植物生物鐘抵御生物脅迫研究進(jìn)展

黃 巍，李 靜，莊 藝，陳丁豪

(亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510642)

光、溫度等環(huán)境信號(hào)由于地球的自轉(zhuǎn)和公轉(zhuǎn)而呈現(xiàn)出晝夜、季節(jié)的周期性變化。生物體進(jìn)化出了生物鐘(Circadian clock)這一內(nèi)源性計(jì)時(shí)分子機(jī)制以適應(yīng)外界環(huán)境的這種周期性變化[1]。生物鐘不僅調(diào)控植物的生長發(fā)育[2]，還參與了植物細(xì)胞、分子等層次上新陳代謝的調(diào)節(jié)，協(xié)調(diào)植物的抗逆響應(yīng)等，使植物更好地適應(yīng)環(huán)境[3]。

有研究表明，生物鐘可調(diào)控植物的免疫反應(yīng)，這對(duì)植物抵御病蟲害起到重要作用[4]。植物和動(dòng)物一樣，每天不同時(shí)間都會(huì)受到各種病原體和昆蟲的攻擊。雖然植物不能像動(dòng)物一樣在體內(nèi)產(chǎn)生相關(guān)抗體，但植物可以通過多種機(jī)制抵御病原體和害蟲的入侵。研究表明，生物鐘協(xié)調(diào)免疫系統(tǒng)響應(yīng)病原體和害蟲入侵，從而使生物鐘節(jié)律紊亂。植物免疫與相關(guān)抗病基因的大量轉(zhuǎn)錄和翻譯離不開關(guān)系，尤其是誘導(dǎo)抗性，可能會(huì)使得植物突然需要消耗巨大的能量，甚至可能會(huì)影響植物正常的生長與發(fā)育[5-6]。生物鐘幫助植物“預(yù)測(cè)”侵害發(fā)生的時(shí)間，使植物提前做好準(zhǔn)備，從時(shí)間上調(diào)控免疫從而實(shí)現(xiàn)能量的優(yōu)化分配[7]，這種生物鐘和植物先天免疫的相互調(diào)節(jié)可能對(duì)有限資源的重新分配至關(guān)重要，能夠確保植物的正常生長和發(fā)育，以及它們對(duì)生物脅迫的及時(shí)應(yīng)答。另一方面，病原體的攻擊可以使植物體內(nèi)的激素、活性氧水平發(fā)生變化，這些信號(hào)可重置植物生物鐘。因此，入侵者與植物之間生物鐘調(diào)控存在互作，生物鐘調(diào)控是植物抵御病原體和害蟲機(jī)制的必要組成部分。

1 植物生物鐘與植物免疫

1.1 植物生物鐘

植物在生長發(fā)育的進(jìn)程中受到了諸多環(huán)境信號(hào)的影響與調(diào)控，地球自轉(zhuǎn)導(dǎo)致的晝夜變化、地球公轉(zhuǎn)導(dǎo)致的季節(jié)性變化等會(huì)使得外部環(huán)境信號(hào)呈現(xiàn)節(jié)律性和周期性的變化[8]。植物進(jìn)化出了生物鐘這一復(fù)雜的多級(jí)調(diào)控系統(tǒng)，幫助其預(yù)測(cè)外界環(huán)境周期性的變化，并增強(qiáng)植物的環(huán)境適應(yīng)能力。植物生物鐘幾乎調(diào)控植物所有的生命活動(dòng)，在雙子葉植物中，下胚軸伸長、植株生長、花瓣開閉、葉片震動(dòng)、氣孔開閉都有近24 h的節(jié)律。植物的晝夜節(jié)律和外界環(huán)境變化的周期達(dá)時(shí)空上的同步，從而增強(qiáng)植物的適應(yīng)性[9]。

