唐草片對(duì)大鼠肝纖維化及NF-κB P65/IκBα信號(hào)通路的影響*

譚 穎 許琪華 邵寶平 譚行華

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科 (廣東 廣州， 510060) 2.上海百歲行藥業(yè)有限公司

肝纖維化是由于多種原因引起的肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常沉積與過(guò)度增生，其進(jìn)一步發(fā)展可致肝硬化及肝癌。由于肝纖維化的病理機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持具有療效明確的生物藥物或化學(xué)藥物供臨床應(yīng)用[1]。唐草片是治療艾滋病的純中藥復(fù)方制劑。前期研究發(fā)現(xiàn)，唐草片含多糖、黃酮、皂苷、酚類(lèi)等多種活性物質(zhì)，在清除自由基，保肝護(hù)肝方面優(yōu)勢(shì)突出[2]。在臨床運(yùn)用中發(fā)現(xiàn)，艾滋病病毒(HIV)感染者/艾滋病(AIDS)患者合并乙型肝炎病毒(HBV)/丙型肝炎病毒(HCV)感染伴有肝纖維化，唐草片可降低患者肝臟硬度?；诖?，研究唐草片對(duì)肝纖維化大鼠的作用及機(jī)制，以期為臨床用于防治肝纖維化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量(100～130)g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.44007200053321。

1.2 藥品與試劑 唐草片購(gòu)自上海百歲行藥業(yè)有限公司；秋水仙堿片購(gòu)自西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司；Elisa試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；豬血清購(gòu)于廣州未來(lái)生物科技有限公司；α-SMA、NF-κB P65、IκBα和β-actin抗體均購(gòu)自CST公司。

1.3 主要器械 RM2015型切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡有限公司；BK-DM500型數(shù)碼生物顯微鏡購(gòu)自重慶奧特光學(xué)顯微鏡有限公司；RT-6100型酶標(biāo)儀購(gòu)自Rayto；552BR144491迷你垂直電泳儀和153BR94063迷你電泳轉(zhuǎn)印芯購(gòu)自BIO-RAD；4200型化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自Tanon公司 。

1.4 動(dòng)物分組、造模與給藥 72只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，每組各12只，雌雄各半，按體重以隨機(jī)區(qū)間分組法分組分為：正常組，模型組，秋水仙堿組(0.12 mg/kg)，唐草片組高劑量組(2 g/kg),唐草片中劑量組(1 g/kg)，唐草片低劑量組(0.5 g/kg)。模型的制備參考周波等[3]研究者的方法。造模開(kāi)始第一天，除正常組外，各組均按5 ml/kg的比例皮下注射20%的CCl4花生油混合溶液。自此，每隔3 d按3 ml/kg比例進(jìn)行皮下注射。造模后第2 d按照3 ml/kg比例進(jìn)行豬血清腹腔注射，過(guò)后則間隔3天按照1 ml/kg比例進(jìn)行一次腹腔注射。于造模第3周起，每周注射20%的CCl4花生油混合溶液及豬血清各一次。從第5周開(kāi)始對(duì)各組灌胃干預(yù)，每天一次，每次2 ml，正常組與模型組灌胃同等容積純凈水。灌胃8周末，于灌胃結(jié)束后禁食24 h，稱重，取1%戊巴比妥鈉，按6 ml/kg劑量給予大鼠腹腔注射進(jìn)行后續(xù)采集標(biāo)本實(shí)驗(yàn)。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 標(biāo)本收集及指標(biāo)檢測(cè)樣品采集 麻醉成功后，迅速解剖，剝離大鼠腹主動(dòng)脈，采用一次性負(fù)壓采血器采全血10 ml。將血液室溫靜置2 h后，以3 000 r/min速度離心10 min。吸取上清液，-80℃保存?zhèn)溆?。剝離肝臟，取肝左上葉以4%甲醛液固定；其余肝組織放進(jìn)液氮罐，以便后期檢測(cè)。

1.5.2 HE染色 取肝左上葉放入4%甲醛液固定48 h，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)切片5 m, HE染色。用顯微鏡觀察HE染色的大鼠肝組織切片。

1.5.3 Masson染色 取肝左上葉放入4%甲醛液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片5 m, Masson染色。膠原纖維、黏液、軟骨呈藍(lán)色，胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核黑藍(lán)色。

1.5.4 免疫組化染色法檢測(cè)肝組織α-SMA含量 蠟塊切片后進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)情況，該蛋白免疫組化染色的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物為胞漿出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒狀物。

1.5.5 血清肝功能指標(biāo)、血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C及肝臟TNF-α、IL-6的檢測(cè) AST、ALT測(cè)定均采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)。ELISA法檢測(cè)血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C及肝臟TNF-α、IL-6水平，肝臟以生理鹽水按1∶10進(jìn)行勻漿，3 000 r/min離心15 min，分取上清于-80℃低溫冰箱保存，按照試劑盒要求采用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光度(A)值。

1.5.6 WB檢測(cè)肝組織NF-κB P65、IκBα蛋白的表達(dá) 20 mg肝組織加入裂解液充分裂解后收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度每個(gè)凝膠孔加入30 μg的已變性的蛋白樣品后進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育后在Tanon 4200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)里成像。

