包膜蛋氨酸對松浦鏡鯉生長性能、腸道消化酶和肌肉氨基酸組成的影響

■趙靜怡 楊 欣 徐奇友

（湖州師范學院生命科學學院，水生動物繁育與營養(yǎng)國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室，浙江湖州 313000）

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展，魚粉的需求量和價格急劇攀升。為降低飼料成本，在飼料配方中愈來愈多使用價格低廉的植物蛋白替代魚粉。蛋氨酸（Met）是豆粕、花生粕、次粉、玉米蛋白粉等植物蛋白源的限制性氨基酸[1]，隨著植物蛋白源添加水平的提高，飼料中的氨基酸組成的不平衡越來越明顯，Met缺乏會影響蛋白質(zhì)在魚體中的轉(zhuǎn)化效率，進而抑制生長[2-3]。因此在提高植物蛋白源添加量的同時，為了保證水產(chǎn)動物的生長性能，在配方中添加外源Met來滿足水產(chǎn)動物的需求。

在水產(chǎn)動物飼料中添加Met 的主要形式有：LMet、DL-Met及蛋氨酸羥基類似物[4-7]。但是晶體氨基酸的效果因魚種類不同呈現(xiàn)差異較大。鮭鱒魚可以有效利用晶體Met[8-9]，鯉魚（Cyprinus carpio）、鯽魚（Carassiusauratus gibelio）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）[10-12]不能有效利用外源性晶體氨基酸，主要原因推測為晶體氨基酸在無胃魚的腸道中吸收過快，不能與來自飼料內(nèi)的氨基酸同步吸收，從而導(dǎo)致利用效果不佳。對晶體氨基酸進行緩釋處理（包膜或微膠囊）可以提高晶體氨基酸的有效利用。已有研究表明，穩(wěn)定化處理的Met 可以顯著提高建鯉腸道和肝胰臟的胰蛋白酶活性和脂肪酶活性[13]。作為蛋白質(zhì)翻譯的初始氨基酸，Met是控制蛋白質(zhì)合成代謝的限速氨基酸[14-15]。消化及代謝的改變會影響蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物在機體內(nèi)的沉積。已有研究表明，在鯉機體內(nèi)，Met多用于營養(yǎng)物質(zhì)的儲備，其水平對鯉魚肌肉中7種氨基酸的合成有顯著影響[16]。水產(chǎn)動物肌肉氨基酸含量影響著水產(chǎn)動物的生命活動，同時魚類作為食品也影響著人體必需氨基酸的攝入。因此，本試驗旨在探究包膜Met對松浦鏡鯉生長性能、腸道消化酶活性和肌肉氨基酸組成的影響，為進一步探索包膜和晶體Met在鯉魚飼料中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

本試驗使用市售晶體DL-Met，包膜DL-Met 為實驗室自制。根據(jù)鯉魚營養(yǎng)需要[17]，以魚粉、棉粕、菜籽粕和豆粕為蛋白源，以魚油、豆油、大豆磷脂為脂肪源配制成基礎(chǔ)飼料。以本課題組前期對鯉魚Met需求量研究（Met 為0.90%）為基礎(chǔ)[18]，本試驗對照組中添加0.4%晶體Met，試驗組中分別添加0、0.2%和0.4%包膜Met（B0、B2、B4 組），配制成4 種等氮等脂飼料。Met 的實際含量分別為0.96%、0.56%、0.75%和0.92%。將飼料原料過60 目篩，礦物質(zhì)預(yù)混料過80 目篩，按比例稱重后依次混勻，加入約20%水充分混勻，使用制粒機制成直徑3 mm 飼料顆粒，風干機常溫風干，貯存于-20 ℃冰箱。試驗飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼料配方及營養(yǎng)水平

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

使用室外循環(huán)水系統(tǒng)進行養(yǎng)殖試驗，養(yǎng)殖桶裝水量為500 L。試驗用魚為松浦鏡鯉，自中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所購入，試驗開始前馴化2周。挑選360 尾規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯的松浦鏡鯉幼魚，體重（8.25±0.78）g，隨機放養(yǎng)在12 個養(yǎng)殖桶中，隨機選取每3 個養(yǎng)殖桶為1 個試驗組。每天人工投飼3 次（8：30、12：30、17：30），以飽食投喂。試驗期間，定期更換曝氣自來水，清潔養(yǎng)殖桶，保持水質(zhì)穩(wěn)定，水溫為24～29 ℃，溶氧5.0～8.0 mg/L，亞硝酸鹽＜0.05 mg/L，氨氮＜0.1 mg/L，養(yǎng)殖期為8周。

