不同來源ATP表征冷鮮羊肉新鮮度

蘇媛媛，張德權，古明輝，張春娟,2，李少博，鄭曉春，陳麗

不同來源ATP表征冷鮮羊肉新鮮度

1中國農業(yè)科學院農產品加工研究所/農業(yè)農村部農產品質量安全收貯運管控重點實驗室，北京 100193；2寧夏大學食品與葡萄酒學院，銀川 750021

【目的】通過系統(tǒng)研究冷鮮羊肉不同來源的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP。包括肉中ATP、微生物ATP、肉表面ATP）在貯藏期間的變化規(guī)律，篩選能夠表征冷鮮羊肉新鮮度變化的ATP指標，構建菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮預測模型，探究冷鮮羊肉新鮮度的預測新方法?！痉椒ā恳孕∥埠虮匙铋L肌為試驗材料，在空氣密封包裝0℃條件下分別貯藏0、1、3、5、7、9、11、13、15、17和21 d，分析冷鮮羊肉貯藏期間新鮮度指標（pH、色澤、揮發(fā)性鹽基氮、菌落總數(shù)）與3種來源ATP（肉中ATP、微生物ATP、肉表面ATP）的變化，利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計評價不同來源ATP的變化規(guī)律，并構建新鮮度指標的預測模型?！窘Y果】冷鮮羊肉貯藏期間新鮮度指標菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮均呈現(xiàn)上升趨勢，并均在貯藏17 d時超過國家標準限值；肉中ATP呈現(xiàn)不斷下降趨勢，微生物ATP與肉表面ATP均呈現(xiàn)上升趨勢，與新鮮度指標變化趨勢保持一致；冷鮮羊肉貯藏期間，肉中ATP、微生物ATP、肉表面ATP含量與菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮的相關系數(shù)（）分別為-0.399、0.910、0.943和-0.357、0.725、0.907。肉表面ATP預測冷鮮羊肉菌落總數(shù)的最優(yōu)模型為Boltzmann擬合模型，其公式為TVC（lg cfu/g）=7.649-4.069/(1+exp(x-5.807)/0.632)（2=0.903，＜0.001），肉表面ATP預測冷鮮羊肉揮發(fā)性鹽基氮的最優(yōu)模型為Expedc1擬合模型，其公式為TVB-N（mg/100 g）=2.493*exp(x/3.745)+3.057（2=0.888，＜0.001）?！窘Y論】本研究明確了冷鮮羊肉表面ATP與菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮存在顯著正相關性，確證了肉表面ATP可以作為冷鮮羊肉新鮮度表征指標；并構建了菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮最優(yōu)預測模型，為冷鮮羊肉新鮮度快速檢測提供了新的思路。

