鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸生理特性與腸道菌群的影響

■盧俊樺 蔡春靜 李 璇 袁 雪 王 瑩 楚 杰

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物研究所，山東濟(jì)南 250103）

益生菌是通過定植在人體和動(dòng)物體內(nèi)，改變宿主某一部位菌群組成的一類對(duì)宿主有益的活性微生物。通過調(diào)節(jié)宿主黏膜與系統(tǒng)免疫功能或通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收，保持腸道健康，從而產(chǎn)生有利于健康作用的單微生物或組成明確的混合微生物[1-2]。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）多存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，細(xì)菌分類學(xué)屬于乳桿菌屬，鼠李糖亞種，是厭氧耐酸、不產(chǎn)芽孢的一種革蘭氏陽性益生菌。它具有耐酸、耐膽汁鹽、耐多種抗生素等生物學(xué)特點(diǎn)[3-4]。鼠李糖乳桿菌是人類共生微生物群中的一員，已被證明對(duì)人類健康很重要，如平衡腸道的微生態(tài)系統(tǒng)，并提供局部和系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)[5]。鼠李糖乳桿菌可以耐受動(dòng)物消化道內(nèi)的環(huán)境，在人和動(dòng)物的腸道中定植，并可以改善宿主的系統(tǒng)免疫反應(yīng)[6]。

加州鱸，又稱大口黑鱸（Micropterus salmoides），具有適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速、飼養(yǎng)管理方便等優(yōu)點(diǎn)，可在淡水池塘、湖泊、水庫等中開展養(yǎng)殖，是一種優(yōu)良的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。其肉質(zhì)鮮美，適溫較廣，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，養(yǎng)殖難度適中，適宜在北方地區(qū)進(jìn)行推廣養(yǎng)殖。近幾年來，大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年升高，已成為重要的淡水名特優(yōu)養(yǎng)殖品種之一[7-8]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和常見病害的影響，如何通過飼料營(yíng)養(yǎng)來維持養(yǎng)殖魚的生理健康，提高免疫防御能力是一個(gè)重要的技術(shù)問題。本著“預(yù)防為主，防重于治”的原則，通過添加益生菌調(diào)節(jié)機(jī)體中過度繁殖菌群的活性，改變機(jī)體消化道的內(nèi)環(huán)境，從而保持腸道內(nèi)菌群的平衡,促進(jìn)機(jī)體腸道健康[9-10]。因此，本研究旨在探究不同鼠李糖乳桿菌的添加量對(duì)加州鱸生長(zhǎng)性能、免疫指標(biāo)、抗氧化能力、腸道消化酶活性和腸道菌群的影響。本研究將為鼠李糖乳桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

加州鱸購自山東省淡水漁業(yè)研究院；鼠李糖乳桿菌由山東省科學(xué)院生物研究所工業(yè)微生物研究室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇初始體重（83.8±9.6）g、健康的加州鱸240尾，設(shè)置對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組，分別用D組、R1組、R2組和R3組表示，每組3個(gè)重復(fù)。每個(gè)飼養(yǎng)容器（規(guī)格為半徑1 m、高1 m）投放20尾加州鱸。D組為空白對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)R1、R2、R3組在基礎(chǔ)飼料中分別添加2%、5%、8%的鼠李糖乳桿菌（1×109CFU/g）。投喂前，將菌液均勻地噴灑在顆粒飼料表面。試驗(yàn)期為42 d?；A(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(%)

1.2.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚在試驗(yàn)開始前用基礎(chǔ)飼料馴化2周。養(yǎng)殖期間按照加州鱸體重的3%投喂飼料，每天兩次（8：00、18：00），表觀飽食投喂。每個(gè)飼養(yǎng)容器都是由兩個(gè)氣石連接到一個(gè)電動(dòng)壓縮機(jī)組成的。每周測(cè)量每個(gè)水箱的水質(zhì)參數(shù)，水溫為（26.0±3.0）℃，溶解氧含量約（6.5±0.3）mg/L，水體pH為（7.3±0.6），氨氮濃度≤0.21 mg/L。

1.2.3 生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)加州鱸進(jìn)行計(jì)數(shù)和體重測(cè)定，計(jì)算生長(zhǎng)性能指標(biāo)。

增重率（WGR，%）=[（Mt-Mo）/Mo]×100

特定生長(zhǎng)率（SGR，%/d）=[（lnMt-lnMo）/t]×100

成活率（SR，%）=Nt/No×100

飼料系數(shù)=總投餌量/加州鱸總增重量

式中：No——加州鱸初始個(gè)體數(shù)量（尾）；

Nt——加州鱸終末個(gè)體數(shù)量（尾）；

Mo——加州鱸初重（g）；

Mt——加州鱸末重（g）；

t——試驗(yàn)天數(shù)（d）。

1.2.4 樣品處理

取各試驗(yàn)組加州鱸血液樣品于離心管中，放入冰盒中保存。血樣2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清液，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