植物生物鐘有3個(gè)典型的特征，分別為內(nèi)源性、可馴化性和溫度補(bǔ)償性[10]。內(nèi)源性是指生物獨(dú)立于外界環(huán)境。即使在恒定環(huán)境條件下，植物的生命活動(dòng)仍保持近24 h周期節(jié)律性變化，生物鐘系統(tǒng)是由生物遺傳得來的，可以使得生物體能夠預(yù)測(cè)外界環(huán)境的周期性變化并提前作出應(yīng)答?？神Z化性是指生物鐘的振蕩周期可受光照、溫度等周圍環(huán)境信號(hào)的變化所調(diào)控。這些引導(dǎo)植物重置生物鐘的外界環(huán)境信號(hào)(例如光照、溫度等)被稱為“授時(shí)因子”(Zeitgeber，ZT)[11]。溫度補(bǔ)償性是指植物的近日節(jié)律的周期長度具有溫度補(bǔ)償現(xiàn)象，即在適當(dāng)?shù)臏囟确秶鷥?nèi)，植物的近似晝夜節(jié)律保持穩(wěn)定[12]。研究人員通常使用余弦曲線來描述一個(gè)生物節(jié)律事件，以便定量化分析生物鐘，主要有周期(Period)、相位(Phase)和振幅(Amplitude) 3個(gè)參數(shù)[12]。

生物鐘是一個(gè)十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),一般認(rèn)為至少由3個(gè)部分組成：輸入途徑(Input pathways)、核心振蕩器(Core oscillator)以及輸出途徑 (Output pathways)[13]。核心振蕩器能接收并處理外部環(huán)境信號(hào)，如環(huán)境中的光[14]、溫度[15]、濕度[16]等授時(shí)因子信號(hào)，以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分，可以通過輸入途徑重設(shè)生物鐘；核心振蕩器是生物鐘的內(nèi)源“計(jì)時(shí)器”，核心振蕩器將其產(chǎn)生的近24 h的振蕩節(jié)律傳導(dǎo)到輸出途徑；輸出途徑是指核心振蕩器參與調(diào)控的多種生命活動(dòng)，例如氣孔的開合、葉片的運(yùn)動(dòng)、生長和衰老、下胚軸伸長、植物激素的合成和代謝、胞質(zhì)中的離子水平、基因的節(jié)律性表達(dá)以及植物的抗逆性等，通過維持生物進(jìn)程近24 h的節(jié)律振蕩，從而增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[17]，保證自身的生長發(fā)育和繁殖。故生物鐘的基本運(yùn)作邏輯如下：授時(shí)因子信號(hào)通過輸入途徑被生物鐘核心振蕩器的組分感知后，進(jìn)而調(diào)控植株在生長、發(fā)育、代謝水平產(chǎn)生節(jié)律性變化，實(shí)現(xiàn)與環(huán)境變化的同步。植物可以借助生物鐘的調(diào)節(jié)，對(duì)即將到來的環(huán)境變化提前做出準(zhǔn)備，將對(duì)生長發(fā)育的負(fù)面影響降到最低，同時(shí)最大限度地獲取和利用資源[1]。

1.2 生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

研究表明，植物生物鐘的核心振蕩器是一個(gè)復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它由多個(gè)連鎖的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)(Transcription-translation feedback loops，TTFLs)組成[18-20]。TTFLs主要由轉(zhuǎn)錄抑制子CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1(CCA1)、LHY LATE ELONGATED HYPOCOTYL(LHY)、PSEUDORESPONSE REGULATOR 3(PRR3)、PRR5、PRR7、PRR9、TIMING OF CABEXPRESSION 1(TOC1/PRR1) 、LUX ARRYHTHMO(LUX)、EARLY FLOWERING 3(ELF3)、ELF4等生物鐘基因組成[21-23]。其中CCA1、LHY在黎明時(shí)刻達(dá)到表達(dá)高峰，二者形成異源二聚體調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，被稱為早晨基因(Morning gene)[23]，TOC1在黃昏時(shí)刻表達(dá)并在夜間發(fā)揮功能，LUX與ELF3和ELF4組成的EC復(fù)合體 (Evening complex)[24]在午夜時(shí)分發(fā)揮功能，這些基因被稱為傍晚基因(Evening gene)。TTFLs中也有少數(shù)轉(zhuǎn)錄激活子，例如REVEILLEs(RVEs)、LIGHT-REGULATED WDs(LWDs)、NIGHT LIGHT-INDUCIBL EAND CLOC KREGULATEDs(LNKs)、TEOSINTE BRANCHED1-CYCLOIDEA-PCF20 (TCP20)和TCP22等[25]，這些轉(zhuǎn)錄激活子集中于黎明前后3 h表達(dá)。