冷鮮羊肉；肉表面ATP；預測模型；新鮮度

0 引言

【研究意義】我國是肉類生產與消費大國，據(jù)國家統(tǒng)計局公布數(shù)據(jù)顯示，2021年全國鮮、冷藏肉產量累計值高達3 298萬 t，比2020年同比增長了24.5%[1]，說明肉類產業(yè)正在不斷地蓬勃發(fā)展，但冷鮮肉高蛋白質、高水分含量的特性導致其在流通貯藏過程中極易受到微生物侵染而腐敗變質，產生食品安全和食品資源浪費等問題。新鮮度是評價冷鮮肉品質的重要指標，直接影響產品的貨架期，但傳統(tǒng)檢測方法，如平板計數(shù)法、感官檢測法等操作繁瑣、耗時長、易受主觀因素影響[2]，因此，研發(fā)肉品新鮮度快速檢測方法十分必要?！厩叭搜芯窟M展】三磷酸腺苷（ATP）是存在于各種微生物中的主要生物能源物質，含量相對穩(wěn)定，能夠反映活體微生物的數(shù)量[3]。ATP生物發(fā)光法是指在熒光素酶的催化下，細菌細胞內釋放的ATP與熒光素反應產生生物熒光，進一步通過熒光檢測儀等實時監(jiān)測生物發(fā)光強度。ATP生物發(fā)光法由于檢測快速、成本低、耗時短、操作簡單等優(yōu)點[4-8]而日益得到應用，比如檢測桌面清潔度、醫(yī)療器械清潔度、飲用水衛(wèi)生等[4,9-10]。Bautista[11]早在1999年就提出ATP生物熒光法在牛、豬、禽類熟食品檢測方面的應用，指出菌落總數(shù)與微生物ATP熒光值之間相關系數(shù)在0.800—0.950。舒柏華等[12]利用線性模型構建冷鮮肉微生物ATP熒光對數(shù)值與菌落總數(shù)的相關性，得出其相關系數(shù)為0.980。RATPHITAGSANTI等[13]利用ATP熒光技術檢測芽孢桿菌系統(tǒng)建立的菌落總數(shù)的預測模型相關系數(shù)均約0.900。WADHAWAN等[14]研究水凝膠珠中大腸桿菌ATP發(fā)光對數(shù)值與單一菌種數(shù)，得出其線性相關系數(shù)為0.940—0.960。李海月[15]通過在豬肉表面接種腸致病性大腸埃氏桿菌，建立ATP發(fā)光強度與菌落濃度的關系，其線性相關系數(shù)為0.950。DA BAUTISTA等[16]利用ATP生物熒光法檢測禽類胴體表面清潔度，通過回歸分析得出表面ATP發(fā)光強度對數(shù)值與菌落總數(shù)相關系數(shù)為0.670。OTO等[17]通過熒光光譜檢測豬肉表面清潔度，利用偏最小二乘回歸法建立豬肉表面ATP含量與菌落總數(shù)之間的模型，其效果良好（2=0.940—0.970）。以上研究均證明ATP與菌落總數(shù)之間存在顯著正相關性，從而在一定程度上可實現(xiàn)對肉品新鮮度的檢測。但是，食品的復雜體系在很大程度上限制了ATP生物熒光法在食品新鮮度檢測方面的應用，尤其是對于冷鮮肉新鮮度的檢測?！颈狙芯壳腥朦c】冷鮮肉體系復雜，冷鮮肉中ATP根據(jù)取樣手段，可分為肉中ATP、微生物ATP和肉表面ATP。其中，肉中ATP為冷鮮肉中總ATP含量；微生物ATP僅包含冷鮮肉中微生物的ATP含量；肉表面ATP是通過涂抹拭子取樣獲得的，包括微生物ATP和部分體細胞ATP，上述3種ATP含量在冷鮮肉貯藏期間的變化及其與新鮮度之間的關系缺乏系統(tǒng)報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬系統(tǒng)通過探究冷鮮羊肉不同來源ATP在貯藏期間的變化規(guī)律，篩選能夠表征冷鮮羊肉新鮮度變化的ATP，構建菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮預測模型，為冷鮮羊肉新鮮度的檢測方法提供新思路。

1 材料與方法

試驗于2021年9月至2022年1月在中國農業(yè)科學院農產品加工研究所實驗室進行。

1.1 材料與主要試劑

羊肉來源：北京二商穆香源清真肉類食品有限公司選取胴體重、飼養(yǎng)條件相近、性別相同、健康無病的小尾寒羊共6只，屠宰后4℃冷卻成熟24 h后，從胴體上取下兩側背最長肌，3 h內運回實驗室待用。

主要試劑：三磷酸雙磷酸酶（上海源葉生物科技有限公司）、ATP二鈉、Trixon-100（北京長峰科遠科技發(fā)展有限公司）、輕質氧化鎂（北京普益華科技有限公司）、平板計數(shù)瓊脂（北京陸橋技術股份有限公司）、BacTiter-Glo? Microbial Cell Viability Assay（北京照生萊博商貿有限公司）、ATP含量檢測試劑盒（北京高教研科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

Testo 205便攜式pH計（德國德圖公司），無菌采樣拭子/棉簽試管（北京大宏利輝生物科技中心），SpectraMax190全波長酶標儀（美國Molecular Devices公司），CM-600D色差計（柯尼卡-美能達辦公系統(tǒng)（中國）有限公司），JYH-66恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司），垂直單向流潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），SQ810C 高壓蒸汽滅菌器（上海雅馬拓科技貿易有限公司），KJELTEC 2300全自動凱氏定氮儀（丹麥FOSS集團有限公司），DHP-600恒溫恒濕培養(yǎng)箱（天津市中環(huán)實驗電爐有限公司）。

