檸檬醛抑菌特性及其緩釋制劑研究進(jìn)展

夏詩琪，鄧紹勇，范國榮，羅海，張?bào)K，陳尚钘，王宗德*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，國家林草局木本香料（華東）工程技術(shù)研究中心，國家林草局/江西省樟樹工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330045；2.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330032）

隨著化學(xué)殺菌劑的廣泛開發(fā)和使用，化學(xué)殺菌劑抗性問題越來越嚴(yán)重，化學(xué)殺菌劑的使用不當(dāng)容易造成生態(tài)環(huán)境的污染，殘留的殺菌劑會進(jìn)入食物鏈，對消費(fèi)者的健康造成嚴(yán)重危害[1-2]，因此許多國家限制其在谷物和食品中的應(yīng)用。近年來，許多植物源天然次生代謝產(chǎn)物被認(rèn)為是這些化學(xué)殺菌劑的替代品，認(rèn)為它們比合成產(chǎn)物更安全[3-5]。消費(fèi)者對高效、安全的天然產(chǎn)品的需求量逐漸增加。植物精油是植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，大多數(shù)的精油在抑菌方面起著重要的作用。因?yàn)橹参锞捅还J(rèn)是安全的，對致病性微生物產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)較低[6]，因此可以通過使用植物精油來預(yù)防細(xì)菌和真菌的感染，例如，香茅揮發(fā)油、姜揮發(fā)油等[7]有明顯的抑菌作用。

檸檬醛是山蒼子精油、檸檬草精油等的主要成分，是開鏈單萜類化合物最重要的代表之一。我國檸檬醛資源豐富，常作為香精香料添加劑使用；檸檬醛還具有抑菌、消炎等功能，對細(xì)菌、真菌的生長繁殖有很好的抑制作用。但是檸檬醛不穩(wěn)定、易分解且不溶于水，因此限制了其應(yīng)用范圍[8-9]。近年來，利用包埋技術(shù)將檸檬醛制備成緩釋制劑的研究越來越多，制備緩釋制劑可以提高檸檬醛的穩(wěn)定性，保護(hù)檸檬醛不受外界環(huán)境的影響，同時(shí)能起到緩釋的作用，延長作用時(shí)間，對拓寬檸檬醛的應(yīng)用范圍意義重大。

1 檸檬醛概述

檸檬醛（citral）又名 3，7-二甲基-2，6-辛二烯醛，分子式為C10H16O，無色或淡黃色液體，有檸檬香氣，無旋光性，有兩種順反異構(gòu)體，分別為檸檬醛a（香葉醛，反式檸檬醛）和檸檬醛b（橙花醛，順式檸檬醛），含量比例約為2∶3。

檸檬醛是開鏈單萜最重要的代表之一，難溶于水，可溶于乙醇、丙二醇、石油醚、乙醚、正己烷等有機(jī)溶劑，相對密度 0.891（25/25℃），沸點(diǎn) 228℃～229℃。檸檬醛廣泛存在于山蒼子、檸檬草、丁番羅勒等植物中，在我國通常是從山蒼子中提取天然檸檬醛，山蒼子精油中檸檬醛含量最高，可達(dá)到85%[10]。

由于檸檬醛具有濃郁的香氣，是一種風(fēng)味物質(zhì)，通常被制備成檸檬香精添加到飲料、糕點(diǎn)等食品中，從而起到調(diào)味增香的作用。檸檬醛在工業(yè)上是重要的中間體，可以用來合成維生素A、紫羅蘭酮等香料，廣泛應(yīng)用于制藥、香精香料等行業(yè)領(lǐng)域，市場需求持續(xù)增長，前景可觀[11-12]。此外，檸檬醛還是一種新型的抗菌防腐劑，對多種細(xì)菌和霉菌均有抑制作用，在日化行業(yè)也有相關(guān)應(yīng)用。

