番茄DIR基因家族鑒定及其對非生物脅迫響應(yīng)的分析

陳鳳瓊，陳秋森，林佳昕，王雅亭，劉漢林，梁冰若詩，鄧藝茹，任春元，張玉先，楊鳳軍，于高波，魏金鵬，王孟雪

番茄DIR基因家族鑒定及其對非生物脅迫響應(yīng)的分析

陳鳳瓊，陳秋森，林佳昕，王雅亭，劉漢林，梁冰若詩，鄧藝茹，任春元，張玉先，楊鳳軍，于高波，魏金鵬，王孟雪

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江大慶 163319

【目的】鑒定番茄DIR基因家族所有成員，并對其基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化、染色體定位、共線性、啟動子元件、表達(dá)模式、互作轉(zhuǎn)錄因子及內(nèi)源競爭RNA預(yù)測等進(jìn)行了解析，為探究DIR在番茄生長發(fā)育和逆境脅迫中的作用提供參考?！痉椒ā坎捎蒙镄畔W(xué)方法，基于全基因組數(shù)據(jù)對番茄DIR基因家族成員進(jìn)行鑒定，運用Phytozome、MEME、PlantCARE、opsRNATarget和plantcircnet等在線網(wǎng)站獲取染色體位置、保守基序、順式作用元件、存在互作的轉(zhuǎn)錄因子、miRNA和circRNA等信息。利用Mapteace、TBtools、Cytoscape、OmicShare等作圖軟件及工具繪制染色體定位圖、進(jìn)化樹、DIR與轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系圖、ceRNA網(wǎng)絡(luò)等。采用NCBI的基因數(shù)據(jù)庫結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序及qRT-PCR試驗研究DIR基因家族在逆境下的表達(dá)情況。【結(jié)果】共鑒定到番茄中27個DIR基因，將其命名為—，分別位于12條染色體上，且大部分基因位于染色體末端，其基因結(jié)構(gòu)、基序和結(jié)構(gòu)域相對保守，其中22個具有一個外顯子的經(jīng)典結(jié)構(gòu)。番茄DIR基因家族同擬南芥的共線性關(guān)系遠(yuǎn)高于水稻和大豆?；谙到y(tǒng)進(jìn)化關(guān)系將27個番茄DIR成員分為3個不同的亞家族。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明大部分DIR基因在番茄根部具有較高的表達(dá)量。此外，DIR基因的啟動子區(qū)域含有多個與干旱、低溫等非生物脅迫，以及MeJA、ABA、SA等激素誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件，且預(yù)測到與激素、生長發(fā)育、非生物脅迫相關(guān)的ERF、E2F/DP、MYB等互作轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，分別有5、10、10和13個在農(nóng)藥、干旱、鹽和冷脅迫后顯著上調(diào)表達(dá)，其中，受到以上4種脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，而和特異性響應(yīng)冷脅迫的誘導(dǎo)，特異性響應(yīng)鹽脅迫。番茄DIR的ceRNA調(diào)控表明，miR-156與靶基因可能共同作用調(diào)控番茄的逆境脅迫。【結(jié)論】共鑒定出番茄DIR家族基因27個，不均勻地分布在12條染色體上，在根部有較高的表達(dá)量。、和等具有MeJA、ABA、SA等激素響應(yīng)元件，其中，僅具有MeJA元件，僅具有SA響應(yīng)元件。另外，、等參與干旱、鹽、低溫等多種逆境脅迫，其中在不同脅迫處理下均可被激活。此外，DIR基因和轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA相互作用，共同參與調(diào)控番茄植株的逆境脅迫。

DIR蛋白；番茄；基因家族；生物信息學(xué)

