不同細胞來源外泌體調(diào)節(jié)心肌梗死后血管新生及其機制的研究進展

洪藝勤，唐炳華，于黎爽，李 寧，郭冬青

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是一種冠狀動脈疾病，主要是由于冠狀動脈粥樣硬化血栓的形成，使流向心肌的血液突然完全或部分停止，造成心肌氧失衡，從而導(dǎo)致心肌細胞死亡、心臟重構(gòu)和繼發(fā)性心力衰竭[1]。近年來，藥理和醫(yī)療技術(shù)的進步明顯降低了心肌梗死的死亡率，但心肌梗死仍然是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因。一份關(guān)于疾病和傷害發(fā)生率的全球報告顯示，僅2017年就發(fā)生了大約3 790萬例由缺血性心臟病引起的心肌梗死[2]。

心肌梗死后，部分心肌細胞死亡，機體自身會通過心肌肥大和形態(tài)重塑等方式試圖恢復(fù)心排血量，但最終仍很可能會引發(fā)心力衰竭。當(dāng)前的治療手段主要有藥物治療、介入治療和冠狀動脈旁路移植，晚期只能通過心臟移植，但是以上方法存在各種弊端。例如：傳統(tǒng)藥物治療不能解決心肌細胞和血管系統(tǒng)的潛在損失，本質(zhì)上是非治愈性的[3]；直接經(jīng)皮冠狀動脈介入治療尚未被證明能提高存活率，可能還會增加心肌梗死的短期風(fēng)險，但并不降低心肌梗死的長期風(fēng)險[4-5]；心臟移植費用高昂，且心臟供不應(yīng)求，排斥反應(yīng)及其并發(fā)癥仍是心臟移植到目前為止所無法克服的難題。目前，治療性血管新生被認為是治療心肌梗死最根本的方法，通過增加缺血心肌的血流灌注，最終達到治療的目的。血管新生指在現(xiàn)有的血管基礎(chǔ)上形成和發(fā)展新血管的過程，是心臟損傷后修復(fù)的重要過程，是挽救缺血環(huán)境、培養(yǎng)新生細胞的重要途徑，是缺血性心肌損傷后細胞治療導(dǎo)致左室功能改善的主要機制[6]，其主要通過激發(fā)機體內(nèi)的細胞促進心肌梗死后梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)生成血管實現(xiàn)，血管新生包括血管生成(angiogenesis)、動脈生成(arteriogenesis)和血管發(fā)生(vasculogenesis)[7]。狹義的血管新生指血管生成，包括血管內(nèi)皮細胞的激活、增殖和遷移及新形成的萌芽的成熟和穩(wěn)定，是一個涉及多種細胞的復(fù)雜多步驟過程[8]。動脈生成是指現(xiàn)有的小動脈互相吻合，建立新的側(cè)支循環(huán)，繞過血流中斷部位，改善遠端缺血組織的血供狀態(tài)[9]。血管發(fā)生指內(nèi)皮祖細胞所分化形成的血管叢[10]。在胚胎發(fā)育時期，內(nèi)皮祖細胞遷移、分化、結(jié)合成簇，形成血島，血島的外層細胞是成血管細胞，其可進一步分化成內(nèi)皮細胞，從而形成最初的血管叢[11-13]，該過程多發(fā)生于出生前。但在心肌梗死心肌缺血環(huán)境的情況下，心肌自身可觸發(fā)出生后的血管發(fā)生，動員內(nèi)皮祖細胞滲入損傷部位，分化為成熟的內(nèi)皮細胞，或通過旁分泌調(diào)控現(xiàn)有的內(nèi)皮細胞，在損傷部位形成新的毛細血管網(wǎng)[14-16]。本研究所述的血管新生是狹義的血管新生。