2 檸檬醛的抑菌研究

2.1 檸檬醛的抑菌活性

檸檬醛在山蒼子精油抑菌作用中占主導(dǎo)地位。雖然有研究表明山蒼子精油中的化學(xué)成分檸檬醛、芳樟醇、香茅醛等都具有抑菌作用，但是檸檬醛含量最高，王雪等[13]采用生長速率法和抑菌圈法比較了3種山蒼子精油對幾種細(xì)菌的抑菌活性，這3種精油來自不同品種的山蒼子，其化學(xué)成分有差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種山蒼子精油對目標(biāo)菌的抑制率大小均與檸檬醛的含量呈正相關(guān)性。因此檸檬醛是山蒼子精油成分中最適合開發(fā)成為植物源抑菌劑的主要成分。

具有抑菌活性的醛類化合物有檸檬醛、香茅醛、肉桂醛、枯茗醛等。在同類型的醛類化合物中，檸檬醛也表現(xiàn)出良好的抑菌性。魏娟[14]系統(tǒng)比較了檸檬醛和肉桂醛對接骨木鐮刀菌的作用情況，發(fā)現(xiàn)檸檬醛在孢子萌發(fā)、孢子細(xì)胞膜損傷、蛋白表達(dá)等方面的作用效果優(yōu)于肉桂醛。此外，醛類化合物復(fù)配能發(fā)揮比單一化合物更有針對性的抑菌功效，但是復(fù)配的比例需要研究。歐陽秋麗[15]的研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛+檸檬醛（體積比為1∶4）和肉桂醛+香茅醛（體積比為 5∶16）的組合可以抑制指狀青霉菌絲體的生長，肉桂醛+檸檬醛（體積比為1∶2）和肉桂醛+香茅醛（體積比為5∶16）的組合可以抑制酸腐病菌菌絲體的生長；楊柳等[16]研究天然植物醛酚類添加在飼料中的抑菌效果，結(jié)果表明，丁香酚、檸檬醛和肉桂醛質(zhì)量比為2∶1∶1時(shí)效果最佳。

大量研究表明檸檬醛對植物病原菌、食源性致病菌[17]、木腐真菌[18]以及霉菌[19]有抑制作用，具體抑菌情況見表1。其中檸檬醛在果蔬、糧食、飼料等領(lǐng)域防霉研究越來越多，檸檬醛可以通過改變菌絲形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)、破壞細(xì)胞完整性和細(xì)胞代謝途徑起到抑制青霉菌、曲霉菌、木霉菌的作用效果[20]。

續(xù)表1 檸檬醛的抑菌活性Continue table 1 Antibacterial activity of citral

2.2 檸檬醛的抑菌機(jī)理

目前，科研人員對檸檬醛的抑菌活性研究做了大量工作，主要集中在比較檸檬醛抑菌作用的強(qiáng)弱，關(guān)于檸檬醛抑菌機(jī)理的研究較少，處于初步探索階段。抑菌機(jī)理研究可以發(fā)現(xiàn)檸檬醛是怎樣作用于目標(biāo)菌，這對于檸檬醛抑菌產(chǎn)品的開發(fā)十分重要，對檸檬醛的抑菌機(jī)理進(jìn)行歸納總結(jié)后發(fā)現(xiàn)，檸檬醛抑菌機(jī)理并不是單一作用，而是多種方式共同作用的結(jié)果，主要包括破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性、影響核酸表達(dá)和蛋白質(zhì)合成、影響真菌細(xì)胞的能量電子轉(zhuǎn)移和呼吸代謝等方面[30]。