0 引言

【研究意義】Dirigent（DIR）基因家族幾乎存在于所有維管植物中，主要參與細(xì)胞壁木質(zhì)素和木脂素的生物合成，對植物抗逆防御體系的形成起著重要作用。然而，迄今為止，關(guān)于番茄DIR基因家族的相關(guān)研究鮮有報道。本研究通過生物信息學(xué)方法鑒定番茄的DIR（SlDIR）基因家族，并進(jìn)一步針對其在番茄應(yīng)對逆境脅迫的響應(yīng)與生長發(fā)育中的作用開展研究，為揭示番茄DIR的功能研究奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】DIR基因家族首次于1997年在美國金鐘連翹中發(fā)現(xiàn)[1]。經(jīng)典的DIR基因結(jié)構(gòu)沒有內(nèi)含子，含有一個DIR保守結(jié)構(gòu)域，占據(jù)了大部分蛋白質(zhì)序列[2]。近年來，在多種植物中也發(fā)現(xiàn)了數(shù)量不等的DIR基因家族。目前已分別在擬南芥[3]、云杉[4]、水稻[5]、五味子[6]和毛竹[7]等作物中發(fā)現(xiàn)了26、31、54、34和43個DIR成員。PANIAGUA等[3]將DIR蛋白家族成員分成5個亞家族，分別是DIR-a、DIR-b、DIR-c、DIR-d和DIR-e亞家族。隨著DIR蛋白家族成員的增多，DIR-b和DIR-d亞家族聚合在了一起，并衍生出DIR-f和DIR-g亞家族。已有研究表明，DIR對植物響應(yīng)生物脅迫及非生物脅迫起著重要作用，如棉花通過提高棉花的木質(zhì)化程度來抵抗黃萎病菌的侵染[8]，三七能夠響應(yīng)外源MeJA的誘導(dǎo)，并在茄腐鐮刀菌侵染后表達(dá)量升高[9]。而辣椒的沉默會導(dǎo)致植株對病原體和鹽脅迫的耐受性降低[10]。【本研究切入點】目前關(guān)于番茄的DIR（SlDIR）基因家族的系統(tǒng)鑒定與分析尚未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過生物信息學(xué)方法鑒定出番茄DIR基因家族所有成員，并對其基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、染色體定位、共線性分析、啟動子元件、表達(dá)模式、轉(zhuǎn)錄因子及內(nèi)源競爭RNA預(yù)測進(jìn)行解析，結(jié)合已有逆境脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與其在農(nóng)藥等逆境脅迫中的響應(yīng)進(jìn)行測定分析。

1 材料與方法

1.1 番茄DIR 基因家族鑒定

基于Pfam數(shù)據(jù)庫的隱馬爾可夫模型，搜索全長轉(zhuǎn)錄組中包含Dirigent結(jié)構(gòu)域（Pfam 03018）的基因，并按照閾值條件為E-value＜1×10-20將可信度較高的候選基因篩選出來。利用這些基因進(jìn)行番茄DIR基因家族的隱馬爾可夫模型的構(gòu)建。使用新構(gòu)建的模型重新對全長轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行搜索，并按照閾值條件為E-value＜1×10-3對結(jié)果進(jìn)行過濾。同時，搜集NCBI中植物DIR蛋白Ref-seq模塊內(nèi)的序列，通過blast將搜集到的蛋白序列同全長轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對，并按照閾值條件為E-value＜1×10-10將可信度較高的基因篩選出來[11]。最后，取兩種方法鑒定結(jié)果的交集，作為最終的番茄DIR候選基因，并通過NCBI的Batch Web CD-Search Tool（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）驗證候選基因的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2 番茄染色體定位和共線性分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫中得到番茄DIR基因家族成員在染色體上的位置利用Mapteace軟件繪制基因染色體定位圖。從前人報道中得到擬南芥[3]、大豆[12]、水稻[5]的DIR基因登錄號，從Gramene（http://www. gramene.org/）獲取基因組長度信息、從phytozome得到DIR蛋白的位置信息，從PGDD（http://chibba.pgml. uga.edu/duplication/）中檢索番茄、擬南芥、水稻和大豆之間的關(guān)系對，最后利用Tbtools進(jìn)行DIR共線性分析。

1.3 番茄DIR基因家族蛋白理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位

利用Phytozome查找番茄DIR基因的蛋白序列，結(jié)合利用ExPASy在線網(wǎng)站的ProtParam工具（https:// web.expasy.org/protparam/）對番茄DIR蛋白序列進(jìn)行分析，獲取氨基酸長度、相對分子質(zhì)量、理論等電點、分子式、親水性、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)。利用在線網(wǎng)站W(wǎng)olf PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）對番茄DIR蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測[13]。

1.4 番茄DIR 基因家族蛋白保守基序分析

利用MEME在線網(wǎng)站（https://meme-suite.org/ meme/）鑒定番茄DIR基因家族蛋白序列的保守基序，motif數(shù)量選擇13；motif長度范圍選擇6—50個氨基酸[14]。利用TBtools對保守基序進(jìn)行可視化[15]。

1.5 番茄DIR基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

擬南芥、番茄、棉花和辣椒的DIR蛋白序列通過MAFFT v7.475進(jìn)行比對[16]，并利用MEGAX 軟件對比對后的序列構(gòu)建鄰接（Neighbor Joining）樹[17]，利用iTOL（https://itol.embl.de/）對進(jìn)化樹進(jìn)行繪制[18]。

