參連復(fù)脈顆粒對脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞極化的影響

蔡 蕓，信琪琪，劉 靜，高 群，繆 宇，袁 蓉，馬 征，潘 熠，范 姣，叢偉紅，林 謙

心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見心律失常之一[1]。研究表明，單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞是心房顫動病人心房中最豐富的炎性細(xì)胞[2]。巨噬細(xì)胞具有不同亞型，M1型巨噬細(xì)胞是一種促炎性細(xì)胞，活化后可高表達(dá)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等細(xì)胞因子[3]，促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展，而M2型巨噬細(xì)胞則具有強(qiáng)大的吞噬能力，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)免疫調(diào)節(jié)[4-5]。其中，具有促炎作用的M1型巨噬細(xì)胞增多并極化在心房電重構(gòu)中起主要作用[6]。巨噬細(xì)胞在心房顫動病人的心內(nèi)膜大量浸潤，可以促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的增殖導(dǎo)致纖維化，參與心房顫動的發(fā)病過程[7-8]，促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化表型轉(zhuǎn)化，抑制炎癥反應(yīng)，可能在心房顫動治療中發(fā)揮重要作用。

參連復(fù)脈顆粒(原益氣復(fù)脈合劑)是傳承名老中醫(yī)學(xué)術(shù)思想擬定而成，前期臨床研究證實(shí)合并竇房結(jié)病變的心房顫動病人射頻消融術(shù)后應(yīng)用參連復(fù)脈顆粒，能減少心房顫動復(fù)發(fā)，改善竇房結(jié)功能，改善臨床癥狀[9]。本實(shí)驗(yàn)通過建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，探討參連復(fù)脈顆粒含藥血清對RAW264.7巨噬細(xì)胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及藥品 小鼠RAW264.7單核巨噬細(xì)胞株，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；阿托伐他汀鈣(atorvastatin calcium)：CAS號344423-98-9，分子量1 209.39(Sigma公司)；LPS：CAS號93572-42-0(Sigma公司)；參連復(fù)脈顆粒(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院院內(nèi)制劑，專利號2013 1 0303390.5)，組方：黨參5 g，丹參5 g，黃連3 g，法半夏2.5 g，赤芍3 g，川芎3 g，鬼箭羽3 g，白芍3 g，遠(yuǎn)志3 g，酸棗仁5 g，炙甘草5 g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院經(jīng)水提、醇提、干燥及顆粒成型工藝加工后制成18 g浸膏粉顆粒。

1.2 主要試劑與儀器 杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM，Gibco公司)；破膜工作液(Servicebio公司)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，Servicebio公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒(北京Solarbio公司)；CD68抗體(Abcam 公司，ab53444)；CD163抗體(Abcam 公司，ab182422)；TNF-α抗體(Abcam 公司，ab66579)；IL-6抗體(Abcam 公司，ab7737)；酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；熒光倒置顯微鏡(德國LEICADMIL LED)；離心機(jī)(美國BECKMAN COULTER Allgra X-15R)；轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；轉(zhuǎn)移槽(北京六一儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 含藥血清制備、細(xì)胞造模、分組與給藥 健康雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為空白組、中藥組。中藥組給予參連復(fù)脈顆粒0.81 g/(kg·d)，連續(xù)灌胃3 d，末次給藥2 h后腹主動脈取血，室溫靜置0.5 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清，于56 ℃水浴鍋滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。炎癥細(xì)胞模型構(gòu)建及分組：使用LPS 0.1 μg/mL刺激RAW264.7細(xì)胞24 h構(gòu)建巨噬細(xì)胞炎癥模型。將細(xì)胞分為正常對照組(RAW264.7+空白血清)、模型組(RAW264.7+LPS+空白血清)、中藥組(RAW264.7+LPS+參連復(fù)脈顆粒含藥血清)、阿托伐他汀鈣組(RAW264.7+LPS+空白血清+10 μmol/L阿托伐他汀鈣)。

