嗜黏蛋白阿克曼氏菌對脂肪肝蛋雞生產(chǎn)性能、脂代謝、肝臟炎癥及腸道健康的影響

■魏福曉 和藝云 張美紅 楊新月 胡永飛 劉 丹

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

蛋雞脂肪肝出血綜合征是營養(yǎng)和代謝疾病的肝臟表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制與人類非酒精性脂肪肝相似，包括體重增加，肝脂、腹脂過度積累，嚴(yán)重肝脂肪變性，炎癥反應(yīng)等[1]，其發(fā)生與營養(yǎng)、遺傳、內(nèi)分泌、環(huán)境等諸多因素有關(guān)[2]。脂肪肝是蛋雞中常見的病理現(xiàn)象，并且在沒有外部刺激的正常衰老過程中，成年蛋雞也可能形成脂肪肝[3]。當(dāng)?shù)半u出現(xiàn)脂肪肝時(shí)，脂質(zhì)過氧化引起機(jī)體氧化應(yīng)激，進(jìn)一步引發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)[4]，導(dǎo)致肝臟合成卵黃前體物質(zhì)的能力下降，影響卵泡發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)的下降[5]，給蛋雞行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此對蛋雞的脂肪肝進(jìn)行預(yù)防和治療，減輕肝臟炎癥反應(yīng)，改善蛋雞腸道健康對降低蛋雞死亡率、提高蛋品質(zhì)至關(guān)重要。

近年來腸道微生物作為脂肪肝發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵組成部分引起人們的關(guān)注[6]。靶向腸道微生物群的嘗試已經(jīng)在脂肪肝治療中取得一些成功[7-8]。作為腸道微生物的重要成員之一，嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila，A.muciniphila）由于可以通過調(diào)控脂代謝[9-11]、增強(qiáng)腸道屏障功能[12-13]、降低炎性因子水平[14-15]等途徑在宿主肥胖、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病中發(fā)揮作用，被認(rèn)為是繼乳酸菌、雙歧桿菌之后的下一代益生菌[16]。然而，目前A.muciniphila益生菌作用的研究主要集中在人和小鼠上，關(guān)于補(bǔ)充A.muciniphila對畜禽，尤其是對蛋雞脂肪肝和蛋品質(zhì)影響的信息很少。因此，本試驗(yàn)利用高能低蛋白日糧建立蛋雞脂肪肝模型，來研究A.muciniphila對脂肪肝蛋雞生產(chǎn)性能、肝脂代謝、肝臟炎癥和腸道健康的影響，為A.muciniphila在蛋雞生產(chǎn)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1A.muciniphila菌懸液的制備

標(biāo)準(zhǔn)菌株A.muciniphila（ATCC BAA835）購于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。活化后在改良GAM液體培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）中37℃厭氧（10% H2，10% CO2，80% N2，DG250厭氧工作站）培養(yǎng)48h。將菌體培養(yǎng)液8000r/min離心10min，去上清，用含20%甘油的無菌厭氧磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer saline,PBS）重懸，-80℃冰箱保存，使用前將菌液用無菌厭氧PBS稀釋至3.5×108CFU/mL（甘油終濃度為2%），并在37℃水浴鍋中活化后備用。滅活A(yù).muciniphila制劑在重懸后進(jìn)行70℃加熱30min的巴氏殺菌處理[17]。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選用28周齡體重[（2.01±0.10）kg]相近的海蘭褐蛋雞60只，隨機(jī)分為3組，每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只雞。試驗(yàn)全期用玉米-豆粕型高能低蛋白日糧誘導(dǎo)蛋雞脂肪肝模型[18]，飼料配方參考NY/T33—2004制定，其中能量12.92MJ/kg、粗蛋白13%，添加7.25%的豬油（日糧組成及營養(yǎng)水平見表1）?；罹幚斫M（HFD-LA組）每天灌胃5mLA.muciniphila活菌懸液，滅活菌處理組（HFD-PA組）每天灌胃5mLA.muciniphila巴氏滅活菌懸液，高脂對照組（HFD組）每天灌胃5mL無菌PBS。試驗(yàn)包括1周預(yù)試期和18周正試期。試驗(yàn)蛋雞采用三層階梯式籠養(yǎng)，每天光照時(shí)間為16h，雞舍溫度保持在18～25℃，試驗(yàn)期間自由采食和飲水。試驗(yàn)所有程序經(jīng)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利及使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 試驗(yàn)日糧組成和營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3指標(biāo)測定及方法