一是破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜是保護(hù)細(xì)胞活性的屏障，完整性被破壞后細(xì)胞無法正常運(yùn)轉(zhuǎn)[31]。可以通過測定細(xì)胞膜的相對滲透率來分析，郭丹等[27]的研究發(fā)現(xiàn)檸檬醛處理水稻紋枯病菌時(shí)，溶液的相對電導(dǎo)率變化明顯，說明檸檬醛對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜有破壞作用。用吸光度法測定胞外蛋白含量的變化是間接證明細(xì)胞壁（膜）被破壞的方法之一。此外，還有直接觀察的方法，魏娟[14]用熒光染料將目標(biāo)菌的孢子進(jìn)行染色處理。用流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)檸檬醛處理前后熒光強(qiáng)度判定孢子受損數(shù)目。以上通過改變細(xì)胞壁（膜）的通透性來達(dá)到抑菌的目的，還可以通過影響細(xì)胞壁幾丁質(zhì)酶的方式破壞細(xì)胞壁的完整性。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分，張翠榮[28]發(fā)現(xiàn)檸檬醛能通過上調(diào)幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)使稻瘟病菌的細(xì)胞壁被破壞。

二是影響核酸表達(dá)和蛋白質(zhì)合成。一方面檸檬醛是通過損害細(xì)胞的DNA，影響表達(dá)過程；另一方面檸檬醛是通過損傷細(xì)胞壁（膜）上的功能蛋白，使得蛋白分子非功能性聚集，細(xì)胞器失去正常結(jié)構(gòu)和功能[32]。羅曼[33]發(fā)現(xiàn)檸檬醛不僅能使黃曲霉孢子細(xì)胞質(zhì)膜受到損傷，還能增加磷酸二酯鍵斷裂頻率，從遺傳物質(zhì)水平上抑制孢子萌發(fā)的能力。此外，檸檬醛還能抑制真菌細(xì)胞膜的主要成分麥角固醇的合成，麥角固醇和細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞膜上物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)聯(lián)系緊密[34]。麥角固醇的合成涉及20多個(gè)反應(yīng)，檸檬醛能夠抑制麥角固醇合成途徑中的P450酶活性來達(dá)到抑制合成的目的。

三是影響真菌細(xì)胞的能量電子轉(zhuǎn)移和呼吸代謝。能量電子轉(zhuǎn)移和呼吸代謝是細(xì)胞維持正常生命活動(dòng)、賴以生存的代謝過程，檸檬醛可以通過破壞線粒體的結(jié)構(gòu)，間接降低細(xì)胞的能量代謝[35]，例如劉淼等[36]的研究發(fā)現(xiàn)檸檬醛處理酸腐菌后，其線粒體變形，嚴(yán)重的甚至破裂溶解。此外檸檬醛上的不飽和鍵可以與細(xì)胞酶特異性結(jié)合，從而抑制三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶的活性，影響循環(huán)中的電子傳遞，從而直接減少腺嘌呤核苷三磷酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的合成量，降低氧化還原能力，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。吳子健等[37]的研究發(fā)現(xiàn)檸檬醛通過抑制黃曲霉菌三羧酸循環(huán)中酶的活性來影響菌體能量代謝途徑，經(jīng)檸檬醛處理后，黃曲霉菌體內(nèi)的蘋果酸脫氫酶活力降低了29.2%（以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸為輔酶）和23.8%（以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶），琥珀酸脫氫酶的活力降低了27.1%。

3 檸檬醛緩釋制劑的研究進(jìn)展

檸檬醛具有不穩(wěn)定性，原因是其結(jié)構(gòu)中存在不飽和鍵，比如C=C鍵、C=O鍵等，容易發(fā)生氧化反應(yīng)、加成反應(yīng)等。有研究發(fā)現(xiàn)，檸檬醛在酸性環(huán)境中更容易降解，生成對-甲酚、對-甲基苯乙酮和對-傘花烴等化合物，這類化合物具有令人不愉快的氣味[38]。而大部分飲料都是偏酸性，檸檬醛的不穩(wěn)定性和酸性條件下易降解的特性限制了其在飲料和香料行業(yè)的應(yīng)用[39]。

檸檬醛難溶于水、易揮發(fā)、生物利用度不高，對溫度、陽光、空氣敏感，分解后易產(chǎn)生令人不愉快的氣味，在低溫下還會有結(jié)晶析出等。因此，研究如何改善檸檬醛在實(shí)際應(yīng)用上存在的問題，為檸檬醛的綜合開發(fā)應(yīng)用拓寬途徑，具有重要的研究意義。