1.3.2 MTT法 將RAW264.7細(xì)胞懸液以6×103個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜至細(xì)胞貼壁。第2天，按照實(shí)驗(yàn)分組加入100 μL一定濃度藥物干預(yù)細(xì)胞24 h，吸取上清液棄去后，每孔加入MTT液10 μL和完全培養(yǎng)基90 μL，37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 mm處測量各孔吸光度值，根據(jù)吸光度值(OD)比較細(xì)胞活力。所有結(jié)果均來自至少3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 熒光染色雙標(biāo)法 收集對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，按照8×104個/mL密度將細(xì)胞接種到6孔板中，每孔2 mL，6孔板底放入細(xì)胞爬片，貼壁后，按照不同分組加入一定濃度藥物處理24 h后，加入2 mL 4%多聚甲醛室溫固定30 min；100 μL破膜工作液細(xì)胞破膜20 min；3% BSA封閉30 min；滴加一抗大鼠抗小鼠CD68抗體和兔抗小鼠CD163抗體，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；滴加二抗CY3標(biāo)記的羊抗大鼠和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)，室溫孵育50 min；二脒基苯基吲哚(DAPI)復(fù)染細(xì)胞核；抗熒光淬滅封片劑封片；鏡檢拍照；結(jié)果判讀：CD68+呈紅色熒光，CD163+呈綠色熒光，用Image J 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)用于計(jì)算CD163+/CD68+RAW264.7細(xì)胞所占比例以反映RAW264.7細(xì)胞極化情況。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot) 提取各組RAW264.7細(xì)胞蛋白，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液，輕輕混合，95 ℃變性10 min，將30 μg樣品輕輕加至凝膠孔中，將電壓調(diào)至80 V 使樣品通過濃縮膠與分離膠(電壓約8 V/cm)，電泳使染料至分離膠適當(dāng)位置，結(jié)束電泳；采用半干轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方式，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，轉(zhuǎn)膜條件：電流100 mA，電壓60 V左右，轉(zhuǎn)膜時間為60 min。取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫?fù)u床上封閉1 h，放入稀釋后的TNF-α、IL-6(1∶1 000)一抗工作液中，4 ℃孵育過夜；用洗膜緩沖液TBST洗膜10 min×3次，加入稀釋后的二抗工作液(1∶2 000)中，室溫避光1 h，TBST洗膜10 min×3次，曝光及洗片，利用UVP凝膠成像分析系統(tǒng)采圖，分析軟件分析灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0及GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料組間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布或方差不齊者的定量資料組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力比較 與正常對照組比較，模型組細(xì)胞活力OD值升高(P<0.05)，提示LPS可促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖；與模型組比較，中藥組和阿托伐他汀鈣組細(xì)胞活力OD值降低(P<0.05)；中藥組與阿托伐他汀鈣組細(xì)胞活力OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明參連復(fù)脈顆粒含藥血清可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖，且效果與阿托伐他汀相當(dāng)。詳見圖1。

與正常對照組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.2 4組CD163+/CD68+比值比較 與正常對照組比較，模型組CD163+/CD68+比值降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和阿托伐他汀鈣組CD163+/CD68+比值升高(P<0.05)；阿托伐他汀鈣組與中藥組CD163+/CD68+比值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞以M1型極化為主，參連復(fù)脈顆粒含藥血清可以降低M1型巨噬細(xì)胞極化的比例，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，且與阿托伐他汀鈣效果相當(dāng)。詳見圖2、圖3。

與正常對照組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

圖3 免疫熒光檢測4組LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞由M1向M2表型轉(zhuǎn)化情況(×400)

2.3 4組IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，模型組IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，阿托伐他汀鈣組IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示參連復(fù)脈顆粒含藥血清可以一定程度抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性因子IL-6、TNF-α的表達(dá)，可抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型極化。詳見圖4～圖6。

與正常對照組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

與正常對照組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

圖6 4組IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)條帶圖

3 討 論

炎癥是誘發(fā)和導(dǎo)致持續(xù)心房顫動的危險因素[10]，炎性因子水平的高低與心房顫動的發(fā)生和維持等密切相關(guān)。研究表明，心房顫動病人C反應(yīng)蛋白(CRP)、IL-6和TNF-α水平明顯升高[11]，且血漿中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α因子水平明顯高于正常組，這些因子水平與心房顫動獨(dú)立相關(guān)[12]。另外，炎性因子水平與心房顫動病人進(jìn)行心臟復(fù)律的預(yù)后以及復(fù)發(fā)預(yù)測也密切相關(guān)[13]?？寡姿幬飳π姆款潉拥挠绊懸沧C明了心房顫動與炎癥之間的關(guān)系，他汀類藥物可以明顯降低心房顫動的復(fù)發(fā)率[14]，降低CRP、IL-6和TNF-α的水平，如阿托伐他汀鈣可能通過抑制山羊心包炎模型炎癥來延長心房有效不應(yīng)期及縮短心房顫動持續(xù)時間[15]。