1.3 試驗設計

取雙側背最長肌，均勻分割，約200 g/塊。每條背最長肌分割為6塊，共計制得6×2×6=72個樣品，每個樣品分裝并使用PP5聚丙烯塑料盒進行空氣密封包裝（包裝盒規(guī)格23 cm×13 cm×4 cm，包裝膜厚度100 μm，透氧性＜2 cm3?m-2·d-1，透濕性＜5 g?m-2·d-1，大約400 mL氣體空間）后，于（0±0.5）℃條件下貯藏0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21 d；處理當天開始，每個測量時間點隨機取出6個樣品進行試驗，測定其色澤、菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮等新鮮度指標及肉中ATP含量、微生物ATP含量、肉表面ATP含量的變化情況。

1.4 新鮮度指標測定

1.4.1 pH 參考Szerman等[18]的方法，用便攜式pH計進行pH測定，pH計探頭插入肉塊深度約為2 cm，選取3個不同位置進行測定，結果取平均值。

1.4.2 色澤 參考LI等[19]的方法，用色差計對肉色指標進行測定。在每個樣品表面隨機選擇4個位點進行測定，結果取平均值。L*值表示肌肉的亮度，a*值表示肌肉的紅度值，b*表示肌肉的黃度值。

1.4.3 菌落總數(shù)（TVC） 菌落總數(shù)的檢測采用《GB4789.2—2016 食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》中規(guī)定的方法進行測定。

1.4.4 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N） 揮發(fā)性鹽基氮的檢測采用國標《GB5009.228—2016食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中規(guī)定的自動凱氏定氮法進行測定。

1.5 冷鮮羊肉ATP含量

1.5.1 冷鮮羊肉中ATP含量 稱取0.100 g肉樣，加入1.500 mL ATP提取液，冰上勻漿后，4℃、8 000×離心10 min后，取上清液1 mL加入500 μL三氯甲烷，混勻，4℃、1 000×離心3 min后，取上清液待測。在340 nm處測定吸光度值A1，然后將測試樣品放入37℃恒溫培養(yǎng)箱3 min后，在340 nm處測定吸光度值A2。根據(jù)公式計算肉中ATP含量，公式如下：肉中ATP含量（μmol?g-1）=（A2-A1）/（（A2標準管-A1標準管）/C標準）×V/W，式中，ATP標準液為5 mg ATP加入0.826 mL ATP提取液得到，V表示加入的ATP提取液體積（mL），W表示肉樣質量（g）。

1.5.2 微生物ATP含量 首先建立標準曲線，超純水溶解ATP二鈉配置成10-2mol?L-1的標準溶液，再分別稀釋成10-6—10-12mol/L濃度的ATP工作液。依次取上述不同濃度ATP工作液100 μL加入酶標板內，加入等體積BacTiter-GloTM檢測液，混勻后即刻檢測。其次進行樣本處理：

（1）體細胞ATP清除：取測定菌落總數(shù)的勻漿液1 mL，加入0.200%的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX- 100）和0.100%的三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）混合液1 mL，在室溫下孵育10 min。然后置于沸水浴中1 min以滅活apyrase。

（2）ATP檢測：將上述處理后的檢樣放置至室溫，離心（3 000×，5 min），取100 μL上清液加入酶標板中，加入等體積BacTiter-GloTM檢測液，混勻后即可檢測。用無菌生理鹽水作空白對照，按標準曲線法計算ATP含量。

1.5.3 肉表面ATP含量 取冷鮮羊背最長肌200 g，使用6只無菌涂抹拭子在肉塊表面選定好的6個區(qū)域（5 cm2）按照圓形模板涂抹20 s左右，混裝入無菌袋，加入90 mL生理鹽水制成原液。均質拍打處理后，取100 μL上清液利用BacTiter-GloTM微生物細胞活性檢測試劑盒進行肉表面ATP的測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)使用Excel 2013軟件整理，采用XLSTAT插件對TVC、TVB-N、冷鮮羊肉不同來源ATP進行畫圖趨勢分析；采用IBM SPSS 21.0軟件中Duncan’s多重檢驗進行顯著性分析，結果以“平均值±標準差”表示；采用IBM SPSS 21.0軟件中的Pearson相關性分析冷鮮羊肉不同來源ATP與TVC、TVB-N的相關性；采用Origin 2019對TVC、TVB-N以及不同來源ATP數(shù)據(jù)進行數(shù)學模型擬合，建立預測模型。