加州鱸取血后處死，解剖，摘取肝臟、腸道，用無菌的生理鹽水清洗并用吸水紙擦干表面多余水分，用液氮快速冷凍后保存。準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，在冰水浴條件下，制備成10%的組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，用于蛋白質(zhì)含量及酶活性測(cè)定。

1.2.5 血清免疫指標(biāo)

血清中酸性磷酸酶（ACP）的活性采用比色法測(cè)定（南京建成生物工程研究所有限公司）。白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-α）的濃度采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒測(cè)定（南京建成生物工程研究所有限公司）。一個(gè)金氏單位的ACP活性被定義為在37 ℃下與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg硝基苯酚的100 mL血清中所需的酶的量。

1.2.6 抗氧化相關(guān)參數(shù)測(cè)定

用分光光度計(jì)測(cè)定肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性和丙二醛（MDA）含量?？寡趸嚓P(guān)參數(shù)檢測(cè)試劑盒（SOD、GSH-Px、CAT、GPT、GOT、MDA）購自南京建成生物工程研究所有限公司。一個(gè)SOD 活性單位（U）定義：在450 nm 處反應(yīng)體系中SOD 抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量。一個(gè)單位的GSH-Px 活性定義：每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 mol/L為一個(gè)酶活性單位。組織中CAT活性定義：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為一個(gè)活性單位?？ㄩT氏單位定義：1 mL液體，反應(yīng)液總?cè)萘? mL，波長(zhǎng)340 nm，1 cm 光徑，25 ℃，1 min 內(nèi)所生成的丙酮酸，使NADH 氧化成NAD+而引起吸光度每下降0.001 為一個(gè)單位（1 卡門氏單位=0.482 IU/L，25 ℃）。MDA 含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）的測(cè)定程序。將樣品（0.1 mL）與相同體積的試劑一混勻，加入3.0 mL試劑二和1.0 mL試劑三。將試劑與樣品的混合物在沸水浴中加熱40 min，然后冷卻，以4 000 r/min離心10 min，以去除組織樣品的沉淀。上清液中的MDA含量可以直接從粉紅色色素的摩爾消光系數(shù)來確定。

1.2.7 消化酶活性測(cè)定

蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。組織勻漿中胰蛋白酶活性單位定義：在pH 8.0，37 ℃條件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003即為一個(gè)酶活性單位。組織中淀粉酶活性單位定義：組織中每毫克蛋白質(zhì)在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活性單位。組織脂肪酶活性單位定義：在37 ℃條件下，每克組織蛋白質(zhì)在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個(gè)酶活性單位。

1.2.8 腸道菌群分析

養(yǎng)殖結(jié)束后禁食24 h，每組隨機(jī)選取5 尾加州鱸。采用75%的乙醇擦拭消毒，無菌操作條件下解剖取出完整腸道，送至深圳微科盟科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸生長(zhǎng)性能的影響（見表2）

表2 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，飼料中添加鼠李糖乳桿菌能夠明顯提高加州鱸的增重率、特定生長(zhǎng)率和養(yǎng)殖成活率，明顯降低飼料系數(shù)。

2.2 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸血清免疫指標(biāo)的影響（見表3）

由表3可知，飼料中添加鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸血清IL-6 含量影響不顯著（P＞0.05），對(duì)加州鱸血清ACP活性、TNF-α含量有影響。與D組相比，試驗(yàn)R2、R3 組的ACP 活性顯著升高，分別增加72.54%和91.20%；飼料中隨著鼠李糖乳桿菌添加量的增加，各組血清IL-6含量緩慢升高，血清TNF-α含量變化規(guī)律不明顯，但試驗(yàn)R3組TNF-α含量顯著高于D組。

表3 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸血清免疫指標(biāo)的影響

2.3 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸肝臟抗氧化指標(biāo)的影響（見表4）

由表4可知，飼料中添加鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸肝臟SOD、MDA、CAT、GPT、GOT、GSH-Px有不同程度的影響。與D組相比，試驗(yàn)R1、R2、R3組的SOD活性顯著升高（P＜0.05），分別增加6.61%、15.91%和25.66%；飼料中隨著鼠李糖乳桿菌添加量的增加，MDA 含量逐漸下降，與D 組相比，試驗(yàn)R3 組的MDA含量減少26.26%（P＜0.05）；試驗(yàn)R2、R3 組顯著增加加州鱸肝臟CAT 活性（P＜0.05），與D 組相比，R2、R3組分別增加20.46%和40.37%；隨著飼料中鼠李糖乳桿菌添加量的增加，GPT、GOT活性下降，與D組相比，試驗(yàn)R2、R3組GPT活性分別下降17.70%、22.59%，差異顯著（P＜0.05），試驗(yàn)R1、R2、R3組GOT 活性分別下降25.31%、48.32%、46.57%，差異顯著（P＜0.05）；隨著飼料中鼠李糖乳桿菌添加量的增加，各組加州鱸肝臟GSH-Px 活性顯著升高（P＜0.05），分別增加7.59%、17.74%和22.76%。