1.3.1生產(chǎn)性能指標(biāo)

正試期以重復(fù)為單位，每天統(tǒng)計(jì)產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、畸形蛋個(gè)數(shù)及重量；觀察雞的狀態(tài)，是否有病雞、死雞；根據(jù)試驗(yàn)記錄計(jì)算各組的平均產(chǎn)蛋率、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比。

1.3.2 蛋品質(zhì)指標(biāo)

正試期第18周末，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選1枚當(dāng)日新鮮雞蛋樣品，用蛋品質(zhì)自動(dòng)分析儀（DET-6000, NABELCo., Ltd., 日本）測定蛋重、蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度、哈夫單位、蛋黃顏色；蛋殼厚度測定儀（TI-PVX, Orka Technology Ltd.，以色列）測定蛋殼厚度；游標(biāo)卡尺測定雞蛋的縱徑與最大橫徑，計(jì)算蛋形指數(shù)；分蛋器分離蛋黃并稱重，計(jì)算蛋黃比。

1.3.3 肝脂代謝

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只蛋雞進(jìn)行頸靜脈放血屠宰后，取出肝臟拍照，快速收集肝臟組織樣，于液氮速凍后保存至-80 ℃超低溫冰箱中。

用氯仿-甲醇-水法從預(yù)先稱量的肝臟樣品中提取總脂質(zhì)，然后通過真空濃縮儀（CV200，北京吉艾姆科技有限公司）將提取的肝臟脂質(zhì)干燥，用含5% Triton（X-100）PBS 復(fù)溶，使用酶標(biāo)儀用商業(yè)試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）測量總膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）含量。

1.3.4 肝臟、回腸基因表達(dá)的測定

蛋雞屠宰后快速收集回腸組織樣，于液氮速凍后保存至-80 ℃超低溫冰箱中。用Trizol 法提取肝臟、回腸組織的RNA，并對RNA的濃度與質(zhì)量進(jìn)行檢測，用BeyoRT?ⅡcDNA合成試劑盒（with gDNA Eraser）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，BeyoFast?SYBR Green qPCR Mix（2X,Low ROX）試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，檢測肝臟炎性細(xì)胞因子NF-кB、IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)量；回腸腸道通透性相關(guān)基因ZO-1、Occludin、Muc2、Claudin2、Claudin3的表達(dá)量；回腸炎性細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β、IFN-γ、NF-кB的表達(dá)量以及回腸膽汁酸和短鏈脂肪酸受體FXR、FFAR2、FFAR3的表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（引物序列見表2）。

表2 目的基因引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019 初步整理后，使用SPSS Statistics 22.0 進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）后，再進(jìn)行Duncan’s 多重比較，P＜0.05 表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 A. muciniphila 對脂肪肝蛋雞生產(chǎn)性能的影響（見表3）

由表3可知，與HFD組相比，A.muciniphila活菌處理在蛋雞29～32 周和37～40 周顯著降低平均蛋重（P＜0.05）；但A.muciniphila干預(yù)對試驗(yàn)期各階段蛋雞的產(chǎn)蛋率、平均日采食量和料蛋比無顯著影響（P＞0.05）。

表3 A. muciniphila對脂肪肝蛋雞試驗(yàn)全期生產(chǎn)性能的影響

2.2 A. muciniphila 對脂肪肝蛋雞蛋品質(zhì)的影響（見表4）

由表4 可知，與HFD 組相比，A.muciniphila活菌和滅活菌干預(yù)均顯著提高雞蛋蛋白高度和哈夫單位（P＜0.05），顯著降低蛋黃顏色（P＜0.05）。對蛋重、蛋殼強(qiáng)度、蛋黃比、蛋殼厚度和蛋形指數(shù)沒有顯著影響（P＞0.05）。