研究表明，將檸檬醛制備成緩釋制劑能夠?qū)幟嗜┢鸬椒€(wěn)定、保護(hù)和緩釋的作用，主要表現(xiàn)在提高水溶性、拓寬應(yīng)用范圍、提高生物利用率，保護(hù)其活性成分避開與外界環(huán)境的接觸從而提高穩(wěn)定性，控制精油的釋放從而提高抑菌性能等[40]。制備緩釋制劑的技術(shù)方法主要有微膠囊技術(shù)、微乳液技術(shù)、納米乳液技術(shù)和脂質(zhì)體技術(shù)等，這些技術(shù)在增強(qiáng)精油的水溶性、維持其穩(wěn)定性及提高其生物利用率等方面應(yīng)用廣泛[41]。

3.1 檸檬醛微膠囊緩釋制劑

微膠囊技術(shù)是以活性物質(zhì)如精油成分為芯材，以高分子聚合物等為壁材的一種技術(shù)。在檸檬醛微膠囊制備過程中，壁材類型和制備方式等是影響微膠囊穩(wěn)定性和保留率的主要因素。目前，用來制備微膠囊的壁材多為殼聚糖、海藻酸鈉等容易吸水的物質(zhì)，在儲藏過程中會影響穩(wěn)定性。陳娟[42]采用復(fù)凝聚法和噴霧干燥法制備檸檬醛微膠囊，發(fā)現(xiàn)微膠囊在儲藏過程中會吸收水分導(dǎo)致粒徑、孔道、比表面積的增大，且芯材的成分也會發(fā)生變化，對甲苯酚、甲基苯乙酮、橙花醇等含量均有所升高，說明檸檬醛發(fā)生了一定程度的降解，這極有可能與微膠囊的變化有關(guān)。通過對壁材的改性，能夠提高檸檬醛的穩(wěn)定性。Yoplac等[43]的研究發(fā)現(xiàn)用酸改性的大米淀粉為壁材比麥芽糊精為壁材對檸檬醛的保留率更高。

微膠囊的制備方法有復(fù)凝聚法、單凝聚法、界面聚合法、原位聚合法、噴霧干燥法等。其中，噴霧干燥是制備微膠囊的常用方法，原理是利用噴霧裝置，將芯材和壁材混合成的乳狀液體制備成超細(xì)液滴，瞬間噴入高溫中，由于溫度過高，超細(xì)液滴表面的溶劑快速蒸發(fā)，形成固體粉末。邱碧寧等[44]利用羧甲基殼聚糖、甲基纖維素和海藻酸鈉為復(fù)合壁材，層層自主裝成功制備檸檬醛微膠囊，提高貯藏穩(wěn)定性。

目前將檸檬醛微膠囊化的研究較少。檸檬醛微膠囊的應(yīng)用主要集中在對大米[45]、鮮切刺嫩芽保鮮[46]、控制家禽壞死性腸炎[47]等方面。鮮切果蔬由于受到機(jī)械作用，切口容易滋生細(xì)菌，因此容易腐壞變質(zhì)、儲藏時(shí)間短，檸檬醛微膠囊能將檸檬醛緩慢釋放，達(dá)到長效抑菌保鮮的目的。王冰玉等[46]研究檸檬醛微膠囊對鮮切刺嫩芽的保鮮效果，結(jié)果表明檸檬醛微膠囊能從延緩水分、抑制酶褐變、抑制營養(yǎng)損失等方面保持鮮切刺嫩芽的顏色、硬度、新鮮度等。檸檬醛在體內(nèi)尤其是胃液酸性條件下消化代謝速度較快，檸檬醛緩釋制劑能減少檸檬醛在上消化道的消耗，在腸道中發(fā)揮抑制腸道致病菌的功能。腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌是導(dǎo)致壞死性腸炎的主要致病菌。楊玥熹[47]制備了檸檬醛微膠囊，其在模擬胃液中能較好地保留檸檬醛含量，同時(shí)還研究了檸檬醛微膠囊在肉雞養(yǎng)殖過程中對壞死性腸炎的控制效果，采用菌株感染模型，對肉雞生長過程中腸道食糜的產(chǎn)氣莢膜梭菌計(jì)數(shù)并觀察腸道黏膜形態(tài)，發(fā)現(xiàn)檸檬醛微膠囊對壞死性腸炎的抵抗力和飼用抗生素的效果相當(dāng)。