2 結果

2.1 冷鮮羊肉貯藏期間新鮮度指標變化趨勢

2.1.1 冷鮮羊肉貯藏期間色澤和pH的變化 肉色和pH均可在一定程度上表征肉品新鮮度。隨貯藏時間延長，L*值、a*值、b*值均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。L*值與肉樣表面自由水的多少有關系，貯藏前期，肉表面滲水使肉樣對光的反射能力增強，L*值增大。L*值最高點出現(xiàn)在貯藏15 d，其值為45.55。生鮮羊肉在貯藏15 d后，L*值呈現(xiàn)下降趨勢。在貯藏初期，氧合肌紅蛋白的含量增加，使肉樣呈現(xiàn)鮮紅色，隨貯藏時間延長，a*值不斷升高，在貯藏第7天時，a*值出現(xiàn)峰值，其值為14.53。在貯藏后期，a*值呈現(xiàn)下降趨勢。b*值和氧合肌紅蛋白與肌紅蛋白的相對比值有關，比值越大，b*值越大[20]。貯藏前期，冷鮮羊肉與氧氣結合，肌紅蛋白被氧化生成氧合肌紅蛋白，b*值不斷升高，其最高點出現(xiàn)在貯藏15 d，b*值為13.71。貯藏后期，肉色劣變，b*值呈現(xiàn)下降趨勢并在后期趨于穩(wěn)定。

冷鮮羊肉pH隨著貯藏時間的延長，整體先上升后趨于穩(wěn)定。冷鮮羊肉在貯藏0—11 d，pH逐漸上升，貯藏11 d時pH顯著升高（＜0.05）。貯藏11 d后，羊肉pH出現(xiàn)波動，但整體趨于平穩(wěn)，在21 d時，羊肉pH為6.02（表1）。

表1 冷鮮羊肉貯藏期間色澤和pH的變化

不同小寫字母表示不同貯藏時間差異顯著（＜0.05）

Different lowercase letters indicate significant difference at different storage time (＜0.05)

2.1.2 冷鮮羊肉貯藏期間TVB-N和TVC的變化 冷鮮羊肉TVB-N在貯藏期間整體呈上升趨勢（圖1）。在貯藏15 d內TVB-N呈緩慢上升趨勢（＞0.05），貯藏17 d后上升趨勢顯著。TVB-N在貯藏17 d時為15.170 mg/100 g，超過國家標準《GB2707—2016食品安全國家標準鮮（凍）畜、禽產品》中規(guī)定的限值15 mg/100 g，冷鮮羊肉已不能食用。冷鮮羊肉貯藏期間TVC的結果如圖2所示，冷鮮羊肉TVC隨貯藏時間延長顯著上升，由初始菌落總數(shù)3.180 lg CFU/g上升至貯藏21 d的7.100 lg CFU/g。冷鮮羊肉貯藏17 d時TVC為6.160 lg CFU/g，已經超過6 lg CFU/g，這與羊肉貯藏過程中TVB-N的變化情況相符。

2.2 冷鮮羊肉貯藏期間不同來源ATP含量變化

2.2.1 ATP含量變化 冷鮮羊肉貯藏期間肉中ATP濃度的變化結果如圖3所示，隨貯藏時間延長，冷鮮羊肉中ATP含量在貯藏3 d后顯著下降（＜0.05），貯藏5—21 d冷鮮羊肉ATP含量差異不顯著（＞0.05），以較低水平保持平穩(wěn)。

不同小寫字母表示不同貯藏時間差異顯著（P＜0.05）。下同

圖2 冷鮮羊肉貯藏期間菌落總數(shù)變化

圖3 冷鮮羊肉貯藏期間肉中ATP含量變化

2.2.2 冷鮮羊肉貯藏期間微生物ATP和肉表面ATP含量變化 制備ATP系列濃度分別為1011、1010、109、108、107、106、105、104和103fmol/L的標準工作液并測定其發(fā)光強度，以ATP濃度的對數(shù)值lg（ATP）為橫坐標，以相應發(fā)光強度的對數(shù)值lg（RLU）為縱坐標，所得標準曲線見圖4，標準曲線方程為=0.389+2.542（2=0.995）。

隨著貯藏時間延長，微生物ATP含量和肉表面ATP含量均呈上升趨勢（＜0.05）；貯藏0 d時微生物ATP含量為10-1.260fmol/L，肉表面ATP含量為102.750fmol/cm2。微生物ATP在貯藏15 d時顯著上升，含量為103.340fmol/L。肉表面ATP在貯藏17 d時顯著上升，含量為106.425fmol/L。貯藏21 d時微生物ATP含量與肉表面ATP含量均達到最大值，分別為103.990fmol/L和107.014fmol/cm2（圖5、圖6）。