植物中第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的生物鐘轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)由CCA1、LHY和TOC1組成，如圖1所示，CCA1和LHY有部分功能冗余，能抑制TOC1的轉(zhuǎn)錄[26]，而TOC1也可以抑制CCA1/LHY的轉(zhuǎn)錄。早晨反饋環(huán)基因包括CCA1、LHY、PRR9和PRR7。CCA1/LHY與PRR9/PRR7相互抑制對(duì)方的表達(dá)，CCA1和LHY抑制自身轉(zhuǎn)錄的同時(shí)還抑制對(duì)方的轉(zhuǎn)錄。夜晚反饋環(huán)由T O C 1和L U X、E L F 3、ELF4(EC)復(fù)合體組成。TOC1抑制LUX和ELF4的轉(zhuǎn)錄，而EC復(fù)合體則抑制TOC1的表達(dá)，EC復(fù)合體間接地促進(jìn)了CCA1/LHY的轉(zhuǎn)錄，而CCA1/LHY抑制ELF4和LUX的轉(zhuǎn)錄，此外ELF3也受CCA1的負(fù)調(diào)控。EC復(fù)合體抑制PRR7和PRR9，間接緩解后者對(duì)CCA1和LHY表達(dá)的抑制，RVE8與RVE4能通過招募LNK1和LNK2，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體激活PRR5、TOC1等靶基因的轉(zhuǎn)錄。隨著新的生物鐘基因不斷被鑒定，新核心生物鐘基因的相關(guān)研究不斷地加入生物鐘網(wǎng)絡(luò)，與已知生物鐘基因形成更為復(fù)雜的TTFLs調(diào)控回路。除轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制以外，生物鐘基因還受染色質(zhì)的重塑、DNA甲基化、組蛋白乙?；痆27]、mRNA前體的可變剪接[28-29]、蛋白質(zhì)的修飾、蛋白亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)長距離運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)水平的調(diào)控。

圖1 擬南芥生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig. 1 The circadian clock regulatory network in Arabidopsis thaliana

綜上所述，擬南芥Arabidopsis thaliana的生物鐘是由眾多轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，從多個(gè)層次發(fā)揮功能，調(diào)控下游基因的表達(dá)，以確保核心振蕩器產(chǎn)生近24 h的生物節(jié)律。此外，生物鐘蛋白的功能缺失或者過表達(dá)通常會(huì)改變生物鐘的周期或者振幅，甚至導(dǎo)致節(jié)律的紊亂[3]。生物鐘調(diào)控?cái)M南芥全基因組中約30%基因的轉(zhuǎn)錄，是當(dāng)之無愧的植物基因表達(dá)計(jì)時(shí)開關(guān)[30]，從而整合環(huán)境和自生代謝信號(hào)以響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫，從而更好地調(diào)控植物的生長、發(fā)育。