1.6 番茄DIR基因家族在不同組織中的表達(dá)分析

從番茄信息資源數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/）得到栽培番茄（cv. Heinz）根、葉、花芽、完全開放的花和1 cm果實的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用TBtools繪制番茄不同組織部位DIR基因表達(dá)的熱圖。

1.7 番茄DIR基因家族的啟動子順式元件和脅迫表達(dá)模式分析

從Phytozome下載番茄DIR基因上游1 500 bp序列，利用在線網(wǎng)站PlantCARE（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.html）[19]進(jìn)行順式作用元件分析。從NCBI的GEO DataSets下載冷、鹽和干旱脅迫下的番茄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并利用TBtools繪制熱圖。

1.8 番茄DIR相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

使用PlantRegMap（http://plantregmap.gao-lab.org/ index-chinese.php）在線網(wǎng)站預(yù)測與番茄DIR基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并利用Cytoscape軟件構(gòu)建番茄DIR基因與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系圖。

1.9 番茄DIR基因競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

使用在線網(wǎng)站http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/和http://bis.zju.edu.cn/plantcircnet/ index.php預(yù)測和識別與番茄DIR相關(guān)的miRNA和circRNA，通過OmicShare工具可視化ceRNA網(wǎng)絡(luò)（http://www.omicshare. com/tools）。

1.10 轉(zhuǎn)錄組測序

本試驗在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心人工智能氣候室中進(jìn)行，番茄品種為‘浙雜205’，由浙江省農(nóng)科院提供。番茄常規(guī)育苗，待番茄幼苗長至6—7片葉時進(jìn)行農(nóng)藥處理。試驗以清水為對照（CK），以11.2 mmol?L-1百菌清為農(nóng)藥處理，每個處理 3 次重復(fù)，將番茄葉片正反面均勻噴施相應(yīng)的處理試劑，并于處理24 h后采集植株形態(tài)學(xué)上端第2片完全展開的功能葉，用于RNA提取，液氮速凍保存。樣品送至百邁客生物科技有限公司進(jìn)行測序。樣品總RNA提取參考Axygen RNA 提取試劑盒說明書。構(gòu)建文庫后進(jìn)行檢測，庫檢合格后，用HiSeq X-ten 進(jìn)行高通量測序。

1.11 番茄DIR基因的qRT-PCR表達(dá)分析

百菌清處理同1.10以300 mmol?L-1NaCl溶液澆灌土壤為鹽脅迫處理，以20%的PEG溶液澆灌土壤為干旱脅迫處理，以清水澆灌為對照（CK）。以4℃為低溫處理，以常溫25℃為對照（CK），每個處理3次重復(fù)，并于處理24 h后采集植株形態(tài)學(xué)上端第2片完全展開的功能葉，用于RNA提取。樣品總 RNA 提取參考Axygen RNA 提取試劑盒說明書，并使用Prime ScriptRT Reagent（TaKaRa Japan）反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。使用SYBR（Roche.Switerland）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，使用軟件Primer 5.0設(shè)計引物（附表1）。

1.12 數(shù)據(jù)處理

基因的相對表達(dá)量采用2-Δ?Ct法[20]計算；數(shù)據(jù)處理使用Excel 2019軟件；柱狀圖的繪制使用Origin 2017軟件。

2 結(jié)果

2.1 番茄DIR家族成員的鑒定、染色體定位和理化性質(zhì)分析

利用擬南芥的26個DIR蛋白的氨基酸序列為查詢序列，在Phytozome進(jìn)行BLAST同源比對，并對得到的DIR蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域鑒定，得到27個DIR蛋白。根據(jù)基因登錄號將其命名為—（附表2），番茄DIR基因不均勻地分布在12條染色體上，且大部分位于染色體末端，其中第10條染色體上分布最多，含有7個DIR基因（圖1）。對番茄DIR蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測（附表2），分析發(fā)現(xiàn)SlDIR蛋白質(zhì)的大小介于60（）—499（）個aa之間，平均長度約為200 aa。SlDIR蛋白的相對分子質(zhì)量介于6 433.74 kD（）—41 413.18 kD（），等電點介于4.47（）—9.85（），其中有12個酸性蛋白和15個堿性蛋白，這突出了它們結(jié)構(gòu)的多樣性，9個定位于細(xì)胞外區(qū)域（附表2）。