圖4 ATP標準曲線

圖5 冷鮮羊肉貯藏期間微生物ATP含量變化

圖6 冷鮮羊肉貯藏期間肉表面ATP含量變化

2.3 冷鮮羊肉不同來源ATP與TVC、TVB-N的關系

為分析冷鮮羊肉不同來源ATP與新鮮度指標的相關性，采用皮爾遜相關分析，得出冷鮮羊肉中ATP、微生物ATP、肉表面ATP含量分別和TVC、TVB-N的相關系數(shù)（）（表2）。TVC與TVB-N之間的相關系數(shù)為0.965，這也表明二者之間存在強相關性，證明冷鮮羊肉貯藏過程中微生物數(shù)量與TVB-N之間存在密切聯(lián)系。微生物ATP和肉表面ATP含量與TVC相關性較強，相關系數(shù)分別為0.910和0.943，說明冷鮮羊肉ATP和肉表面ATP含量可以在一定程度上反映TVC值。微生物ATP和肉表面ATP含量與TVB-N也存在較強的相關性，相關系數(shù)分別為0.725和0.907，說明微生物ATP和肉表面ATP含量在一定程度上反映TVB-N的含量。通過比較微生物ATP、肉表面ATP分別與TVC、TVB-N的相關系數(shù)，得出肉表面ATP與二者之間相關系數(shù)更高，均達到0.900以上。綜上，冷鮮羊肉表面ATP含量與新鮮度各指標密切相關，具有用于表征羊肉新鮮度的潛力，但其表征規(guī)律及預測模型有待進一步確證。

2.4 冷鮮羊肉TVC預測模型構建

為進一步探究冷鮮羊肉表面ATP預測羊肉TVC的規(guī)律，建立利用冷鮮羊肉表面ATP含量預測冷鮮羊肉TVC的數(shù)學模型。根據(jù)冷鮮羊肉表面ATP與TVC的變化散點圖分布特征可知，二者之間的關系呈現(xiàn)S形上升趨勢，因此本研究嘗試使用Origin中專門的S型擬合工具（Sigmoidal）將冷鮮羊肉表面ATP含量與TVC的共72組數(shù)據(jù)進行擬合[21]，同時以線性方程為參照，擬合結果如表3所示，其中利用S型擬合方程預測TVC的精度均大于線性方程。

表2 相關性分析

-表示呈負相關，**表示在0.01水平（雙側）上顯著相關

- indicates a negative correlation, ** indicates a significant correlation at the 0.01 level (two sides)

表3 模型擬合

根據(jù)不同擬合模型2值的比較，利用Boltzmann構建的肉表面ATP含量與TVC的預測模型較好，對得到的肉表面ATP含量與TVC數(shù)據(jù)進行擬合，結果如圖7-a所示，擬合方程為：

=7.649-4.069/(1+exp(-5.807)/0.632)（2=0.903）

式中，為冷鮮羊肉TVC（CFU/g）的對數(shù)值；為冷鮮羊肉表面ATP含量（mol?cm-2），數(shù)學模型線性良好。

Boltzmann模型參數(shù)物理意義表示如下[21]：A1表示曲線下平臺的數(shù)值，A2表示曲線上平臺的數(shù)值，x0表示（A1+A2）/2時對應橫坐標的值。結合表面ATP含量與TVC變化趨勢，得出利用Boltzmann數(shù)學模型預測TVC時，其中A2可用來表示檢測TVC最大值，A1表示檢測TVC最小值，0表示檢測TVC最大值和最小值平均值的一半時，對應的肉表面ATP含量。

為了驗證模型的預測效果，比較TVC實測值與預測值之間的關系，將其線性關系繪制如圖7-b，二者呈現(xiàn)較好的線性關系（=0.943）。本研究條件下，冷鮮羊肉貯藏到17 d時，羊肉表面ATP含量為105.980fmol/cm2，代入建立的預測模型，得出TVC為6.250 lg cfu/g，真實值為6.160 lg cfu/g，二者數(shù)值接近，證明數(shù)學模型較為可靠。