心肌梗死后心肌自身所能調(diào)動的促血管生成能力有限。因此，促進血管新生是如今急性心肌梗死治療方案中較有前景的一種[17-18]。目前，血管新生治療心肌梗死主要是通過蛋白/基因治療、干細胞/祖細胞治療和外泌體/微泡治療。其中蛋白/基因治療的主要限制是外源蛋白在靶組織中的半衰期短，降低了治療效果，而使用病毒載體作為基因的傳遞方法也存在免疫攻擊的風(fēng)險；在干細胞/祖細胞治療中，大多數(shù)被注入體內(nèi)的細胞會在前3 d死于細胞凋亡；納米級的外泌體/微泡治療則避開了另外兩種方法的局限性(見圖1)，成為一個備受期待的研究途徑[19]。本研究概述目前外泌體的形成和分離、鑒定手段，從不同細胞來源分析近些年外泌體在心肌梗死后調(diào)節(jié)血管新生的作用及機制。

圖1 血管新生治療心肌梗死的方法圖

1 外泌體

1967年，首次發(fā)現(xiàn)血小板釋放了一種囊泡樣的促凝物質(zhì)；1983年，Pan和Johnstone在綿羊的血清中又發(fā)現(xiàn)了一種胞外囊泡，1987年Johnstone等將其命名為“外泌體”[20]。外泌體最初被認為是細胞排泄廢物的“集裝箱”，隨著對外泌體更加深入的研究和了解，發(fā)現(xiàn)外泌體是細胞間溝通的重要方式。

1.1 外泌體的形成 細胞外小泡(extracellular vesicles，EVs)是細胞釋放的小脂泡，直徑30～200 nm[20]。EVs通常按大小分為外泌體(exosomes)、微泡或微粒子和凋亡小體。外泌體是EVs中的一部分，大小為40～160 nm[21]。細胞質(zhì)膜先內(nèi)陷為早期內(nèi)泌體，內(nèi)泌體互相融合，形成晚期內(nèi)泌體，即多囊泡體(MVBs)，MVBs內(nèi)出芽形成腔內(nèi)小泡(ILVs)，ILVs與細胞膜逐漸融合，通過Rab家族鳥苷三磷酸酶(GTPases)途徑向細胞膜外釋放，即通過胞吐被釋放到胞外的ILVs被稱為外泌體[21]。因此，外泌體的膜結(jié)構(gòu)與細胞膜較接近，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制Rab家族GTPases后，大量ILVs便會聚集在細胞內(nèi)，難以釋放形成外泌體[22]。

1.2 外泌體的內(nèi)容物 外泌體攜帶的物質(zhì)包括脂質(zhì)、代謝物、蛋白質(zhì)、microRNAs(miRNAs)、mRNAs、長鏈非編碼RNA(LncRNAs)和DNA[21]。外泌體可以直接與鄰近細胞相互作用，也可以間接通過體循環(huán)與遙遠的受體細胞相互作用。外泌體與靶細胞之間的相互作用不僅可以通過細胞表面受體結(jié)合，也可以通過內(nèi)吞作用將其攜帶的物質(zhì)釋放到受體細胞內(nèi)[21]。

1.2.1 脂質(zhì) 是一類廣泛存在的化合物，具有細胞膜的結(jié)構(gòu)成分、儲能來源和參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)功能[23]，一系列脂質(zhì)錨定著外泌體表面裝飾的蛋白質(zhì)。外泌體中的蛋白質(zhì)主要位于膜上，如跨膜四蛋白(CD81、CD82、CD37和CD63等)在外泌體中富集，其中CD9、CD81、CD63和TSG-101更是最常用的外泌體標記蛋白[20]。mRNAs將DNA所指定的遺傳信息傳遞給核糖體[24]。

1.2.2 LncRNAs 在人類基因組中，大約93%的DNA可以轉(zhuǎn)錄成RNA，其中2%是蛋白質(zhì)編碼的mRNAs，其余98%是已知的非編碼RNAs。在這些非編碼RNAs中，超過200個堿基的RNA被歸類為LncRNAs，LncRNAs已被證明在表觀遺傳控制和轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA新陳代謝以及干細胞維持和分化、細胞自噬和凋亡以及胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[25]。