圖1 番茄DIR基因染色體定位

2.2 番茄DIR 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用擬南芥、番茄、CM334品系辣椒和陸地棉的DIR蛋白序列構(gòu)建NJ樹，參考擬南芥DIR的分類，根據(jù)同源性分析，可將番茄DIR家族成員分成3個亞家族，分別為DIR-a、DIR-c和DIR-e，其中DIR-c亞家族的數(shù)量最多，為15條，DIR-e亞家族數(shù)量次之，有8個基因，DIR-a亞家族成員最少，僅包含和。另外，茄科作物辣椒的亞家族與番茄類似，且DIR-c、DIR-e和DIR-a亞家族基因數(shù)目分別為8、6和6條。擬南芥的DIR成員分為5個亞家族，分別為DIR-a、DIR-b、DIR-c、DIR-d和DIR-e，分別包含6、2、7、5和6條DIR基因。陸地棉的DIR亞家族分類與擬南芥類似，均有5個亞家族，但不同亞家族成員數(shù)量明顯多于番茄、辣椒和擬南芥。綜上，茄科作物番茄與辣椒中DIR-a和DIR-e亞家族中DIR數(shù)目與擬南芥中相似，說明這兩個亞家族的DIR基因并沒有在基因組中大范圍變化。然而，番茄DIR-c亞家族數(shù)目約為擬南芥中的2倍，且與擬南芥相比，番茄缺失DIR-b和DIR-d亞家族成員（圖2）。

圖2 擬南芥、番茄、辣椒和棉花DIR家族的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 番茄DIR基因家族蛋白保守基序分析

大多數(shù)包含一個外顯子的經(jīng)典DIR基因結(jié)構(gòu)，但是、和包含兩個外顯子和一個內(nèi)含子（圖3）。此外，27個番茄DIR蛋白搜索到13個motif，其中3個亞家族共享motif 1、motif 2和motif 3，說明motif 1、motif 2和motif 3在番茄DIR蛋白質(zhì)序列中的分布較為廣泛，并具有較強的保守性。同一亞家族中的大多數(shù)SlDIR成員也共享一些保守的基序，說明這些蛋白質(zhì)的功能保守。但也存在部分基序特異性地存在于某些亞家族中：motif 5、motif 6、motif 8和motif 11特異性存在于DIR-c亞家族中，而motif 9、motif 12和motif 13僅出現(xiàn)在DIR-e亞家族，motif 10僅在DIR-a亞家族中被發(fā)現(xiàn)，這表明在不同的亞家族中存在功能多樣性（圖3）。

圖3 番茄DIR基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹、蛋白基序和基因結(jié)構(gòu)

2.4 番茄與不同作物的共線性分析

根據(jù)番茄與大豆、水稻、擬南芥DIR基因的共線性分析結(jié)果，在番茄的種內(nèi)共線關(guān)系中發(fā)現(xiàn)和均發(fā)生片段復(fù)制，且片段復(fù)制使基因數(shù)目增多，尤其是DIR-e和DIR-c亞家族，而DIR-a亞家族成員未發(fā)生片段復(fù)制，基因數(shù)目最少。在對番茄、大豆、水稻和擬南芥4個物種的直系同源基因進(jìn)行比對分析中發(fā)現(xiàn)，和在擬南芥染色體1、2、3和4上具有同源基因，同源基因?qū)?shù)量為12對，多于番茄與水稻（3對）、大豆與擬南芥（2對）、擬南芥與水稻（1對）和大豆與水稻（1對）的同源基因?qū)?。說明番茄和擬南芥的DIR基因家族具有更近的同源進(jìn)化關(guān)系，且這些基因可能具有相似的功能，然而DIR基因在番茄和大豆中不存在同源基因?qū)Γ▓D4）。

2.5 番茄DIR基因家族在不同組織部位的表達(dá)模式分析

為了進(jìn)一步闡明在番茄生長發(fā)育中的潛在作用，在番茄信息資源數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/）得到栽培番茄（cvHeinz）5個組織部位（根、葉、花芽、完全開放的花和1 cm的果實）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到27條番茄DIR基因的表達(dá)情況。如圖5所示，DIR-c亞家族在5個組織部位均有表達(dá)，其中在根及花芽中表達(dá)較為顯著；DIR-a亞家族在組織部位中的表達(dá)與DIR-c亞家族類似；然而DIR-b亞家族僅在根及花芽有表達(dá)，其中在根部的表達(dá)最為顯著?？傮w而言，番茄中共有17個在根中顯著表達(dá)，且高于其他組織部位，而在葉和果實中的表達(dá)量相對很低，表明該基因的表達(dá)可能對番茄根部生長及逆境響應(yīng)較為重要。