圖a表示冷鮮羊肉表面ATP預測TVC的Boltzmann擬合模型，圖b表示擬合模型中TVC實測值與預測值之間的線性關系

2.5 冷鮮羊肉TVB-N預測模型構建

為進一步探究冷鮮羊肉表面ATP預測羊肉TVB-N的規(guī)律，利用冷鮮羊肉表面ATP含量構建了預測TVB-N的數(shù)學模型，根據(jù)冷鮮羊肉表面ATP與TVB-N的變化散點圖分布特征可知，二者之間的關系呈現(xiàn)指數(shù)型上升趨勢。因此，本研究嘗試使用Origin中的指數(shù)型（Exponential）模型對冷鮮羊肉表面ATP含量與TVB-N之間共72組數(shù)據(jù)進行擬合，以線性方程為參照，擬合結果如表4所示，其中利用指數(shù)型擬合方程預測TVB-N的精度均大于線性方程。

根據(jù)不同擬合模型2值的比較，發(fā)現(xiàn)利用ExpDec1構建的肉表面ATP含量與TVB-N的預測模型較好，對得到的肉表面ATP含量與TVB-N進行擬合，結果如圖8-a所示，擬合方程為：

表4 模型擬合

圖a表示冷鮮羊肉表面ATP預測TVB-N的Expdec 1擬合模型，圖b表示擬合模型中TVB-N實測值與預測值之間的線性關系

=2.493*exp(/3.745)+3.057（2=0.888）

式中，為冷鮮羊肉TVB-N（mg/100 g）；為冷鮮羊肉表面ATP含量（mol?cm-2），數(shù)學模型良好。

羊肉TVB-N實測值與預測值之間的相關關系如圖8-b所示，其相關系數(shù)為0.942，二者顯著相關，證明預測模型可靠。本研究中，冷鮮羊肉貯藏到17 d時，此時羊肉表面ATP含量為105.980fmol/cm2，代入建立的預測模型，得出TVB-N為15.030 mg/100 g，真實值為15.170 mg/100 g，二者數(shù)值相近，再次證明數(shù)學模型較為可靠。

3 討論

目前，冷鮮羊肉新鮮度檢測手段存在操作繁瑣、耗時長、成本高等問題[22-23]，亟需探尋冷鮮羊肉新鮮度的快速檢測方法。

3.1 冷鮮羊肉貯藏期間新鮮度變化

貯藏前期，冷鮮羊肉表面滲水增加使肉樣對光的反射能力增強，且包裝盒中氧氣充足，肌紅蛋白與氧氣結合生成氧合肌紅蛋白，肉色呈現(xiàn)鮮紅色。在冷鮮羊肉貯藏過程中，微生物數(shù)量不斷上升，蛋白質在微生物、酶等的作用下，產生氨（NH3）、胺類（R-NH2）等含氮的堿性有毒物質，它們以TVB-N的形式存在于肉中，隨著貯藏時間的延長，胺類等代謝物積累導致冷鮮羊肉的TVB-N在貯藏過程中顯著上升[24]，貯藏后期pH也隨之不斷上升，此時不利于氧合肌紅蛋白的生成，肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白含量持續(xù)下降，并且高鐵肌紅蛋白含量不斷積累，冷鮮羊肉變成暗紅色，此外，細菌的大量繁殖也會促進高鐵肌紅蛋白的形成，所以在貯藏后期羊肉鮮紅色變淺，色澤劣變[25]。本研究中樣品貯藏17 d時，冷鮮羊肉TVB-N和TVC超過國家標準規(guī)定的限值，可推測0℃貯藏條件下，冷鮮羊肉貯藏期可達17 d。

3.2 冷鮮羊肉貯藏期間不同來源ATP變化規(guī)律

在冷鮮羊肉貯藏期間，無氧糖酵解可以產生少量ATP，但是肌肉收縮、離子運輸、蛋白降解等一些途徑都會消耗ATP[26-28]，所以隨著貯藏時間的延長，ATP含量整體呈逐漸下降的趨勢。任馳[29]研究表明冷鮮羊肉在4℃貯藏條件下，冷鮮羊肉ATP含量在0—1 d急速下降，在貯藏后期1—5 d保持平穩(wěn)狀態(tài)，但在溫度更低的貯藏條件下，冷鮮羊肉中ATP降解內源酶的作用被抑制，延緩了ATP的降解速度，這與本研究ATP整體呈現(xiàn)下降的趨勢一致。本研究的0℃貯藏條件下，冷鮮羊肉中ATP含量消耗速度更為緩慢，具體表現(xiàn)為在貯藏后期5—21 d，ATP含量呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，這也與YOSHIHIRO等[30]得出的結果相一致。