然而，檸檬醛微膠囊在包埋效果和應(yīng)用范圍方面存在一定的不足之處。如檸檬醛微膠囊尺寸通常是微米級，顆粒較大，難以適應(yīng)澄清度較高的應(yīng)用環(huán)境；由于微膠囊的壁材容易吸水導(dǎo)致表面溶脹，微膠囊的粒徑和比表面積都有所增大[48]。復(fù)合凝聚微膠囊對環(huán)境中的離子強(qiáng)度和pH值非常敏感，穩(wěn)定性容易受到環(huán)境的影響[49]。

3.2 檸檬醛微乳液和納米乳液緩釋制劑

微乳液由水、油、表面活性劑和助表面活性劑按一定比例混合而成，在混合均勻的過程中，不借助外界其他條件，自發(fā)形成，微乳液大多呈透明或半透明、粒徑在100 nm以內(nèi)[50]。檸檬醛微乳液制備的是水包油型，主要以乳化劑、多糖等為原料，常用的制備方法有低能乳化法、高壓均質(zhì)法和變相溫度法。微乳液技術(shù)可以改善檸檬醛的溶解性和提高抑菌效率，微乳液制備方法比較簡單，可通過攪拌混合、高壓均質(zhì)、微射流等強(qiáng)機(jī)械力裝置讓微粒更均勻，但是容易受到溫度、pH值、離子強(qiáng)度等環(huán)境因素的影響[51]。

納米乳液形成原理是由于兩種液體互不相容，導(dǎo)致其中一種液體以球狀小液滴的形式分散于另一種液體中而形成的分散體系，尺寸范圍為50 nm～1 000 nm[52]。徐婷[53]采用明膠和吐溫為乳化劑制備得到粒徑為476.73 nm的檸檬醛乳狀液，減緩了體系中的酸性物質(zhì)對檸檬醛的降解作用，結(jié)果表明該方法能明顯提高檸檬醛在酸性條件下的穩(wěn)定性。

微乳液與納米乳液最大的區(qū)別在于熱穩(wěn)定性不同，微乳液是熱力學(xué)穩(wěn)定體系，而納米乳液不穩(wěn)定[54]。研究發(fā)現(xiàn)，在納米乳液的制備過程中可以通過添加抗氧化劑等輔助物質(zhì)提高乳液的穩(wěn)定性，Yang等[55]研究幾種抗氧化劑對乳液中檸檬醛穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素和丹參酮具有強(qiáng)非極性，能提高乳液的儲存穩(wěn)定性。Zhao等[56]的研究發(fā)現(xiàn)輔酶Q10H2具有清除自由基的功能，能減少檸檬醛脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的生成，以提高穩(wěn)定性。徐婷[53]制備了檸檬醛納米乳狀液，在酸性環(huán)境中放置一段時(shí)間后，納米乳狀液中的檸檬醛含量損失較少，檸檬醛的降解產(chǎn)物的含量也較少，在納米乳狀液中加入異抗壞血酸和異抗壞血酸鈉能提高酸性條件下的穩(wěn)定性，40℃儲藏14 d后納米乳中的檸檬醛剩余量超過50%。馬磊等[57]用鷹嘴豆乳清蛋白作為乳化穩(wěn)定劑制備檸檬醛乳液，研究發(fā)現(xiàn)添加0.5%黃原膠能明顯增加乳液的穩(wěn)定性。李丹鳳[58]制備了檸檬醛固體脂質(zhì)納米粒，采用的是高剪切分散聯(lián)合高壓均質(zhì)法，制備過程中加入了抗氧化劑，研究表明添加β-胡蘿卜素和異抗壞血酸的樣品儲藏穩(wěn)定性較高，能很好地抑制對傘花烴和甲基苯乙酮的生成。