紅色弧線表示物種間存在同源性，灰色弧線表示物種內(nèi)存在同源性

圖5 番茄DIR基因家族在不同組織部位中的表達(dá)分析

2.6 番茄DIR基因的啟動子順式元件分析和不同脅迫條件下的表達(dá)模式分析

啟動子中含有大量激素應(yīng)答元件、脅迫響應(yīng)元件和光反應(yīng)元件等（圖6）。對所有順式元件及其位點數(shù)進(jìn)行分類和統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，是含有啟動子順式元件最多的成員，其次是，而僅含有2個順式作用元件，說明不同的對激素處理或逆境脅迫等的應(yīng)答存在較大的區(qū)別。在啟動子序列預(yù)測到了多個激素響應(yīng)元件，包括生長素、赤霉素、ABA、MeJA和SA。其中15個啟動子序列含有MeJA作用元件，13個啟動子序列含有ABA作用元件，10個啟動子序列含有SA作用元件，含有生長素和赤霉素響應(yīng)元件的均有5個。因此，多種激素可參與調(diào)控DIR的表達(dá)，不同成員之間存在著一定的協(xié)同或拮抗作用。與此同時，在啟動子序列中還預(yù)測到了與厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的響應(yīng)元件ARE、與低溫脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件LTR、與干旱相關(guān)的應(yīng)答元件MBS等響應(yīng)逆境脅迫的元件。此外，還發(fā)現(xiàn)與光反應(yīng)相關(guān)的應(yīng)答元件MRE和Circadian；與類黃酮合成相關(guān)的應(yīng)答元件MBSI，與葉片衰老有關(guān)的應(yīng)答元件CCAAT-box等。因此，預(yù)測表達(dá)在番茄上述調(diào)控過程中起到一定的作用。

圖6 番茄DIR基因上游1500 bp啟動子順式元件分析

為了進(jìn)一步探究對逆境脅迫的響應(yīng)，通過轉(zhuǎn)錄組測序試驗及數(shù)據(jù)庫中的脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了27個SlDIR家族成員在4種非生物脅迫條件（農(nóng)藥百菌清、鹽、干旱和冷）下的相對轉(zhuǎn)錄豐度（圖7）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在百菌清、鹽、干旱和冷脅迫后，在DIR-e亞家族中，分別有4、4、4和8個相對表達(dá)量顯著上調(diào)；DIR-c亞家族中分別有0、4、6和4個被誘導(dǎo)表達(dá)；DIR-a亞家族分別有1、2、1和1個受到脅迫響應(yīng)。其中，受到這4種脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，和在鹽、干旱和冷脅迫后顯著上調(diào)，和受到干旱和冷脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，和顯著響應(yīng)鹽和冷脅迫。另外，也在百菌清和冷脅迫后顯著上調(diào)，而、和特異性響應(yīng)冷脅迫的誘導(dǎo)。此外，特異性響應(yīng)鹽脅迫。這些結(jié)果表明在番茄抵御各種非生物脅迫的過程中可能具有重要作用，且不同基因?qū)γ{迫存在著特異性的響應(yīng)。

圖7 番茄DIR基因在百菌清、鹽、干旱和冷脅迫下的轉(zhuǎn)錄豐度（A）及番茄DIR基因在干旱脅迫（B）、鹽脅迫(C)、冷脅迫（D）和百菌清脅迫（E）下的qRT-PCR驗證

為了證實以上結(jié)果，從番茄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選擇基因表達(dá)量差異較為顯著的8個DIR基因（和)，通過熒光定量qRT-PCR檢測其對干旱脅迫、鹽脅迫、冷脅迫和百菌清脅迫24 h后的表達(dá)響應(yīng)，并對干旱脅迫6 h、鹽脅迫8 h、冷脅迫12 h和百菌清脅迫24 h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2處理分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在百菌清（CHT）、鹽、干旱和低溫脅迫處理后，分別有5、4、3和6個表達(dá)量上調(diào)，分別有3、4、5和2個表達(dá)量下調(diào)。這與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，進(jìn)一步驗證了參與了番茄抵御逆境脅迫的過程。

2.7 番茄DIR相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

預(yù)測到共有30個轉(zhuǎn)錄因子（TFs）家族與存在互作關(guān)系。在所有中，預(yù)測到與存在互作的轉(zhuǎn)錄因子最多，有11個，分別為E2F/DP（E2 factor）、AP2、生長素響應(yīng)因子（ARF）、BBR-BPC、Dof（DNAbinding with one finger）、ERF、GATA、GRAS、MYB、NAC）和三胺酸環(huán)延伸（TALE）（圖8）。另外，有11個預(yù)測到5個及以上的互作轉(zhuǎn)錄因子，主要與植物的生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫有關(guān)，這說明DIR基因在番茄的生長發(fā)育和逆境脅迫中扮演著重要的角色。在所有TF中，乙烯響應(yīng)元件結(jié)合因子（ERF）和MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）均與14個存在互作關(guān)系，其中，與ERF有關(guān)的包括和；與MYB有關(guān)的是和，其次是GATA與8個存在互作關(guān)系。以上結(jié)果說明可能受這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，與其互作參與植株的生長發(fā)育調(diào)控與逆境響應(yīng)。