1.3 樣品采集與指標測定

養(yǎng)殖期結(jié)束后，對每個養(yǎng)殖桶內(nèi)的魚計數(shù)、稱重，用于計算增重率（weight gain rate，WGR）、特定生長率（specific growth rate，SGR）、飼料系數(shù)（feed conversion ratio，F(xiàn)CR）和蛋白質(zhì)效率（protein efficiency ratio，PER）。在每個養(yǎng)殖桶中隨機挑選16 尾魚，使用MS-222（100 mg/L）麻醉后，其中4尾魚用于全魚營養(yǎng)成分測定。采用直接干燥法（GB/T 6435—2014）測定全魚和飼料水分含量；杜馬斯定氮儀測定粗蛋白含量；索氏抽提法（GB/T 6433—2006）測定粗脂肪含量；馬弗爐灼燒法（GB/T 6438—2007）測定粗灰分含量；干物質(zhì)含量通過水分含量計算得出。

另取12 尾魚放置于冰盤上解剖，取下左右側(cè)背肌，同時迅速取出內(nèi)臟團，將腸道分離。每4 尾魚的肌肉和腸道混為1 個樣品，腸道和肌肉樣品貯存于-20 ℃用以測量腸道消化酶活性和肌肉氨基酸含量。將腸道的組織樣品用0.86%生理鹽水制成10%的組織勻漿液，2 500 r/min 離心取上清液后，分裝于2 mL 離心管存于-20 ℃冰箱中備用。腸道的胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性采用南京建成生物工程研究所有限公司提供的試劑盒，并通過UV-3200紫外分光光度計測定。

肌肉氨基酸含量采用酸水解法：將肌肉鮮樣品搗碎制成肉糜，稱取200 mg樣品，加6 mol/L鹽酸溶液在110 ℃條件下水解24 h后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶定容，取2 mL離心后，取200 μL上清液，使用氮吹儀吹干后加入2 mL 0.02 mol/L 鹽酸溶液并混勻，使用0.22 μm針式濾膜過濾后，取1 mL 于進樣瓶中，通過日立L-8900氨基酸分析儀測定。

1.4 計算公式

WGR（%）＝[（Wt-W0）/W0]×100

SGR（%/d）=100×（lnWt-lnW0）/d

FCR=Wf/（Wt-W0）

PER=（Wt-W0）/（Wf×Pf）

必需氨基酸指數(shù)（EAAI）=（a/A×b/B×……×i/I）（1/n）

式中:Wt——試驗?zāi)~重（g）；

W0——初始魚重（g）；

Wf——飼料攝取量（g）；

Pf——飼料蛋白質(zhì)含量（%）；

n——必需氨基酸數(shù)量；

a、b、…、i——松浦鏡鯉肌肉中必需氨基酸含量（mg/g）；

A、B、…、I——標準蛋白質(zhì)必需氨基酸含量[19]（mg/g）；

d——試驗天數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

使用IBM SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA），并采用Duncan’s 法進行多重比較，以P＜0.05 為顯著性差異標準，試驗結(jié)果用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 包膜Met對松浦鏡鯉生長性能的影響（見表2）

如表2所示，與對照組相比，B2、B4組的特定生長率、增重率、蛋白質(zhì)效率和飼料系數(shù)均沒有顯著性差異（P＞0.05），B0 組的增重率和蛋白質(zhì)效率顯著降低（P＜0.05），飼料系數(shù)顯著增加（P＜0.05），特定生長率沒有顯著性差異（P＞0.05）。B2組和B4組之間的增重率、特定生長率、飼料系數(shù)和蛋白質(zhì)效率沒有顯著性差異（P＜0.05）。與B2組和B4組相比，B0組的飼料系數(shù)顯著提高（P＜0.05），特定生長率、增重率和蛋白質(zhì)效率顯著降低（P＜0.05）。

2.2 包膜Met對松浦鏡鯉體成分的影響（見表3）

表3 包膜Met對松浦鏡鯉體成分的影響(%)

如表3所示，松浦鏡鯉的水分、粗脂肪、粗灰分含量在各組間均無顯著差異（P＞0.05）。與對照組相比，B2組的粗蛋白顯著降低（P＜0.05），B0組和B4組無顯著差異（P＞0.05），但B4 組的魚體粗蛋白含量顯著高于B2組和B0組（P＜0.05）。