表4 A. muciniphila對脂肪肝蛋雞蛋品質(zhì)的影響

2.3 A. muciniphila 對脂肪肝蛋雞肝臟脂質(zhì)含量的影響（見表5）

由表5 可見，與HFD 組相比，A.muciniphila活菌和滅活菌干預(yù)均顯著降低肝臟中三酰甘油（TG）的含量（P＜0.05），有降低總膽固醇（TC）的趨勢（P=0.059）。

表5 A. muciniphila對脂肪肝蛋雞肝臟脂質(zhì)含量的影響(mg/g)

2.4 A. muciniphila 對脂肪肝蛋雞肝臟炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響（見圖1、圖2）

從圖1可以看出，HFD組蛋雞的肝臟顏色明顯變淺且偏黃，形成了脂肪肝。而HFD-LA組和HFD-PA組的肝臟表面光滑，呈現(xiàn)正常的紅褐色，沒有出現(xiàn)明顯的病理變化。

圖1 肝臟解剖

由圖2 可知，與HFD 組相比，HFD-LA 組顯著降低肝臟中NF-κB、IL-1β和IL-6的表達(dá)（P＜0.05）；HFD-PA組組滅活菌處理顯著降低NF-κB和IL-1β的表達(dá)（P＜0.05）。A.muciniphila干預(yù)對肝臟中IFN-γ和TNF-α的表達(dá)無顯著影響（P＞0.05）。

圖2 A. muciniphila對脂肪肝蛋雞肝臟炎性因子表達(dá)的影響

2.5 A. muciniphila 對脂肪肝蛋雞回腸腸道通透性相關(guān)基因和炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響（見圖3、圖4）

由圖3可知，A.muciniphila滅活菌處理顯著降低蛋雞回腸Occludin、Muc2、Claudin3的表達(dá)（P＜0.05）。而A.muciniphila活菌干預(yù)對回腸腸道通透性相關(guān)基因的表達(dá)沒有顯著影響（P＞0.05）。由圖4可知，與HFD組相比，HFD-LA 組的回腸IFN-γ的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；HFD-PA組的TNF-α和IFN-γ的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。A.muciniphila干預(yù)對蛋雞回腸TGF-β和NF-κB的相對表達(dá)量無顯著影響（P＞0.05）。

圖3 A. muciniphila對脂肪肝蛋雞腸道通透性相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖4 A. muciniphila對脂肪肝蛋雞回腸炎性因子表達(dá)的影響

2.6 A. muciniphila 對脂肪肝蛋雞回腸膽汁酸和短鏈脂肪酸受體表達(dá)的影響（見圖5）

圖5 A. muciniphila對脂肪肝蛋雞回腸膽汁酸和短鏈脂肪酸受體表達(dá)的影響

由圖5 可知，A.muciniphila干預(yù)對蛋雞回腸膽汁酸受體FXR、短鏈脂肪酸受體FFAR2和FFAR3的相對表達(dá)量無影響（P＞0.05）。

3 討論

3.1 A. muciniphila 對脂肪肝蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響

蛋白高度和哈夫單位是評價(jià)雞蛋內(nèi)部品質(zhì)的重要指標(biāo)，哈夫單位越高，表示蛋清黏稠度越好，蛋清品質(zhì)越高[19]。在本研究中，A.muciniphila的添加雖然對蛋雞產(chǎn)蛋率無顯著影響，但可以通過提高蛋白高度和哈夫單位提高蛋品質(zhì)。隨蛋雞周齡的增長，雞蛋重量增加[20]，蛋殼厚度降低[21]，破殼蛋、軟殼蛋數(shù)量增加[22]，在本研究中，A.muciniphila活菌干預(yù)會(huì)降低蛋重，但對料蛋比無顯著影響，猜想A.muciniphila添加是否可以通過降低蛋重，提高老年蛋雞蛋殼質(zhì)量。目前關(guān)于A.muciniphila對蛋品質(zhì)的影響鮮有報(bào)道，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2 A.muciniphila對脂肪肝蛋雞肝臟脂質(zhì)含量的影響