圖中紅色表示基因，綠色表示轉(zhuǎn)錄因子 Red indicates gene and green indicates transcription factor

2.8 番茄DIR基因的ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析

miRNA可與非編碼RNA相互作用形成ceRNA網(wǎng)絡(luò)，參與植物生理活動的調(diào)控。因此，預(yù)測了與有靶向關(guān)系的miRNA，以及與miRNA相關(guān)的circRNA。27個中有11個預(yù)測到了有靶向關(guān)系的12個miRNA和20個circRNA，并構(gòu)建了50條ceRNA調(diào)控途徑（圖9）。大多數(shù)可作為1—2個miRNA的靶點，而可作為11個miRNA的靶點。此外，slsly-miR1917和y-miR5302b-3p預(yù)測的14個circRNA可以與靶基因（和）形成至少15個ceRNA網(wǎng)絡(luò)。綜上表明，可能受多個miRNA的調(diào)控，形成具有circRNA-miRNA模式的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，參與多種生理功能。

圖9 番茄DIR基因的ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析

3 討論

3.1 番茄DIR基因家族的鑒定

DIR基因在基因組進(jìn)化過程中發(fā)生了廣泛的變化，在不同作物中DIR數(shù)量不同，擬南芥、綠豆[21]、苜蓿[22]、丹參[23]和油菜[24]中分別含有26、45、34、33和29個成員，本研究在番茄中鑒定出27個DIR成員。其大多數(shù)亞族同樣從其他作物中被鑒定出來[25]，但一些亞族在進(jìn)化過程中發(fā)生丟失，番茄僅包含6個DIR亞家族中的3個，包括DIR-a、DIR-c和DIR-e，而DIRb/d、DIR-g和DIR-f在番茄進(jìn)化過程中丟失。生化試驗表明，參與木質(zhì)素合成的DIR蛋白都屬于DIR-a亞家族[1]，本研究中番茄、、和屬于DIR-a亞家族，因此，推測這4個基因可能參與木質(zhì)素合成。DIR基因的典型結(jié)構(gòu)包含一個外顯子[2]，所有的DIR-a亞家族成員都含有典型的基因結(jié)構(gòu)，表明DIR-a亞家族在3個亞家族中較為保守，但是DIR-e亞家族的、和DIR-c亞家族的、、包含兩個外顯子和一個內(nèi)含子。另外，在所有的中都存在一些共有的基序，例如motif1、motif 2、motif 3和motif 4，表明具有較高的保守性。然而，一些基序僅存在于特定的亞家族中，其中motif 10僅在DIR-a亞家族中被發(fā)現(xiàn)，表明在不同的亞家族中表現(xiàn)出高度的功能多樣性。另外，在番茄與大豆、水稻、擬南芥的同源關(guān)系比對中發(fā)現(xiàn)，除番茄與大豆外，與其他物種間均存在一定數(shù)量的同源關(guān)系對。擬南芥、番茄同屬于雙子葉植物，兩者間DIR家族成員存在大量的共線性關(guān)系，而與單子葉植物水稻僅1個成員有共線性關(guān)系，這一結(jié)果與雙子葉和單子葉植物間的進(jìn)化關(guān)系一致。但同為雙子葉植物的番茄和大豆DIR家族成員間不存在共線性，這表明DIR在不同植物中存在多樣性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)17個在根中顯著表達(dá)，這與GUO等[26]和PANIAGUA等[3]在甘蔗和擬南芥的研究結(jié)果一致。許多DIR成員的功能主要涉及木脂素和木質(zhì)素的形成，以及植物對非生物和生物脅迫的抗性。因此，推測番茄在抵御病原菌等生物及非生物逆境脅迫時，可能通過根部DIR基因合成更多的木脂素和木質(zhì)素以增強其抵抗能力。