2.3 包膜Met對松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響（見表4）

如表4 所示，胰蛋白酶活性各組間無顯著差異（P＞0.05）。與對照組相比，B0 組的淀粉酶活性顯著升高（P＜0.05）。隨包膜Met 添加量的增加，淀粉酶活性逐漸降低，B4 組與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于B0 組（P＜0.05）。B4 組的脂肪酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），B0、B2 組較對照組無顯著差異。

表4 包膜Met對松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響

2.4 包膜Met對松浦鏡鯉肌肉氨基酸組成的影響（見表5）

如表5所示，在松浦鏡鯉肌肉中共檢測出17種氨基酸，包括9種魚類必需氨基酸和8種非必需氨基酸，未檢測色氨酸。各組間肌肉必需氨基酸、非必需氨基酸、總氨基酸含量以及必需氨基酸指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05），但隨包膜Met添加量的增加，肌肉中總必需氨基酸、必需氨基酸指數(shù)、總非必需氨基酸和總氨基酸含量呈增加的趨勢。

表5 包膜Met對松浦鏡鯉肌肉氨基酸含量的影響(濕重基礎(chǔ)，mg/g)

3 討論

3.1 包膜Met對松浦鏡鯉生長性能的影響

近年來，Met作為信號分子，調(diào)節(jié)動物生長和代謝的作用已在體外和體內(nèi)的試驗得到廣泛證明[20-21]。一些研究表明，飼料中缺乏Met會導(dǎo)致細胞生理和功能失調(diào)[22-23]。作為膳食營養(yǎng)素傳感器的營養(yǎng)感應(yīng)信號通路在控制身體生長性能方面起著至關(guān)重要的作用[24]。Met可以激活魚類生長激素胰島素樣生長因子信號通路，上調(diào)雷帕霉素靶蛋白，抑制氨基酸反應(yīng)信號，從而提高營養(yǎng)代謝水平，提高生長性能。在本試驗中，與飼喂0.4%晶體Met 飼料的鯉魚相比，飼喂未添加Met飼料的鯉魚增重率、蛋白質(zhì)效率顯著降低，飼料系數(shù)顯著提高，這與大口黑鱸（Micropterus salmoides）[25]和軍曹魚（Rachycentron canadum）[26]喂食限制性Met 飼料的特定生長率、增重率、蛋白質(zhì)效率顯著降低的研究結(jié)果一致。飼喂0.2%和0.4%包膜Met 飼料的鯉魚的增重率、特定生長率、蛋白質(zhì)效率和飼料系數(shù)無顯著差異，但0.2%包膜Met組的增重率有升高趨勢。這與關(guān)于肥育藍斑鯰（Astyanax altiparanae）[27]、非洲鯰魚（Clarias gariepinus）[28]、軍曹魚[29]的研究一致，進一步證實了Met 對魚類生長性能的重要調(diào)節(jié)作用。本試驗中，對照組即0.4%晶體Met組，與0.2%和0.4%包膜Met組的增重率、蛋白質(zhì)效率和飼料系數(shù)均無顯著差異，特定生長率略低于0.2%包膜Met組，無顯著差異。這說明在本試驗中，0.4%晶體Met對鯉魚生長性能的影響可達到0.2%包膜Met的水平。這與陳丙愛等[10]在鯉魚試驗中飼喂晶體Met 飼料組的增重率略低于飼喂同水平包膜Met飼料組，且無顯著差異的研究結(jié)果一致。

本試驗中采用飽食投喂，此外，飼料長時間留存于養(yǎng)殖桶底部，可能造成了飼料在水中部分溶失，從而導(dǎo)致飼料系數(shù)整體過高。與0.4%晶體Met組相比，未添加Met 組顯著提高了飼料系數(shù)，由此可見，鯉魚可以利用飼料中晶體氨基酸提高其生長性能，但對包膜Met的利用效果更優(yōu)，0.2%包膜Met可達到0.4%晶體Met的水平。