隨著冷鮮羊肉貯藏時間的延長，微生物數(shù)量不斷上升，因此冷鮮羊肉微生物ATP在貯藏期間也呈現(xiàn)顯著上升趨勢，這與LIU等[31]的研究結果一致。而冷鮮羊肉表面ATP是通過涂抹法從冷鮮羊肉表面得到的ATP，是評估冷鮮羊肉表面清潔度的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn)冷鮮羊肉表面ATP含量隨著貯藏時間的延長也呈現(xiàn)不斷上升趨勢，這與OSHITA等[32]的研究結果一致，但二者之間在進行比較時，發(fā)現(xiàn)貯藏開始時肉表面ATP初始含量值較高，而隨著貯藏時間的延長，肉表面ATP含量與微生物ATP含量差距縮小，可能是由于通過涂抹法取樣得到的肉表面ATP包含部分體細胞ATP，但貯藏后期體細胞ATP含量顯著下降，肉表面ATP含量大部分由微生物ATP構成。從研究結果發(fā)現(xiàn)微生物ATP和肉表面ATP與TVC、TVB-N呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律，且相關性良好，具有表征冷鮮羊肉新鮮度的潛力。

3.3 冷鮮羊肉不同來源ATP預測羊肉新鮮度指標

近些年來有研究表明，肉表面ATP有表征肉品新鮮度的潛力。BAUTISTA等[16]利用ATP生物熒光法檢測禽類胴體表面清潔度，通過回歸分析得出表面ATP發(fā)光強度對數(shù)值與TVC相關系數(shù)為0.670。OTO等[17]通過熒光光譜檢測豬肉表面清潔度，構建的豬肉表面ATP含量與TVC之間的模型，其效果良好（2=0.940—0.970）。而本研究通過分析冷鮮羊肉中ATP、微生物ATP和肉表面ATP與TVC、TVB-N之間的相關系數(shù)，表明微生物ATP與羊肉表面ATP均可在一定程度上表征羊肉新鮮度，也可得出冷鮮羊肉表面ATP含量與TVC、TVB-N之間存在更強的相關性，且肉表面ATP含量的前處理手段要明顯優(yōu)于檢測微生物ATP含量，本研究也充分印證羊肉表面ATP與羊肉新鮮度存在明顯的關聯(lián)性，但具體相關關系如何有待于進一步明確。

構建肉表面ATP與新鮮度指標的表征方程是利用肉表面ATP表征新鮮度的必要條件。HIROAKI SHIRAI等[33]利用激發(fā)發(fā)射矩陣光譜學檢測豬肉表面清潔度，利用偏最小二乘回歸法建立了豬肉表面ATP含量與TVC之間的模型（2=0.840）。OTO等[34]利用熒光光度計檢測豬肉的100 mL棉簽樣本觀察到ATP含量與TVC之間的線性關系良好（2=0.960）。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在整個貯藏過程中，肉表面ATP含量與菌落總數(shù)并不呈現(xiàn)標準的線性關系，從散點圖觀察，二者可能呈現(xiàn)指數(shù)關系。因此，本研究分別構建了肉表面ATP含量與菌落總數(shù)變化之間的3種“S型”模型，結果發(fā)現(xiàn)利用Boltzmann模型擬合效果最好，TVC實測值與模型預測值相關系數(shù)高達0.943，表明模型較為可靠，可應用于未知樣品的檢測，同時也發(fā)現(xiàn)肉表面ATP在104—108fmol/cm2范圍內與TVC呈線性關系，而整個TVC預測模型并不呈現(xiàn)普遍的線性趨勢，可能原因是冷鮮羊肉貯藏前期，羊肉體細胞ATP含量較多，表面ATP中包含大部分的體細胞ATP；而在貯藏后期，冷鮮羊肉體細胞ATP被消耗，表面ATP含量中更多來自于活體微生物，這也與本研究中貯藏后期羊肉微生物ATP與肉表面ATP之間含量的差距縮小得出的結論保持一致。