1.2.3 DNA 外泌體中包括有單鏈DNA、雙鏈DNA、基因組DNA、線粒體DNA，甚至反轉(zhuǎn)錄的互補DNA[20]。

1.2.4 miRNA miRNA是內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA，含有18～22個核苷酸，通常與靶基因的3′UTR互補序列結(jié)合，抑制翻譯及促進mRNA降解[26]，外泌體可以通過分泌miRNA，調(diào)節(jié)下游通路中與血管新生相關(guān)基因的表達，從而促進梗死區(qū)域的血管新生。

1.3 外泌體的分離和鑒定方法 外泌體的分離主要使用以下兩種方法：通過差速離心技術(shù)分離，因為較大的囊泡優(yōu)先在相對較低的離心力下沉淀(10 000×g 離心30 min)，而較小的囊泡，如外泌體則優(yōu)先在較高的離心力下沉淀(70 000×g～100 000×g 離心90～120 min)[27]；密度梯度離心法，外泌體漂浮在粘性溶液(例如蔗糖或碘化醇)不斷稀釋的梯度中，離心后遷移到其(平衡)密度區(qū)域內(nèi)[28]，外泌體則多集中1.13～1.20 g/mL密度條帶[29]。這兩種方法較常用，且經(jīng)常聯(lián)合使用。但除此之外，還有尺寸排除色譜，當(dāng)含有顆粒的溶液通過固定相時，小顆粒能夠進入多孔珠，較大的顆粒比小顆粒通過柱的速度更快，并且洗脫的時間點比小顆粒更早，這種方法不僅不會影響外泌體的完整性，還保留了外泌體的功能；超濾是使用具有特定分子量截止值或孔徑的半透膜進行分離，簡單高效；還可以通過使用特定外泌體表面抗原的抗體進行免疫親和純化，這種方法基于一組多達39種不同類型的珠子的使用，每種珠子都與一種捕獲抗體相連，并與熒光標記的檢測抗體相結(jié)合，從而可以分析攜帶有兩種抗體的外泌體[28]。各實驗因研究的目的和過程不同，選用的分離方法會略有差別，主要是時間和離心力上的差別，具體情況需根據(jù)各自的實驗材料和目的進行調(diào)節(jié)。

針對分離的外泌體目前有多種鑒定方法，主要包括使用透射電子顯微鏡觀察之前所得到的外泌體的直徑，一般為40～160 nm；熒光顯微鏡觀察被特異熒光探針標記的外泌體[30]；超分辨率顯微鏡對于確定外泌體大小甚至亞外泌體分布也有一定的可能性[31]；單粒子干涉反射(SPIR)成像則可以顯示50～200 nm的單個外泌體大小，當(dāng)與常規(guī)熒光顯微鏡相結(jié)合時，還可以檢測特定脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和糖類的存在和豐富[32]；流式細胞術(shù)也可為分析外泌體的大小提供有力證據(jù)[33]。

2 不同細胞來源外泌體對于心肌梗死后血管新生的作用

外泌體可以從多種類型的細胞中釋放出來，不論是生理還是病理條件下，都是細胞間溝通的重要方式。本研究將不同來源且對心肌梗死后血管新生有調(diào)節(jié)作用的外泌體分為血漿、血清、血小板、巨噬細胞、干細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞等11種類型。