1.3 先天免疫

植物除了通過產(chǎn)生化合物和次生代謝物以抵抗外源病原菌的侵害，也可以在植物葉片表面等部位形成角質(zhì)或蠟質(zhì)層作為物理屏障。植物擁有強(qiáng)大的多層先天免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)其環(huán)境中病原體或食草動(dòng)物的攻擊[31]。首先，植物的表面結(jié)構(gòu)為限制病原體進(jìn)入植物組織內(nèi)部提供了第1道防線。病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)[32]觸發(fā)免疫(PAMP -triggered immunity，PTI)在質(zhì)膜上的模式識(shí)別受體，檢測(cè)到諸如鞭毛蛋白或幾丁質(zhì)等PAMP后被激活[33]。與此同時(shí)，病原體反過來又進(jìn)化出效應(yīng)物，既可以抑制PTI，導(dǎo)致植物觸發(fā)效應(yīng)易感性(Effector-triggered susceptibility，ETS)，又可以從植物宿主中獲取養(yǎng)分。植物抗性(Resistance，R)蛋白直接或間接檢測(cè)這些效應(yīng)物會(huì)激活植物中的第2層先天免疫層，稱為效應(yīng)物觸發(fā)免疫(Effector-triggered immunity，ETI)[4,34-35]，ETI緊系超敏反應(yīng)(Hypersensitivity reaction，HR)，使植物細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[36]，當(dāng)植物某些部位被病原物侵染后，在其他部位也產(chǎn)生抗性，簡(jiǎn)稱系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance，SAR)，使植物的整個(gè)抗性水平得到增強(qiáng)[37]。先天免疫依賴于宿主植物中的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄重編程，它被復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)所激活，該網(wǎng)絡(luò)受到植物激素茉莉酸(Jasmonic acid，JA)和水楊酸(Salicylic acid，SA)及活性氧(Reactive oxygen species ，ROS)等小分子強(qiáng)烈影響[38]。

2 生物鐘調(diào)控植物防御

生物鐘可以防御多種病害的發(fā)生, 生物鐘主要通過調(diào)控相關(guān)抗性基因的表達(dá)、激素的合成與轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧分子和離子穩(wěn)態(tài)以及氣孔的開閉等多種生理生化過程的節(jié)律性，使得植物對(duì)病原體侵害的抵抗能力出現(xiàn)晝夜差異[39]。這種基因表達(dá)的晝夜差異被稱為生物鐘的門控(Gating)效應(yīng)[37]。生物鐘的門控效應(yīng)可以通過幫助植物“預(yù)測(cè)”病原侵害的發(fā)生，使植物提前做出反應(yīng)，從時(shí)間上調(diào)控免疫，從而實(shí)現(xiàn)植物對(duì)有限資源更好的分配[4,10]。相關(guān)示例如圖2所示，不同的生物鐘基因可以參與抵御不同病原菌和害蟲。LHY/CCA1作用于氣孔依賴和非氣孔依賴的防御，并調(diào)控抗性基因的表達(dá)。LUX和TIME FOR COFFEE(TIC)會(huì)影響ROS產(chǎn)生，從而抵抗病原菌。LUX和CCA1 hiking expedition(CHE)介導(dǎo)SA的合成并激活SAR，而TIC負(fù)調(diào)控JA合成，二者通過不同的激素參與抵御病蟲害。tocl1突變株相比于Col-0表現(xiàn)出了對(duì)于丁香假單胞菌Pseudomonas syringae更高的SA誘導(dǎo)的抵抗力。TOC1作用于氣孔開閉、ROS響應(yīng)、以及防御基因的表達(dá)。除以上途徑外，在煙草Nicotiana tabacum中NaTOC1可影響尼古丁的合成[40]，NaLHY/NaCCA1影響葉片揮發(fā)物 (Green leaf volatiles，GLV)的合成，從而抵御煙草天蛾Manduca sexta的入侵[41]。研究表明RVE8在擬南芥中可以調(diào)控類黃酮和花青素的合成[42]，RVE8可能也參與植物防御病蟲害。

圖2 生物鐘以不同方式抵抗生物脅迫示例圖Fig. 2 The diagram of the circadian clock regulating plant resistance to biotic stresses in different ways