3.2 包膜蛋氨酸對松浦鏡鯉體組成的影響

Met 作為必需氨基酸，它不但是參與蛋白質(zhì)合成的基石，也是參與調(diào)節(jié)新陳代謝、免疫和生殖的信號分子[30]。Met 參與調(diào)節(jié)IGF-Ⅰ和氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白mRNA 的表達[31-33]，調(diào)節(jié)TOR 信號通路，影響虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）[34-35]和大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）[36]肌肉蛋白質(zhì)的合成。張滿隆等[37]的研究表明，低魚粉飼料中添加0.25%Met，與未添加組相比，鯽魚全魚粗蛋白略提高，粗脂肪略降低。冷向軍等[38]的研究表明，晶體Met 對羅非魚（Oreochromis mossambicus）的肌肉水分含量有降低趨勢，晶體Met 和包膜Met均顯著降低了肌肉粗脂肪含量。程龍等[18]的研究表明Met顯著降低了松浦鏡鯉肌肉水分含量，提高了肌肉粗蛋白含量。本試驗研究表明，0.4%晶體氨基酸組魚體的水分含量最低，隨著包膜Met 添加量的增加，松浦鏡鯉魚體水分含量呈現(xiàn)下降趨勢，這與冷向軍等[38]在羅非魚、陳丙愛等[10]在鯉魚上的研究結(jié)果一致。與不添加包膜或晶體Met及添加0.2%包膜Met組相比，飼料中添加0.4%包膜Met顯著提高松浦鏡鯉幼魚的粗蛋白含量，這與程龍等[18]在松浦鏡鯉上的研究結(jié)果一致，體成分分析和生長性能均證明鯉魚可以利用晶體Met，但包膜Met的利用效果優(yōu)于晶體Met。

3.3 包膜蛋氨酸對松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響

飼料中Met缺乏會顯著降低魚類的生長性能，使得飼料利用率下降[39]，而飼料利用率低下可能由于魚類腸道中飼料的消化效率低導(dǎo)致的，這取決于魚類的消化和吸收能力。消化酶包括胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，其活性對腸道消化和吸收能力有重要影響[40]。大量研究表明Met 可以提高消化酶活性從而促進魚類生長。段晶等[41]研究表明，隨著Met添加量增加，洛氏鱥（Rhynchocypris lagowskii）前、中、后腸和肝胰腺中的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力均呈先升高后降低的趨勢。而緩釋處理的Met與晶體Met相比對腸道消化能力具有更強的促進作用。彭艷等[13]研究表明，穩(wěn)定化處理的Met較未穩(wěn)定化處理的Met顯著提高了建鯉腸道和肝胰臟的胰蛋白酶活性和脂肪酶活性。本試驗中，各組胰蛋白酶活性無顯著差異。隨著Met水平的提高，脂肪酶活性不斷提高，且同等水平下包膜Met的脂肪酶活性顯著高于晶體Met。本試驗中不添加Met 顯著提高了腸道淀粉酶活性，且隨著Met 水平上升，淀粉酶活性呈下降趨勢。這與段晶等[41]、程龍[42]的結(jié)果相一致，高劑量添加Met 導(dǎo)致淀粉酶活性下降。淀粉酶是嗜酸性酶，推測Met添加量可能影響了腸道pH，有待進一步研究。

3.4 包膜蛋氨酸對松浦鏡鯉肌肉氨基酸組成的影響

Met 攝入量在魚體內(nèi)除影響營養(yǎng)物質(zhì)的積累外，對于確保甲基化反應(yīng)中活性甲基的高合成也必不可少。對大西洋鮭（Salmo salar）[43]的研究表明，隨著Met攝入量的提高，肝臟轉(zhuǎn)硫率提高，牛磺酸的產(chǎn)量上升，使得各水平Met組肝臟中的游離Met保持恒定。本試驗中背肌水解氨基酸均無顯著差異，推測由于Met攝入量相差范圍較小，鯉魚體內(nèi)通過提升轉(zhuǎn)硫率，?；撬岬漠a(chǎn)量上升，游離Met 保持恒定，導(dǎo)致在鯉魚背肌中的氨基酸沉積無顯著差異。人體的必需氨基酸包括賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等8種。在本試驗中，鯉魚背肌中的該8種氨基酸均隨Met水平升高而呈上升趨勢，各組必需氨基酸指數(shù)無顯著差異，且均大于0.95[44]，證明松浦鏡鯉是優(yōu)質(zhì)蛋白食物。

除酪氨酸外，各氨基酸含量均隨Met水平升高而升高，而0.4%包膜Met 組的酪氨酸含量較0.2%包膜Met 組有下降趨勢，無顯著差異。張玲等[16]在鯉魚上的研究中也得到了相似的結(jié)果，即肌肉中的氨基酸含量隨Met 水平升高呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢。推測在滿足肌肉蛋白質(zhì)合成后，進一步提高Met添加量可能會導(dǎo)致氨基酸平衡被破壞，致使其他氨基酸在肌肉中的合成利用下降[45-46]。由于本試驗Met添加量變化范圍與鯉魚實際Met需求量相差不大，因此未產(chǎn)生顯著差異。

4 結(jié)論

①添加晶體和包膜Met可提高鯉魚的生產(chǎn)性能。

②綜合生長性能、消化酶活性及肌肉氨基酸含量分析得出，包膜Met 添加量為0.2%可達到晶體Met 0.4%的效果。