另一方面，本研究利用肉表面ATP構建了TVB-N的指數(shù)型ExpDec1預測模型，發(fā)現(xiàn)TVB-N實測值與預測值相關系數(shù)高達0.943，模型較為可靠。而以肉表面ATP含量為紐帶，結合預測TVC的Boltzmann模型和TVB-N的ExpDec1交叉推導發(fā)現(xiàn)，當TVC值為6時，代入TVC預測方程得出肉表面ATP含量為106.040fmol/cm2，將此肉表面ATP含量代入TVB-N的預測模型中，得出TVB-N的含量為15.560 mg/100 g，超過國家標準。說明利用羊肉表面ATP建立的TVC與TVB-N的預測模型對于冷鮮肉是否腐敗的預測判定結果一致，表明羊肉表面ATP可以應用于未知樣品的新鮮度預測。

4 結論

冷鮮羊肉貯藏過程中，肉中ATP含量呈現(xiàn)下降趨勢，微生物ATP含量、表面ATP含量均呈現(xiàn)上升趨勢。冷鮮羊肉貯藏期間，肉中ATP、微生物ATP、肉表面ATP含量與TVC和TVB-N的相關系數(shù)（）分別為-0.399、0.910、0.943和-0.357、0.725、0.907，因此，冷鮮羊肉表面ATP可作為表征冷鮮羊肉新鮮度的重要因子。

利用肉表面ATP預測冷鮮羊肉TVC的最優(yōu)模型為TVC（lg cfu/g）=7.649-4.069/(1+exp(-5.807)/0.632)；利用肉表面ATP預測冷鮮羊肉TVB-N的最優(yōu)模型為TVB-N（mg/100 g）=2.493*exp(/3.745)+3.057。系統(tǒng)證實了利用冷鮮羊肉表面ATP可以實現(xiàn)冷鮮羊肉新鮮度的快速預測。

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Characterization of Chilled Mutton by ATP from Different Sources

1Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100193;2School of Food and Wine, Ningxia University, Yinchuan 750021

【Objective】In order to explore a new method for predicting the freshness of chilled mutton, the changes of adenosine triphosphate (ATP in meat, microbial ATP and ATP of meat surface) from different sources during storage were systematically studied, then the ATP that could characterize the change of chilled mutton was screened, and finally the prediction models for the total viable counts and volatile base nitrogen were established. 【Method】The longissimus dorsi muscle of Small Tailed Han sheep was stored in air sealed packaging at 0℃for 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 21 days, respectively. The freshness indexes (pH, color, volatile base nitrogen, and total viable counts) and ATP from three sources (ATP in meat, microbial ATP, and ATP of meat surface) of chilled mutton were analyzed during storage. The changes of ATP from different sources were evaluated, and the predictive models of freshness indicators were built. 【Result】The freshness index of total viable counts and volatile base nitrogen in chilled mutton showed an upward trend during storage, and both of them exceeded the national standard limit after 17 days; the ATP in meat showed a decreasing trend, while the microbial ATP and the ATP of meat surface were increased, which was consistent with the change trend of the freshness index; the correlation coefficients () between ATP in meat, microbial ATP, ATP of meat surface and total viable counts, total volatile base nitrogen were -0.399, 0.910, 0.943 and -0.357, 0.725, 0.907, respectively. The optimal model for predicting the total viable counts in chilled mutton by ATP of meat surface was Boltzmann, which the formula was TVC (lg cfu/g)=7.649-4.069/(1+exp(x-5.807)/0.632), (2=0.903,＜0.001); the optimal model for predicting total volatile base nitrogen in chilled mutton by ATP of meat surface was Expedc1, which the formula was TVB-N (mg/100 g)=2.493*exp(x/3.745)+ 3.057 (2=0.888,＜0.001). 【Conclusion】The results showed that the ATP of meat surface of chilled mutton had the significant positive correlations with the total viable counts and volatile basic nitrogen, and then confirmed that the ATP of meat surface could be used as an indicator to characterize the freshness of chilled mutton. The optimal prediction model of the total viable counts and volatile base nitrogen could provide a new idea for rapid detection of chilled mutton freshness.

chilled mutton; ATP of meat surface; prediction model; freshness

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.19.013

2022-02-24；

2022-06-06

國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1600705-2）、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（S2021JBKY-14）

蘇媛媛，E-mail：suy2021@126.com。通信作者陳麗，E-mail：chenliwork@126.com。通信作者鄭曉春，E-mail：group2_meat@163.com

（責任編輯 趙伶俐）