肝臟是雞體內(nèi)脂肪酸從頭合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要部位，膳食脂肪可以通過乳糜微粒直接流入門靜脈系統(tǒng)增加肝臟的脂肪積累[23]。肝臟中TC和TG含量會(huì)影響脂質(zhì)的沉積，當(dāng)?shù)半u患有脂肪肝時(shí)，肝臟中TC、TG 水平會(huì)升高。研究表明，A.muciniphila的添加可以顯著降低肥胖小鼠的體重，血清、肝臟TC、TG水平降低，減少脂肪沉積[24-26]。有趣的是，近幾年研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)巴氏殺菌滅活處理后的A.muciniphila在肥胖方面表現(xiàn)出了與活菌相同的效果[17，27]。在本研究中A.muciniphila干預(yù)降低了肝臟中TC、TG的含量，與前人的研究結(jié)果一致，表明A.muciniphila可以改善脂肪肝蛋雞的脂代謝。

3.3 A. muciniphila對脂肪肝蛋雞肝臟炎癥的影響

在脂肪肝蛋雞體內(nèi)，肝臟會(huì)分泌大量的炎性細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6等，其中IL-1β和IL-6會(huì)阻礙肝臟中TG 的運(yùn)輸，從而加重脂肪肝[28]。NFκB是一種核受體，可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達(dá)[29-30]。A.muciniphila的補(bǔ)充可以減輕慢性低度炎性反應(yīng)，改善宿主代謝[14]。Shin 等[12]研究表明，A.muciniphila治療可以改善高脂飲食小鼠的糖耐量，增加杯狀細(xì)胞數(shù)量以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的百分比，還可以降低IL-1β和IL-6的水平。Kim 等[24]同樣也發(fā)現(xiàn)A.muciniphila可以降低脂肪肝小鼠肝臟中IL-6的表達(dá)。本試驗(yàn)中，A.muciniphila處理可以降低脂肪肝蛋雞肝臟中NF-κB、IL-1β和IL-6的表達(dá)，從而減輕肝臟炎癥，這與前人的研究結(jié)果一致。

3.4 A. muciniphila對脂肪肝蛋雞腸道健康的影響

腸道健康保障了機(jī)體的健康，對于維持蛋雞生產(chǎn)性能十分重要。Muc2是黏蛋白的主要成分，黏蛋白可以抑制病原菌進(jìn)入上皮細(xì)胞[31]。Occludin和Claudin3是緊密連接的重要組成部分，有益于上皮屏障功能[32-33]。之前的研究表明，通過補(bǔ)充A.muciniphila可以恢復(fù)高脂飲食小鼠產(chǎn)生黏液杯狀細(xì)胞的數(shù)量和密度[12]，A.muciniphila活菌治療還可以上調(diào)細(xì)胞緊密連接蛋白Ooccludin、Muc2、Claudin3等的表達(dá)，提高腸道屏障功能[13，27]。但在本研究中，A.muciniphila滅活菌處理降低了Occludin、Muc2、Claudin3的相對表達(dá)量，這與前人的研究結(jié)果相反，可能的原因是脂代謝紊亂蛋雞通過上調(diào)腸道屏障相關(guān)基因的表達(dá)來消除病原菌對腸道上皮的影響，補(bǔ)充巴氏滅活的A.muciniphila可能會(huì)降低病原菌數(shù)量、改善腸道健康狀況，減少Occludin、Muc2、Claudin3的過度激活。A.muciniphila活菌和滅活菌處理改善腸道屏障功能的效果不同，機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

研究表明，A.muciniphila豐度的增加可以降低腸道中IFN-γ、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平[34-36]，從而減輕腸道炎癥。在本研究中，A.muciniphila降低了脂肪肝蛋雞回腸TNF-α和IFN-γ的表達(dá)，從而改善腸道健康，這與上述研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，A.muciniphila補(bǔ)充可以提高脂肪肝蛋雞的蛋品質(zhì)，減輕肝臟炎癥，改善肝脂代謝及腸道健康，并且巴氏滅活處理后的A.muciniphila與活菌具有相似的作用效果，在貯存和添加方式方面具有更大的優(yōu)勢。本研究為A.muciniphila在蛋雞產(chǎn)業(yè)中預(yù)防和治療脂肪肝、提高蛋品質(zhì)的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。