2.1 生物鐘影響植物PTI和ETI

生物鐘介導(dǎo)P T I進(jìn)程，主要通過調(diào)控FLAGELLIN SENSING2(FLS2)、Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 4(MKK4)/MKK5、Mitogenactivated protein kinase 3(MPK3)、 MPK6和WRKY22的表達(dá)來完成。核心振蕩器CCA1/LHY可以通過調(diào)控R基因的表達(dá)影響ETI進(jìn)程，從而控制免疫響應(yīng)時(shí)間[43-44]，CCA1可以在不影響植物生長的情況下通過雜種優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)植物防御能力[45]。CCA1/LHY間接調(diào)控PTI進(jìn)程，因?yàn)槠湎掠位騁RP7顯著影響PTI[44,46]。LUX也能影響PTI信號(hào)通路中的MPK3、WRKY22和WRKY33的表達(dá)[47]。目前研究當(dāng)中，只發(fā)現(xiàn)了CCA1/LHY和LUX對(duì)PTI信號(hào)通路的調(diào)控作用，其他核心振蕩器的作用機(jī)制尚未解析。除了PTI以外，生物鐘還調(diào)控ETI，Wang等[43]的一項(xiàng)巧妙的研究表明，生物鐘能調(diào)控包含核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富含亮氨酸重復(fù)序列(Leucine-rich repeat，LRR)結(jié)構(gòu)域的基因，CCA1調(diào)控RPP4基因介導(dǎo)的霜霉病病菌(Hpa)抗性，是由于RPP4的啟動(dòng)子中富集了CCA1結(jié)合基序。這些基因的表達(dá)呈現(xiàn)出近日節(jié)律，而在ccal突變體中發(fā)生了改變。野生型植株對(duì)于感染霜霉病病菌的抗性在清晨比黃昏時(shí)更強(qiáng)，但cca1突變體則失去了這種時(shí)間差異抗性，并在早晨表現(xiàn)出比野生型植株更強(qiáng)的敏感性。而CCA1過表達(dá)使植株對(duì)該菌株的抗性更強(qiáng)。CCA1同源基因LHY在通過RPP4介導(dǎo)的耐抗性中具有類似的作用[43]。此外，cca1和lhy突變體對(duì)能表達(dá)avrRpt2效應(yīng)蛋白的無毒丁香假單胞菌菌株更為敏感，avrRpt2被另一個(gè)NBS-LRR蛋白R(shí)PS2識(shí)別[43]。因此，CCA1(可能還有LHY)可能通過多種R基因介導(dǎo)的途徑調(diào)控ETI。CCA1對(duì)靶基因如RPP4基因、RPP4依賴基因以及其他R基因直接調(diào)控。目前其他生物鐘核心基因調(diào)控ETI還未解析，有待進(jìn)一步研究。

2.2 生物鐘介導(dǎo)水楊酸調(diào)控植物免疫

水楊酸(SA)是植物防御病原菌建立植物系統(tǒng)獲得抗性的關(guān)鍵激素[48]。SA可以通過多種途徑進(jìn)行合成，其中異分支酸合成酶(Isochorismate synthase 1，ICS1)是SA生物合成通路中的關(guān)鍵酶[48]，CHE通過直接結(jié)合ICS1基因的啟動(dòng)子促進(jìn)ICS1的轉(zhuǎn)錄，從而影響SA合成，SA和SA前體可以被蛋白ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 5(EDS5)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步修飾并發(fā)揮作用。其他蛋白，如Accelerated cell death 6 (ACD6)和EDS1，也會(huì)影響SA的積累，但它們的功能尚未完全解析。影響SA合成的主要基因ICS1、EDS1、EDS5和ACD6表達(dá)具有晝夜節(jié)律，使得SA的合成也有近24 h節(jié)律振蕩，其含量在夜間達(dá)到峰值。LUX也能結(jié)合EDS1的啟動(dòng)子，調(diào)控SA合成。NONEXPRESSER OF PR GENES 1 (NPR1)是SA受體，雖然NPR1轉(zhuǎn)錄水平節(jié)律性不強(qiáng)，但NPR1單體積累具有較強(qiáng)生物近日節(jié)律，這與SA的含量密切相關(guān)[49]。這些研究有力地證明了在無病原體脅迫的條件下，生物鐘參與調(diào)控SA的合成和信號(hào)傳導(dǎo)，并且SA可以誘導(dǎo)生物鐘基因TOC1的表達(dá)。CCA1和LHY的突變降低了對(duì)丁香假單胞菌的局部防御能力，但不影響SA的整體生物合成[44]，因此CCA1和LHY可能獨(dú)立于SA發(fā)揮防御調(diào)控作用。che和lux突變體呈現(xiàn)SAR缺失，LUX和CHE通過調(diào)節(jié)SA的合成使植物建立SAR。由于SA在植物先天免疫中起著關(guān)鍵作用，因此要確定在生物脅迫條件下，哪些時(shí)鐘基因?qū)A的合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生重大影響仍然值得探討。