2 結(jié)果

2.1 唐草片對(duì)大鼠病理結(jié)果的影響 HE染色顯示：正常組大鼠肝小葉中央靜脈周?chē)渭?xì)胞排列成板層狀，肝板細(xì)胞排列規(guī)則整齊，肝細(xì)胞未見(jiàn)腫脹或壞死性改變，小葉結(jié)構(gòu)完整，未形成假小葉，也未見(jiàn)纖維增生。模型組肝細(xì)胞發(fā)生明顯的脂肪變性且充滿了大的脂肪空泡，細(xì)胞核被擠壓至一側(cè)，肝板結(jié)構(gòu)排列紊亂，小葉周?chē)糠指渭?xì)胞發(fā)生壞死。經(jīng)治療后，各組染色可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性、肝細(xì)胞中脂肪小滴、纖維組織增生等表現(xiàn)均較模型組有所改善。見(jiàn)圖1。

Masson染色顯示：正常組大鼠肝組織肝索排列整齊，呈條索狀向四周放射狀排列，小葉結(jié)構(gòu)清晰，僅在匯管區(qū)見(jiàn)少量膠原纖維；模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，匯管區(qū)和中央靜脈之間膠原纖維明顯增多，形成纖維縱膈，交結(jié)形成完全或不完全假小葉，同時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞變性、壞死；秋水仙堿、唐草片高、中劑量組大鼠未見(jiàn)明顯膠原纖維沉積，唐草片低劑量組可見(jiàn)少部分膠原纖維沉積。見(jiàn)圖2。

2.2 唐草片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)的影響正常組大鼠僅在匯管區(qū)周?chē)形⒘勘磉_(dá)，而模型組大鼠在匯管區(qū)和中央靜脈之間匯集大量 α-SMA，秋水仙堿組大鼠和唐草片各劑量組大鼠較模型組大鼠而言α-SMA表達(dá)明顯減弱。見(jiàn)圖3。

2.3 唐草片對(duì)肝纖維化大鼠肝功能的影響 見(jiàn)表1。

表1 唐草片對(duì)肝纖維化大鼠肝功能影響比較

2.4 唐草片對(duì)肝纖維化大鼠血清肝纖四項(xiàng)水平的影響 見(jiàn)表2。

表2 唐草片對(duì)肝纖維化大鼠血清肝纖四項(xiàng)水平影響比較

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.5 唐草片對(duì)肝纖維化大鼠肝臟細(xì)胞因子水平的影響 見(jiàn)表3。

表3 唐草片對(duì)肝纖維化大鼠肝臟細(xì)胞因子水平的影響比較

2.6 唐草片對(duì)肝組織NF-κB P65/IκBα蛋白水平的影響 見(jiàn)圖4，表4。

表4 唐草片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織NF-κB P65，IκBα蛋白表達(dá)量的影響比較

3 討論

肝纖維化是肝臟對(duì)各類(lèi)原因所致肝損傷的一種創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，中醫(yī)將肝纖維化歸屬于脅痛、黃疸、臌脹等范疇。中醫(yī)認(rèn)為大部分疾病的發(fā)生具有“初病在經(jīng)，久病入絡(luò)”的特點(diǎn)，由于肝纖維化的形成及發(fā)展過(guò)程較漫長(zhǎng)，因此大多具有久病多虛，易致瘀的特點(diǎn)[3]。唐草片組方意在“清熱解毒，活血益氣”。該方君藥為老鸛草，性味辛苦平，歸肝腎脾經(jīng)，臣為金銀花，性味甘寒，寒可清熱解毒，甘善補(bǔ)虛養(yǎng)血；柴胡苦、微寒，善疏肝，升陽(yáng)；黃芪，性甘微溫，具補(bǔ)中益氣，扶正驅(qū)邪之效；佐以瓜蔞潤(rùn)肺化痰， 利氣寬胸，紅花、銀杏葉、全蝎、雞血藤皆有活血化瘀，祛瘀生新之功效。甘草為使，解毒、調(diào)和諸藥。諸藥配伍攻補(bǔ)兼施，相輔相成?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)老鸛草主要化學(xué)成分包括鞣質(zhì)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸和揮發(fā)油等[4]，其中老鸛草分離出的老鸛草素、熊果酸、齊墩果酸是已知的具有保護(hù)肝細(xì)胞作用的單體。研究表明，老鶴草素具有抑制肝臟線粒體、微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化以及緩解CCl4所致肝損傷的作用[5，6]。熊果酸對(duì)酒精所致肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制與減輕脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)以及炎癥因子的過(guò)量釋放有關(guān)[7]，同時(shí)通過(guò)抑制相互作用的NOX4/ROS和RhoA/ROCK1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)肝纖維化[8]。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被認(rèn)為在調(diào)控組織損傷、炎癥產(chǎn)物編碼基因的表達(dá)和免疫反應(yīng)中起重要作用，在經(jīng)典的信號(hào)通路中，NF-κB/Rel蛋白與IκB蛋白結(jié)合并受其抑制，NF-κB的激活主要是由多種細(xì)胞外刺激信號(hào)引起，如促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、細(xì)菌脂多糖等，活化的NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能從而促進(jìn)肝細(xì)胞的再生，減輕肝臟炎癥、抑制纖維的增生[9-11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示唐草片對(duì)四氯化碳聯(lián)合豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠具有保護(hù)作用，能夠顯著減輕肝纖維化大鼠的肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)ALT、 AST 活性明顯下降，能夠降低TNF-α、IL-6從而減輕肝組織的炎癥反應(yīng)，使肝組織病理明顯改善，其機(jī)制可能與抑制NF-κB P65蛋白的表達(dá)，促進(jìn)IκBα的表達(dá)，調(diào)節(jié)NF-ΚB P65/IκBα的表達(dá)有關(guān)。