2.1 血漿來源的外泌體 Liu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中的外泌體可以向骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)移，通過釋放miR-144-3p來抑制干細胞中的Ets1表達，從而擾亂基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)途徑，損害骨髓中內(nèi)皮祖細胞的動員，造成血管生成功能障礙。Chen等[35]在對大鼠進行心肌梗死造模后，對大鼠雙后肢進行遠端缺血性調(diào)節(jié)(remote ischemic conditioning，RIC)，發(fā)現(xiàn)血漿中的外泌體通過靶向熱休克蛋白70(Hsp70)增加了內(nèi)皮細胞G1期的百分比、細胞遷移、細胞增殖、血管形成，并且抑制細胞凋亡，這一過程不僅促進了內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等血管生成相關(guān)分子的表達，還改善了心臟細胞重塑，抑制了膠原蛋白沉積，促進血管生成進而降低了梗死率。

2.2 血清來源的外泌體 Geng等[36]認為，從心肌梗死病人血清中提取出來的外泌體miR-143可能來自心肌細胞，其分泌的miR-143可以直接靶向胰島素樣生長因子I受體(IGF-IR)/一氧化氮(NO)途徑促進內(nèi)皮細胞血管新生。

2.3 血小板來源的外泌體 Huber等[37]研究報道，血小板來源外泌體通過分泌miR-320減少內(nèi)皮細胞中細胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達，從而促進內(nèi)皮細胞運動，防止心肌進一步損傷。

2.4 巨噬細胞分泌的外泌體 Liu等[38]研究心肌梗死顯示，促炎癥的M1型巨噬細胞釋放大量外泌體，具有抗血管生成和加速心肌損傷的作用，其通過分泌miR-155，轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞內(nèi)，下調(diào)Rac家族小G蛋白酪氨酸酶1(Rac1)、p21激活的激酶2(PAK2)、沉默調(diào)節(jié)蛋白1(Sirt1)和蛋白激酶AMP激活的催化亞基α2(AMPKα2)等靶基因的表達，從而抑制血管生成，導(dǎo)致心功能不全。M1型分泌的外泌體可以通過同時靶向5個分子節(jié)點(基因)，抑制Sirt1/AMPKα2-eNOS和Rac家族小GTP酶1-p21(Rac1)激活的激酶1/2(Rac1-PAK1/2)信號通路，抑制α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和CD31的表達水平，抑制心臟中血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGFA)-VEGF受體2(VEGFR2)的信號，從而降低內(nèi)皮細胞的血管生成能力，加重心肌損傷，抑制心臟愈合[38]?？寡椎腗2型巨噬細胞可產(chǎn)生促血管生成因子(如白細胞介素-10、血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β)來促進血管生成和組織愈合，但M2巨噬細胞衍生的外泌體的功能有待進一步研究。

2.5 干細胞分泌的外泌體

2.5.1 脂肪干細胞分泌的外泌體 脂肪干細胞釋放出外泌體，其中的miR-31被運送到血管內(nèi)皮細胞后，抑制低氧誘導(dǎo)因子-1(FIH1-1抑制因子)的活性，進而抑制HIF-1α的羥化，防止其被蛋白酶體降解，HIF-1α入核后能調(diào)控下游血管新生相關(guān)基因的表達從而促進血管新生過程[39]。另外發(fā)現(xiàn)，肥胖可以通過降低脂肪干細胞來源的外泌體中miR-126的含量，從而降低其促血管生成潛能[40]。

2.5.2 誘導(dǎo)多能干細胞分泌的外泌體 研究證明，誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)細胞分泌的外泌體能夠?qū)⑸嫘盘枏膇PSC傳輸?shù)洁徑男募〖毎鸞41]。iPSC分泌的外泌體能夠通過自身某些miRNAs和蛋白增強體外培養(yǎng)的小鼠心臟內(nèi)皮細胞的成管、遷移和抗凋亡特性[42]。

2.5.3 胚胎干細胞分泌的外泌體 胚胎干細胞來源的外泌體可誘導(dǎo)心肌內(nèi)源性修復(fù)，增強心肌細胞存活、分化及擴張，間接通過心臟祖細胞分泌的外泌體，激活內(nèi)皮細胞，促進血管新生[43]。