3.2 番茄DIR基因家族響應(yīng)不同的逆境脅迫

本研究針對上游1 500 bp序列中的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，該家族中的大部分成員響應(yīng)多種激素調(diào)控，包括MeJA、ABA、JA等參與植物脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激素，說明SlDIR家族在番茄生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。其中，有55.6%和48.1%的分別響應(yīng)MeJA和ABA的調(diào)控。已有研究表明MeJA[27-28]和ABA[29-30]等激素還可以通過提高植物的抗氧化酶活性，清除自由基，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來減輕植物受到的脅迫損傷。因此，推測可能通過響應(yīng)MeJA、ABA等激素應(yīng)答，參與非生物脅迫的調(diào)控作用，從而增強植物對逆境脅迫的耐受性，但其具體機(jī)制有待深入研究。另有研究證實黃瓜[31]能夠通過增加農(nóng)藥霜霉威脅迫下黃瓜的可溶性糖含量、提高POD酶活性，減緩霜霉威引起的活性氧對質(zhì)膜的傷害。本研究的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與qRT-PCR數(shù)據(jù)分析也表明部分番茄受到農(nóng)藥百菌清脅迫的顯著誘導(dǎo)。百菌清（CHT）作為一種廣譜性、非系統(tǒng)性的殺菌劑，可用于保護(hù)蔬菜和作物免受真菌病原體的侵害，但其消散的速度極其緩慢，即使是低劑量的有毒成分也會對人體健康造成直接危害[32]。本研究還發(fā)現(xiàn)，啟動子中存在與低溫、干旱和熱脅迫等非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式元件，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析也表明分別有13、10、10和5個顯著響應(yīng)了冷、干旱、鹽和百菌清脅迫，qRT-PCR的試驗驗證了這一結(jié)果。此外，GUO等[26]在甘蔗中已驗證了參與H2O2、PEG和NaCl脅迫，THAMIL等[24]在油菜中也發(fā)現(xiàn)，受到低溫脅迫后，表達(dá)量顯著上調(diào)，提高酸溶性木質(zhì)素含量，從而抵抗逆境脅迫。YADAV等[33]研究葫蘆科作物甜瓜、西瓜和黃瓜的DIR基因?qū)Π追鄄〉目剐裕l(fā)現(xiàn)DIR基因在抗病品種和非抗病品種中均有表達(dá)，其中隨著接種時間的延長，表達(dá)量逐漸增加。這表明DIR基因家族在植物抵抗非生物逆境脅迫的過程中起著重要的作用。

由于植物基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子及非編碼RNA等多種途徑的復(fù)雜調(diào)控[34]，其對植物生長發(fā)育及逆境脅迫的應(yīng)答也可能是通過與轉(zhuǎn)錄因子互作、ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等多種方式實現(xiàn)的。轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達(dá)的驅(qū)動因素，在所有生物的基因表達(dá)調(diào)控中都發(fā)揮著核心作用。本研究發(fā)現(xiàn)與30個轉(zhuǎn)錄因子家族存在互作關(guān)系，其中，有14個DIR基因與ERF轉(zhuǎn)錄因子存在著復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。有研究發(fā)現(xiàn)菘藍(lán)[35]中的可通過結(jié)合啟動子區(qū)域的GCC-box，從而使表達(dá)水平顯著上調(diào)，激活木脂素代謝，增強菘藍(lán)對NaCl和H2O2的抵抗能力。另外，MARIAM等[36]研究表明，馬鈴薯感染茄花鐮刀菌時，的過表達(dá)會激活葡聚糖酶（PR2）、幾丁質(zhì)酶（PR3）等編碼基因的表達(dá)，從而使馬鈴薯對茄花鐮刀菌產(chǎn)生抗性。因此，可能通過與這些轉(zhuǎn)錄因子的互作參與到逆境脅迫的調(diào)控過程。另外，本研究還構(gòu)建了一個包括24個miRNA、21個circRNA和11個mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，并探索了一些與應(yīng)激相關(guān)的非編碼RNA，如sly-miR156a、sly-R156b和sly-miR156c。有研究表明，逆境條件下，miR156表達(dá)量上調(diào)，引起靶基因表達(dá)下調(diào)，負(fù)調(diào)控與花青素合成相關(guān)的作用因子DFR，使其表達(dá)增加，從而提高花青素的合成，抵抗逆境脅迫[37-38]。此外，在擬南芥中過表達(dá)miR156，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強的抗鹽脅迫能力[39]。本研究發(fā)現(xiàn)作為sly-miR156a、sly-R156b和sly-miR156c的靶基因，可能與miRNA156存在互作關(guān)系，在逆境脅迫中扮演著重要的作用。