2.3 生物鐘介導(dǎo)茉莉酸調(diào)控植物防御

茉莉酸(JA)是一種脂質(zhì)衍生物的集合，在植物防御中起著關(guān)鍵作用。JA和SA具有拮抗作用，植物通過JA和SA平衡自生的抗性以防御不同病蟲的入侵[50-51]。生物脅迫和損傷會(huì)誘導(dǎo)JA快速合成，其中JA類似物茉莉?；?異亮氨酸(JA-Ile)的活性最強(qiáng)。在JA-Ile缺失的情況下，JA的阻遏物JAZMONATE ZIM-DOMAIN (JAZ)蛋白會(huì)結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子MYC2，從而抑制JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[52-53]。通過JA-Ile結(jié)合受體復(fù)合物CORONATINE INSENSITIVE1 (COI1)和JAZ，從而解除對(duì)MYC2的抑制，并激活JA信號(hào)。

由茉莉酸介導(dǎo)的防御方式受晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)[54]，JA生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)受晝夜節(jié)律的影響。JA信號(hào)通路關(guān)鍵基因COI1、MYC2和JAZ5的表達(dá)依賴于生物鐘基因TIC[54]。TIC與MYC2蛋白互作，并抑制MYC2的積累。JA處理tic突變體，其超敏感性依賴于MYC2，這表明TIC作為負(fù)調(diào)控因子調(diào)節(jié)JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而這種tic突變體也更容易受到丁香假單胞菌感染，這可能是由于增強(qiáng)了JA信號(hào)，并抑制了SA信號(hào)的結(jié)果。LUX直接結(jié)合JAZ5的啟動(dòng)子參與調(diào)控對(duì)JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[47]。但最近有研究發(fā)現(xiàn)，EC復(fù)合體能直接與MYC2的啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制JA介導(dǎo)的擬南芥葉片衰老，表明生物鐘可以直接調(diào)節(jié)MYC2的轉(zhuǎn)錄。

與抵御丁香假單胞菌的防御方式不同，JA及其類似物能激活植物對(duì)食草昆蟲的防御[47]。如粉紋夜蛾Trichoplusia ni等昆蟲在正午時(shí)刻進(jìn)食，植物會(huì)對(duì)此行為預(yù)判，使得JA含量在中午達(dá)到高峰。植物生物鐘與昆蟲進(jìn)食行為不在同一個(gè)相位時(shí)，昆蟲會(huì)啃食更多的植物組織。擬南芥對(duì)灰霉菌Botrytis cinerea的抗性也依賴于時(shí)間，需要核心生物鐘基因和完整的JA信號(hào)的參與[38,55]。灰霉菌入侵?jǐn)M南芥過程中，可根據(jù)入侵時(shí)間激活一系列不同的防御反應(yīng)[56]。植物在受病原菌和昆蟲入侵時(shí)激活定時(shí)防御，并依賴于時(shí)間，激活針對(duì)入侵者的特異性免疫反應(yīng)。生物鐘協(xié)同JA信號(hào)通路在植物抵御食草昆蟲和腐植性真菌病原體方面具有重要意義。