表4 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸腸道消化酶活性的影響（見表5）

由表5可知，飼料中添加鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸腸道消化酶有不同程度的影響。與D 組相比，試驗(yàn)R1、R2、R3 組的淀粉酶活性顯著升高（P＜0.05），分別增加17.24%、34.48%和48.27%；飼料中隨著鼠李糖乳桿菌添加量的增加，蛋白酶和脂肪酶的活性也顯著升高，與D組相比，試驗(yàn)R1、R2、R3組的蛋白酶活性分別增加9.45%、24.63%和49.95%；試驗(yàn)R1、R2、R3 組的脂肪酶活性分別增加28.57%、48.98%和81.63%。

表5 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸腸道消化酶活性的影響

2.5 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸腸道菌群組成的影響

基于Illumina NovaSeq 平臺(tái)對(duì)不同處理組加州鱸腸道菌群組成進(jìn)行分析比較。

2.5.1 不同處理組加州鱸腸道菌群的OTUs 韋恩圖（見圖1）

圖1 不同處理組加州鱸腸道菌群的OTUs韋恩圖

對(duì)于樣本間，根據(jù)OTU是否存在來尋找樣本之間的特有或共有的OTU，通過韋恩圖(Venn diagram)分析不同樣品組之間特有或共有的OTU，用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)樣本在OTU水平上的組成相似性及重疊情況[11-12]。由圖1可知，與D組相比，R1組加州鱸腸道具有3 534個(gè)特有OTU（D組1 222個(gè)），R2組加州鱸腸道具有2 880個(gè)特有OTU（D組1 155個(gè)），R3組加州鱸腸道具有3 512個(gè)特有OTU（D組1 288個(gè)）。可見，飼料中添加鼠李糖乳桿菌后，加州鱸腸道中特有的OTU數(shù)明顯增多。

2.5.2 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸腸道菌群物種相對(duì)豐度的影響（見圖2）

將注釋結(jié)果在不同分類水平上按照豐度進(jìn)行排序，選取每個(gè)組別在屬分類水平上最大豐度排名前20的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形圖。由圖2 可知，對(duì)照組加州鱸腸道鯨桿菌屬（Cetobacterium）相對(duì)豐度最大為52.42% ，羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、支原體屬（Mycoplasma）和假單胞菌屬（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）的相對(duì)豐度分別為15.13%、8.30%和5.53%，其他菌屬（Others）為18.62%；R1組加州鱸腸道支原體屬（Mycoplasma）、鯨桿菌屬（Cetobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）和羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）的相對(duì)豐度分別為27.75%、20.29%、13.83%、12.58%，其他菌屬為25.55%；R2 組加州鱸腸道的羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、支原體屬（Mycoplasma）、鯨桿菌屬（Cetobacterium）和假單胞菌屬（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）的相對(duì)豐度分別為27.14%、23.38%、13.91%和8.75%，其他菌屬為26.82%；R3 組加州鱸腸道的支原體屬（Mycoplasma）、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、假單胞菌屬（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）和鯨桿菌屬（Cetobacterium）的相對(duì)豐度分別為28.20%、25.01%、17.14%和6.14%，其他菌屬為23.51%。鼠李糖乳桿菌組加州鱸腸道其他菌屬的相對(duì)豐度均高于D組。

圖2 不同處理組加州鱸腸道菌群中屬水平以上的物種相對(duì)豐度柱形圖

2.5.3 鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸腸道菌群α-多樣性指數(shù)的影響（見表6）

表6 不同處理組加州鱸腸道菌群α-多樣性指數(shù)比較

由表6 可知，處理組加州鱸腸道菌群Shannon、Simpson、Chao 1 指數(shù)、faith 指數(shù)均明顯高于D 組。添加鼠李糖乳桿菌能夠明顯提高加州鱸腸道菌群的多樣性水平。