2.5.4 間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體 人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(AD-MSC)的外泌體中的miR-125a可以進入內(nèi)皮細胞，并通過直接抑制其靶向的δ樣蛋白4(DLL4)，來抑制內(nèi)皮細胞尖端細胞的形成，調(diào)節(jié)血管生成過程中內(nèi)皮細胞的萌芽[44]。人臍帶來源的間充質(zhì)干細胞(HUC-MSCs)的外泌體分泌蛋白激酶B(Akt)，通過激活血小板衍生生長因子D促進心臟再生和促進血管生成[45]。人子宮內(nèi)膜來源的充質(zhì)干細胞(EN-MSCs)的外泌體分泌的miR-23可以通過靶向Sprouty2和Sema6A，激活促血管生成信號，從而促進心臟內(nèi)皮細胞的血管生成，EN-MSCs分泌的miR-21可以通過影響靶細胞內(nèi)磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)/Akt信號通路，促進心肌梗死區(qū)域血管新生和心肌細胞存活[46]。骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)來源的外泌體可以通過過表達HIF-1α促進新生血管的形成和抑制心肌梗死大鼠的纖維化來保護心功能[47]，而且，其分泌的miR-210可以通過自身結(jié)構(gòu)性過表達來促進心肌細胞增殖、細胞存活和血管生成來挽救心肌梗死后的心功能[48]。

但目前有研究發(fā)現(xiàn)，相較于BM-MSCs和AD-MSCs，EN-MSCs的條件培養(yǎng)基使內(nèi)皮細胞的凋亡減少，毛細血管形成更多，促血管新生作用優(yōu)于前兩者[16]。

2.6 內(nèi)皮細胞分泌的外泌體 血管內(nèi)皮細胞分泌富含miR-214的外泌體，miR-214抑制作為受體的內(nèi)皮細胞中毛細血管擴張突變(ATM)的表達，從而避免衰老、促進內(nèi)皮細胞遷移和刺激血管生成[49]。

2.7 周細胞分泌的外泌體 周細胞(pericyte)是一種包圍全身毛細血管和靜脈中內(nèi)皮細胞的細胞，可以通過調(diào)控內(nèi)皮細胞增殖分化，進而調(diào)控血管生成周細胞既可以分泌大量VEGFA、AngⅠ和適量的VEGF-B186，通過Akt和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Erk)誘導(dǎo)血管生成和存活反應(yīng)，還可以通過自身分泌的外泌體中的miR-132激活A(yù)kt，從而激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路，誘導(dǎo)血管新生[50]。周皮細胞還可以通過驅(qū)動HIF途徑，促進外泌體分泌Manne，從而促進血管生成[51]。

2.8 心肌細胞分泌的外泌體 健康心肌細胞來源的外泌體含有更高含量的促血管生成miR-126，可促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管狀細胞的形成，但糖尿病大鼠的心肌細胞含有更高含量的抗血管生成miR-320，抑制血管生成[52]。另外，心肌細胞在低氧情況下釋放的外泌體，其中CircHIPK3可以通過抑制miR-29a活性，使VEGFA表達增加，進而促進心肌內(nèi)皮細胞的細胞周期進程和增殖，促進梗死區(qū)周圍邊緣血管的形成[53]。心肌細胞缺血條件下分泌的外泌體不僅表現(xiàn)出較高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，并且還可以促進內(nèi)皮細胞分泌MMP，而且外泌體含有相對豐富的miR-222和miR-143，其能發(fā)揮部分促血管生成效應(yīng)，協(xié)助外泌體改善心肌梗死后新生血管的形成[54]。

2.9 心肌祖細胞分泌的外泌體 心肌祖細胞分泌的外泌體不僅可以通過調(diào)控miR322-CUL2-HIF1α信號軸的機制增加內(nèi)皮細胞的血管生成反應(yīng)，還可以通過miR-322上調(diào)NADPH氧化酶2(Nox2)，增加Nox2衍生的活性氧增加內(nèi)皮細胞遷移和毛細管形成，從而促進內(nèi)皮細胞血管生成[55]。