3.3 檸檬醛脂質(zhì)體緩釋制劑

脂質(zhì)體是一種由脂質(zhì)雙分子層組成的納米級球狀小囊泡[59]。脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層的結(jié)構(gòu)是磷脂分子的含磷或氮的親水性頭部朝外，磷脂分子的疏水性長烴基鏈尾部位于中間。相對于檸檬醛微膠囊、微乳液的研究，檸檬醛脂質(zhì)體的研究相對較少。陳沛洲[23]采用薄膜分散法結(jié)合高壓微射流均質(zhì)技術(shù)制備檸檬醛脂質(zhì)體，該檸檬醛脂質(zhì)體較穩(wěn)定，儲藏3周后能保留20%的初始檸檬醛含量。對大腸桿菌、意大利青霉菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用，且能有效抑制砂糖桔表面酵母和霉菌的生長，降低腐敗發(fā)生率。

脂質(zhì)體緩釋制劑存在一定的不足之處，對環(huán)境因素敏感，由于儲藏環(huán)境和運(yùn)輸顛簸等因素，易發(fā)生絮集和沉淀，從而導(dǎo)致其包裹的活性物質(zhì)泄漏[59]。為避免脂質(zhì)體因pH值和離子強(qiáng)度引起的磷脂水解和靜電屏蔽作用而發(fā)生蓄積、融合等現(xiàn)象，對脂質(zhì)體進(jìn)行修飾是有效的解決方法。殼聚糖是有效的修飾物，它能夠通過靜電吸附包覆在脂質(zhì)體表面，使得脂質(zhì)體帶正電，增強(qiáng)脂質(zhì)體之間的排斥力，從而提高脂質(zhì)體的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性[60]，阻止被包埋的活性成分泄露。殼聚糖是一種廣泛存在于自然界中的多糖，帶正電荷，具有很好的生物親和性，同時(shí)，殼聚糖是一種廣譜抑菌劑，能有效抑制多種細(xì)菌、真菌的生長繁殖和產(chǎn)毒能力[61]。殼聚糖作為脂質(zhì)體的修飾材料，在酸性條件下能質(zhì)子化，正電荷的殼聚糖能作用于目標(biāo)菌表面的黏膜，使包埋的活性物質(zhì)穿透黏膜提高抗菌性[62]，因此，能控制脂質(zhì)體中活性物質(zhì)的緩慢釋放從而起到長效抑菌的作用效果。

4 展望

國內(nèi)外學(xué)者對檸檬醛抑菌活性的研究，使人們充分認(rèn)識到檸檬醛在抑菌劑開發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用，檸檬醛在抑菌機(jī)理方面還有探索空間，對不同種類的病原菌的抑菌機(jī)理還需找到關(guān)鍵機(jī)制。檸檬醛是我國重要的食品添加劑和化工原料，對于檸檬醛的抑菌研究越來越受到關(guān)注，而如何利用檸檬醛的高效抑菌特性來開發(fā)相關(guān)抑菌產(chǎn)品是未來的研究方向之一。檸檬醛難溶于水、易分解、易揮發(fā)的性質(zhì)限制了對檸檬醛的研究和開發(fā)，為充分應(yīng)用檸檬醛的高效抑菌特性，應(yīng)該逐漸推進(jìn)對檸檬醛緩釋制劑的深入研究，包括包埋技術(shù)、穩(wěn)定性、緩釋性能等。檸檬醛抑菌活性和緩釋制劑的研究，對天然植物源抑菌劑的開發(fā)利用具有重要意義。