3 討論

血清中的酸性磷酸酶是溶酶體酶系的標(biāo)志酶，能夠轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)，合成磷酸二腺苷和磷酸三腺苷，參與能量轉(zhuǎn)化和信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而提高機(jī)體非特異性免疫水平和營(yíng)養(yǎng)代謝水平[13]。TNF-α是由淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，它能夠激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)某些細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素、干擾素以及TNF-α等細(xì)胞因子，發(fā)揮重要的免疫促進(jìn)作用[14]。IL-6形成于免疫反應(yīng)早期，在機(jī)體免疫應(yīng)激中起主導(dǎo)作用[15]。本試驗(yàn)研究表明，隨著飼料中鼠李糖乳桿菌添加水平的增加，加州鱸血清中酸性磷酸酶活性逐漸增高，試驗(yàn)R2、R3組顯著高于D組（P＜0.05）；血清中TNF-α的含量無明顯變化規(guī)律，試驗(yàn)R3組顯著高于D組（P＜0.05）；血清中IL-6的含量增高，試驗(yàn)R1、R2、R3組均高于D組（P＞0.05）。張羽[16]研究表明，鼠李糖乳桿菌能夠提高宿主免疫力，它能夠調(diào)節(jié)斑馬魚腸道組織免疫因子的表達(dá)，提高斑馬魚的攻毒保護(hù)率，這與本研究鼠李糖乳桿菌能提高機(jī)體免疫力的試驗(yàn)結(jié)論是相一致的。這說明飼料中添加適宜鼠李糖乳桿菌可通過促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)來提高機(jī)體的特異性免疫，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力。

動(dòng)物機(jī)體內(nèi)存在酶類和非酶類清除機(jī)制的抗氧化系統(tǒng)。SOD是重要的抗氧化酶之一，能夠清除機(jī)體內(nèi)的自由基，防止生物分子損傷[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著鼠李糖乳桿菌添加水平的增加，加州鱸肝臟中SOD的酶活性逐漸增高，試驗(yàn)R1、R2、R3組均顯著高于D 組（P＜0.05）；加州鱸肝臟CAT 酶活性逐漸增加，試驗(yàn)R2、R3組均顯著高于D組(P＜0.05)；加州鱸肝臟中GSH-Px 的酶活逐漸增加，試驗(yàn)R1、R2、R3 組均顯著高于D組（P＜0.05）。黃燕華等[18]研究發(fā)現(xiàn)在奧尼羅非魚的飼料中添加鼠李糖乳桿菌，可以顯著提高血清中的抗超氧陰離子自由基能力和溶菌酶活性，提高奧尼羅非魚免疫、抗氧化能力，因此本研究結(jié)論也證實(shí)了鼠李糖乳桿菌能提高機(jī)體抗氧化能力。MDA是脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)的最終產(chǎn)物，MDA 的含量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著飼料中鼠李糖乳桿菌添加水平的增加，MDA的含量逐漸降低，試驗(yàn)R3組顯著低于對(duì)照D組（P＜0.05）；加州鱸肝臟GPT活性逐漸降低，試驗(yàn)R2、R3 組顯著低于對(duì)照D 組（P＜0.05）；加州鱸肝臟GOT 活性逐漸降低，試驗(yàn)R1、R2、R3 組均顯著低于D 組（P＜0.05）。周曉波等[20]研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加鼠李糖乳桿菌可以顯著提高羅非魚魚體粗蛋白、血清三酰甘油、葡萄糖含量，顯著降GPT活性。這說明在飼料中添加適宜水平的鼠李糖乳桿菌可以提高加州鱸的抗氧化功能，減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷。

魚類對(duì)食物消化與吸收主要靠腸道消化酶的消化，魚類腸道消化酶活性可以在一定程度上反映其消化能力[21-22]。通過消化酶的分泌促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，同時(shí)提高其飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而降低飼料系數(shù)，改善魚體的生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)研究表明，試驗(yàn)R1、R2、R3 組的淀粉酶活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性均顯著高于D 組(P＜0.05)，且試驗(yàn)組加州鱸的增重率、特定生長(zhǎng)率和成活率明顯高于D組，飼料系數(shù)與對(duì)照組相比明顯降低。李利等[23]研究表明，在飼料中添加乳酸菌制劑可以提高鯉魚生長(zhǎng)性能和腸道淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，與本研究結(jié)論相一致，說明鼠李糖乳桿菌的添加可以提高加州鱸的生長(zhǎng)性能和腸道消化酶活性。

腸道菌群的組成對(duì)機(jī)體免疫力、腸道的屏障功能和腸道的消化吸收也有非常重要的作用。有研究表明，鼠李糖乳桿菌能夠改變斑馬魚腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成，對(duì)宿主免疫力具有一定的影響[16]。陳營(yíng)等[24]在牙鲆稚魚中投喂鼠李糖乳桿菌P15后，牙鲆腸道中的乳酸菌數(shù)上升，且腸道中的弧菌下降明顯。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加鼠李糖乳桿菌可以明顯提高加州鱸血清免疫能力，提高肝臟抗氧化能力，增強(qiáng)加州鱸的生長(zhǎng)性能和腸道消化酶活性，提高腸道菌群的多樣性水平。試驗(yàn)表明，加州鱸飼料中添加8%鼠李糖乳桿菌較為合適，關(guān)于飼料中添加鼠李糖乳桿菌對(duì)加州鱸影響的更深層次機(jī)理，有待進(jìn)一步研究。