2.4 生物鐘調(diào)控植物體內(nèi)活性氧介導(dǎo)植物免疫

ROS是在光合和呼吸作用中產(chǎn)生的小分子化合物[57]。ROS調(diào)節(jié)細(xì)胞和器官的生長和細(xì)胞間的信息傳遞，對(duì)植物的發(fā)育具有重要作用。ROS的產(chǎn)生也可以在生物和非生物脅迫期間快速和/或大量誘導(dǎo)，這種現(xiàn)象術(shù)語稱為氧化猝發(fā)(Oxidative bursts)[58]。ROS可作為信號(hào)分子，通過交聯(lián)激活防御，強(qiáng)化細(xì)胞壁。高濃度時(shí)，ROS對(duì)宿主細(xì)胞和病原體細(xì)胞均有毒性，會(huì)引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)修飾、核苷酸和細(xì)胞膜損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。活性氧的多功能使得平衡植物細(xì)胞內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài)顯得尤為重要。

生物鐘參與調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生、清除和信號(hào)傳導(dǎo)。活性氧的主要形式H2O2的基礎(chǔ)水平呈現(xiàn)出晝夜節(jié)律模式，并在黎明后7 h達(dá)到峰值。許多光合基因在黎明后4 h表達(dá)量達(dá)到峰值，促使H2O2積累[59]，這說明活性氧是光合作用副產(chǎn)物。生物鐘也控制著ROS相關(guān)基因的表達(dá)[60]。在擬南芥中，與ROS相關(guān)的基因(包括參與ROS產(chǎn)生、清除和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因)39%的表達(dá)具有節(jié)律。這些ROS相關(guān)基因的周期表達(dá)，在很大程度上依賴于CCA1、ELF3、LUX和TOC1。甚至一些非周期表達(dá)的ROS基因也受到這些核心生物鐘元件的調(diào)節(jié)。尤其是CCA1會(huì)與一些富含EE(Evening element)和CBS(CCA1 binding site)基序的ROS基因啟動(dòng)子結(jié)合。cca1和lhy突變會(huì)導(dǎo)致ROS積累，過氧化氫酶活性降低[60]。與CCA1和LHY一樣，TTFLs的其他幾個(gè)組分，包括ELF3、ELF4、LUX、TIC、PRR5、PRR7、PPR9和GIGANTEA(GI)，也能調(diào)控植物對(duì)ROS脅迫的反應(yīng)[60-61]。綜上，多項(xiàng)研究表明生物鐘通過CCA1、LHY和LUX等生物鐘蛋白調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響依賴于活性氧分子的免疫反應(yīng)。此外，其他生物鐘蛋白ELF3、ELF4、TIC、PRR5、PRR7、PPR9和GI也能對(duì)ROS應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生門控效應(yīng)[37]。

最新的研究表明，在缺乏TTFL功能基因的條件下，高度保守的氧化還原蛋白使氧化還原循環(huán)持續(xù)進(jìn)行，因此植物對(duì)氧化還原的感知可能是獨(dú)立生物鐘。在病原體入侵時(shí),生物鐘調(diào)控ROS相關(guān)基因的表達(dá)機(jī)制還未解析。但周期性表達(dá)的ROS相關(guān)蛋白，如過氧化物酶(Peroxidase)，也參與植物防御[62-64]。在PTI、ETI和ETS過程中， 不同時(shí)間ROS的含量在細(xì)胞中分布位置都不相同，這可能是由于ROS合成酶和清除酶活力不同造成的[64]。目前尚不清楚生物鐘是否會(huì)影響應(yīng)激條件下ROS分布模式。仍需要進(jìn)一步的研究來解決這些問題，并深入了解植物-病原體相互作用過程中ROS的晝夜節(jié)律調(diào)控。

3 結(jié)論與展望

生物鐘是調(diào)控植物先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)于多層防御反應(yīng)和廣譜抵抗各種病原體和害蟲至關(guān)重要，是植物通過與病原體和害蟲共同進(jìn)化而獲得的一種適應(yīng)能力，能夠預(yù)測(cè)病原體和害蟲攻擊，激活定時(shí)防御。生物鐘協(xié)調(diào)植物免疫防御病蟲害的研究，我們尚處于初級(jí)階段。生物鐘調(diào)控植物激素的合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧分子的含量以及穩(wěn)態(tài)等多種生理生化過程，使植物抵抗病原菌和昆蟲呈現(xiàn)晝夜差異。植物對(duì)大多數(shù)病原體抵抗能力一般呈現(xiàn)為早晨最強(qiáng)，晚間最弱。

