物實驗，檢測骨折愈合過程中馬卡列丙提取物乙酸乙酯部位(Ⅴ)促進骨折愈合的體內(nèi)作用；并對乙酸乙酯部位的化學成分進行提取分離和鑒定，明確促進骨形成的化學成分。