2.10 心肌成纖維細胞分泌的外泌體 成纖維細胞的外泌體可以通過分泌基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)和VEGF促進血管新生和抑制心肌細胞凋亡[56]。

2.11 心肌球源性細胞分泌的外泌體 心肌球源性細胞能夠使心肌梗死后心臟瘢痕縮小和促進功能性心肌的生長[57]，其分泌外泌體若缺失miR-146a則能夠抑制心肌細胞凋亡[58]，含有miR-24則可以減少心肌瘢痕的形成[59]，整個外泌體能夠促進心肌細胞增殖，同時促進血管生成[58]。詳見表1。

表1 不同細胞來源外泌體對心肌梗死后血管新生的作用

3 小 結(jié)

不同細胞來源的外泌體具有促血管新生、抗炎、抑制細胞凋亡、減少細胞自噬、改善心肌梗死后心功能的作用，其低毒性、高穩(wěn)定性、低免疫原性、高效轉(zhuǎn)運性、與間充質(zhì)干細胞治療的等效性，靶向運輸性以及納米級大小、雙層脂膜結(jié)構(gòu)、易制取儲存等特點，使其成為心肌梗死后心臟修復(fù)新的研究熱點[16]。外泌體有諸多優(yōu)勢，但因其體積較小，所以提取和定量仍然具有挑戰(zhàn)性；而且外泌體能否應(yīng)用于臨床，其自身安全性及并發(fā)癥是最為需要確定的重要因素。關(guān)于外泌體的功能、機制和用途的研究目前仍處于起步階段。

中醫(yī)藥由于其“多組分、多靶點”的特點，在治療心肌梗死等復(fù)雜性疾病中發(fā)揮獨特優(yōu)勢。大量活血化瘀類中藥已經(jīng)被證明能夠通過促進心肌梗死后血管新生對缺血心肌發(fā)揮保護作用，然而針對中藥能否通過調(diào)控外泌體發(fā)揮對缺血心肌的保護作用的研究仍需要進一步探究，可為解決中藥藥理機制不明的問題提供新的研究思路，對促進中藥現(xiàn)代化具有重要意義。研究證明，速效救心丸可以通過作用于小鼠心臟間充質(zhì)干細胞，通過調(diào)節(jié)GTPase Rab27途徑，從而增加間充質(zhì)干細胞的外泌體釋放，能保護急性的心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的細胞凋亡[60]。外泌體載著姜黃素進入體內(nèi)后，可通過miR-21下調(diào)內(nèi)皮細胞中的白細胞介素-8(IL-8)和細胞黏附因子-1(VCAM-1)，從而抑制內(nèi)皮細胞黏附，抑制血管新生[61]。補陽還五湯[62]其有效成分可通過增加BM-MSCs來源外泌體中的miR-126，降低miR-221和miR-222，激活VEGF，促進血管生成。低濃度淫羊藿苷能夠促進缺氧條件下間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體中miR-126的表達，經(jīng)旁分泌，通過VEGF信號通路，促進內(nèi)皮細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和血管生成[63]。除此以外，研究也證明中藥植物也可以分泌外泌體，其中所含有的miRNA能夠調(diào)控其他物種的基因，被人體吸收后發(fā)揮藥用植物的藥理作用[29]。袁鵬等[64]認為中藥制品存在有效成分溶解度不高、生物利用度不高的缺陷，而外泌體作為新興的細胞間通訊的工具，可能作為中藥載體發(fā)揮作用。

綜上所述，外泌體可能為心肌梗死后心臟修復(fù)的一種有效和安全的方法。而中藥發(fā)揮防治心肌梗死的作用是否通過自身外泌體的產(chǎn)生或者入血后刺激不同細胞分泌外泌體發(fā)揮作用仍需進一步探討。