巨噬細(xì)胞是一種異質(zhì)性的免疫細(xì)胞，通過合成和分泌多種炎癥介質(zhì)，包括IL-6、TNF-α等，在對抗病原體的第一線防御中扮演主要角色，并調(diào)節(jié)和平衡病原體或組織引起的炎癥過程[16-17]?？伤苄允蔷奘杉?xì)胞的關(guān)鍵特征，循環(huán)的單核細(xì)胞可以離開血液并遷移到組織中，在炎癥期間更容易分化為巨噬細(xì)胞；同時，微環(huán)境中局部生長因子、促炎細(xì)胞因子等會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活并極化為不同的表型，表現(xiàn)出功能性變化，在炎癥性疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[18-19]。根據(jù)表面標(biāo)記物的表達(dá)、特定因子的產(chǎn)生和生物活性，單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞可以分為促炎作用的經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1)和有抑炎作用的替代激活巨噬細(xì)胞(M2)兩種類型[20-21]。M1型巨噬細(xì)胞通常是由TH1細(xì)胞因子誘導(dǎo)的，如TNF-α、γ干擾素(IFN-γ)或LPS，這些巨噬細(xì)胞活化后可產(chǎn)生和分泌高水平的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6和iNOS等，這些因子參與機(jī)體的防御機(jī)制，有助于吞噬外來病原體，M1型巨噬細(xì)胞還可直接分化為TH1和TH17抗炎細(xì)胞，并進(jìn)行擴(kuò)增，加劇炎癥反應(yīng)，若該應(yīng)答得不到控制，則可導(dǎo)致組織損傷，損害組織再生和傷口愈合，加重病情發(fā)展[21-24]。M2型巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬能力，為了防止組織損傷，M2型巨噬細(xì)胞的清除凋亡細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)免疫調(diào)節(jié)等特性抑制了慢性炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[5-6，25]。在正常組織中，M1與M2型巨噬細(xì)胞的比值是受高度調(diào)控的，通過各自的細(xì)胞因子發(fā)揮作用。在炎癥反應(yīng)中，這一比例發(fā)生了改變，向M1型方向極化為主。在表型上，M1經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞比M2替代激活的巨噬細(xì)胞更小，空泡化程度低[26-27]。由于基因或微環(huán)境的干擾，炎癥調(diào)節(jié)的喪失可能會誘發(fā)許多疾病。心房顫動長期以來都被認(rèn)為與炎癥有關(guān)[28]，故將巨噬細(xì)胞的極化從促炎狀態(tài)恢復(fù)到抗炎狀態(tài)對炎癥性疾病的治療可能有重要意義。

心房顫動屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“怔忡”范疇，其基本病機(jī)有虛、實(shí)兩方面，虛者為氣血陰陽虧損，心神失養(yǎng)所致；實(shí)者則多由痰熱、水飲、瘀血等實(shí)邪擾亂心神所致，虛實(shí)之間又多相互夾雜轉(zhuǎn)化。參連復(fù)脈顆粒是基于中醫(yī)經(jīng)典氣血理論和名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)開發(fā)而成的院內(nèi)制劑，臨床應(yīng)用多年。方中黨參補(bǔ)脾益氣，丹參活血安神，合用針對氣虛血瘀的主要病機(jī)，共為君藥；黃連清心降火，法半夏燥濕化痰，二藥合用有清熱化痰之效，共為臣藥；赤芍涼血化瘀，川芎行氣活血，鬼箭羽活血通經(jīng)，白芍養(yǎng)血柔肝，遠(yuǎn)志安神定志，酸棗仁養(yǎng)心安神，六藥合用為佐藥，佐助君藥增強(qiáng)行氣活血、安神止悸之功；炙甘草益氣復(fù)脈、調(diào)和藥性，故為佐使藥。全方充分體現(xiàn)了氣帥血行、標(biāo)本兼治的組方特點(diǎn)，以達(dá)到益氣活血、清心化痰、安神復(fù)脈的功效。

本課題組前期臨床研究顯示，參連復(fù)脈顆粒可降低氣虛血瘀、痰瘀互阻型病人24 h動態(tài)心電圖室性期前收縮次數(shù)，改善心悸癥狀，安全性好，未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)[9]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，參連復(fù)脈顆?？梢越档透哐獕捍笫竽Ｐ蜕叩难逖仔砸蜃覶NF-α、IL-6水平，對部分心房電特性異常有抑制作用，可能有抑制心房顫動易感性增加的作用[29]。為研究參連復(fù)脈顆粒含藥血清是否可能抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型極化，本研究建立LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，MTT法檢測結(jié)果提示參連復(fù)脈顆粒含藥血清可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞增殖，且效果與阿托伐他汀鈣相當(dāng)。Western Blot法檢測參連復(fù)脈顆粒含藥血清對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果提示LPS刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α因子，參連復(fù)脈顆粒含藥血清可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α蛋白的分泌表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化。

CD68是巨噬細(xì)胞表面的特異性分子標(biāo)志物[30]，M2型巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬能力，可以抑制炎癥反應(yīng)[6]，其常見的表面標(biāo)志有清道夫受體(CD163)和甘露糖受體(CD206)等[31]。通過免疫熒光雙標(biāo)法檢測巨噬細(xì)胞極化，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，模型組CD163+/CD68+比值較正常對照組降低，中藥組較模型組升高，說明LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞以M1型極化為主，參連復(fù)脈顆粒含藥血清可以降低M1型巨噬細(xì)胞極化的比例，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，且效果與阿托伐他汀鈣相當(dāng)。

綜上所述，參連復(fù)脈顆粒含藥血清可以抑制活化巨噬細(xì)胞中炎癥介質(zhì)的釋放，一定程度上抑制了RAW264.7巨噬細(xì)胞向M1型極化，促進(jìn)其向M2型極化，這可能是其治療心房顫動的一個可能機(jī)制。本研究結(jié)果為參連復(fù)脈顆粒對心房顫動的早期預(yù)防和治療提供依據(jù)，但其產(chǎn)生這些效應(yīng)的更多機(jī)制還需進(jìn)一步探究。