病原菌和昆蟲侵染植物時(shí)間或者方式發(fā)生變化，植物也會(huì)進(jìn)化出防御能力更高的機(jī)制，其中包括植物的生物鐘重設(shè)。病原體的分子模式和效應(yīng)蛋白以及植物的抗病激素和活性氧分子既是激活免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵因子，也在調(diào)控植物生物鐘方面起重要作用。研究生物鐘與植物抗蟲性的關(guān)系，有利于平衡作物的產(chǎn)量和植物的免疫力，從而尋求更好的作物植株。通過對(duì)模式植物擬南芥中生物鐘對(duì)植物抗蟲性影響的研究，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)關(guān)鍵蛋白及其作用的分子機(jī)制。未來將會(huì)有更多研究聚焦作物生物鐘與植物抗蟲性的關(guān)系，挖掘新的關(guān)鍵蛋白及其作用機(jī)理，深入理解生物鐘對(duì)于植物抗蟲性的生物學(xué)意義等重要的科學(xué)問題，并將其應(yīng)用于提高重要經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量和植物防御中。

目前我們對(duì)于植物生物鐘與植物免疫關(guān)系的研究有了一定的了解，但仍有許多問題并未解決，今后的研究可以關(guān)注以下方面：

1)是否有更多的生物鐘蛋白參與調(diào)控了植物免疫？雖然擬南芥生物鐘主要的蛋白已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但仍然可能有新的生物鐘蛋白未被解析，這些潛在的生物鐘新成員可能與植物的抗蟲性有關(guān)；

2)其他的免疫信號(hào)對(duì)生物鐘是否具有調(diào)控作用? 雖然已經(jīng)明確病原體的分子模式和效應(yīng)蛋白會(huì)影響植物的生物鐘，但具體的分子機(jī)制尚未明確。除了免疫激素和活性氧分子，是否還有其他的信號(hào)也能調(diào)控植物的生物鐘?

3)病原體的生物鐘是否在病原體和植物互作的過程中發(fā)揮作用? 盡管人們對(duì)宿主生物了解很多，特別是在模式植物擬南芥中，但對(duì)病原體和害蟲生物鐘的研究卻相對(duì)落后。已有研究表明，灰霉病菌的生物鐘蛋白Botrytis cinereaFREQUENCY 1(BcFRQ1)可以調(diào)控灰霉病菌對(duì)于擬南芥的致病性。對(duì)于更高等的線蟲、昆蟲等病原生物的生物鐘研究將有助于從病原體角度深入了解生物鐘與植物免疫的互作關(guān)系；

4)病原體調(diào)控植物生物鐘的意義是什么? 是有利于病原體的定殖還是有助于植物平衡免疫與生長的關(guān)系?有學(xué)者提出宿主與病原體共同進(jìn)化的想法，即病原體、害蟲及其宿主的生物鐘協(xié)調(diào)可以塑造有機(jī)體水平的相互作用，但缺乏具體的試驗(yàn)支撐，有待后續(xù)進(jìn)一步研究；

5)目前的研究主要聚焦植物葉片生物鐘與葉際病原體的互作關(guān)系。植物根部生物鐘與根際病原體之間是否存在相互作用? 已有研究表明，煙草根部吸收氮元素轉(zhuǎn)化成尼古丁調(diào)控?zé)煵莸目瓜x反應(yīng)；

6)大多數(shù)關(guān)于植物生物鐘的研究主要以模式植物擬南芥為研究對(duì)象，因此對(duì)于作物中生物鐘與植物抗蟲性的研究比較有限，還需后期進(jìn)一步研究；

7)生物鐘對(duì)于植物抗蟲性的調(diào)節(jié)作用如何應(yīng)用在實(shí)際的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，以提高農(nóng)作物產(chǎn)量和對(duì)害蟲的抵御能力。