4 結(jié)論

從番茄中鑒定到27個，分為DIR-a、DIR-c和DIR-e三個亞家族，不均勻地分布在12條染色體上，并多數(shù)在根部有較高的表達(dá)量。22個具有1個外顯子的經(jīng)典結(jié)構(gòu)，且3個亞家族共享motif 1、motif 2和motif 3。番茄DIR基因家族與擬南芥的共線性關(guān)系遠(yuǎn)高于水稻和大豆。、和等基因具有MeJA、ABA、SA等激素響應(yīng)元件，僅具有MeJA響應(yīng)元件，僅具有SA響應(yīng)元件。另外，、參與干旱、鹽、低溫等多種逆境脅迫響應(yīng)，尤其是在不同脅迫處理下均可被激活。此外，DIR基因和轉(zhuǎn)錄因子（MYB、ERF等）、非編碼RNA（sly-miR156a、sly-miR156b等）相互作用，共同參與調(diào)控番茄植株的逆境脅迫。

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Genome-Wide Identification of DIR Family Genes in Tomato and Response to Abiotic Stress

CHEN FengQiong, CHEN QiuSen, Lin JiaXin, WANG YaTing, LIU HanLin, LIANG BingRuoShi, DENG YiRu, REN ChunYuan, ZHANG YuXian, YANG FengJun, YU GaoBo, WEI JinPeng, WANG MengXue

College of Horticulture and Landscape Architecture, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Heilongjiang

【Objective】The aim of this study was to identify all members of tomato DIR gene family, and to predict and analyze their gene structures, physicochemical properties of proteins, phylogenetic relationship, chromosome location, collinearity analysis, promoter elements, expression pattern, prediction of interacting transcription factors and endogenous competitive RNA, so as to provide a reference for exploring the role of DIR in tomato growth and development and response to environmental stresses. 【Method】The family members of DIR were identified in the whole genome level by bioinformatics methods. The chromosome location, conserved motif, cis-acting element, transcription factors, miRNA and circRNA were analyzed with Phytozome, MEME, PlantCARE, opsRNATarget and plantcircnet, respectively. Chromosome location map, evolutionary tree, relationship map between DIR and transcription factors, ceRNA network, and etc., were drown using Maptea, TBtools, Cytoscape and Omicshare. The expression level of DIR under environmental stresses was studied by NCBI gene database, transcriptome sequencing and qRT-PCR. 【Result】27 members of DIR family were identified from the whole genome of the tomato, which were named-, and DIR genes of the tomato were located on 12 chromosomes, most of which were located at the end of chromosomes. The gene structures, motifs and domains were relatively conservative, and the classical structure of one exon existed in 22genes. The collinear relationship of DIR genes between tomato andwas much higher than that of rice and soybean. Based on the phylogenetic relationship, 27 DIR members of tomato were divided into three different subfamilies. The tissue specific expression analysis revealed that transcription levels of DIR members of tomato were higher in root. In addition, the promoter region of these genes contained multiple cis-acting elements related to abiotic stress, including drought, low temperature, and hormone induction, such as MeJA, ABA and SA. Hormone, growth and abiotic stress related to transcription factors (ERF, E2F / DP and MYB) were also predicted. Combined with our transcriptome data of pesticide stress and published transcriptome data analysis, the expression level of 5, 10, 10 and 13genes was significantly up-regulated after pesticide, drought, salt and cold stress. Andwas induced by all the four stresses, while,andwere specifically responded to the induction of cold stress, andspecifically responded to salt stress. Finally, the ceRNA regulation of tomato DIR showed that miR-156 might interacted with the target geneto regulate tomato against stresses.【Conclusion】A total of 27 DIR gene family members were identified from the tomato genome and unevenly distributed on 12 chromosomes, with high expression in roots. The expression of,,and othergenes was included by MeJA, ABA and SA and other hormone response elements, among which6 only contained MeJA element, and27 only contained SA response element. In addition,2,14,23 and other genes were participated in drought, salt, low temperature and other stresses. Especially for, it could be activated under different stress treatments. In addition, DIR genes interacted with transcription factors and noncoding RNA to regulate the responses of tomato plants under stresses.

DIR protein;; gene family; bioinformatics

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2021-12-19；

2022-03-21

黑龍江省博士后科研啟動項目（LBH-Q20052）、黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)博士科研啟動項目、黑龍江省“揭榜掛帥”科技攻關(guān)項目（2021ZXJ05B02）、黑龍江省留學(xué)歸國項目、國家自然科學(xué)基金（31301769）、黑龍江省自然科學(xué)基金（QC2018023）

陳鳳瓊，E-mail：1922925586@qq.com。通信作者魏金鵬，E-mail：weijp81@163.com。通信作者王孟雪，E-mail：wangmengxue@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）