余甘子多酚純化工藝研究及組分分析

孟令志，王佳慧，王甄潔，孫晗，李云飛，張雅捷，夏寧，謝春陽(yáng)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130000）

余甘子又稱為庵摩勒、望果、久如拉等，是大戟科落葉灌木的干燥果實(shí)[1]，作為藥食同源的材料[2]，含有氨基酸[3-4]、油脂[5]、糖類物質(zhì)[6]、維生素[7]及多酚類物質(zhì)[8]。其中多酚類物質(zhì)包括沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子林鞣酸等[9-11]，具有抗癌、消炎、抗菌等作用。余甘子多酚經(jīng)超聲提取后，純度較低，對(duì)其后續(xù)研究影響較大，需進(jìn)行純化處理，而大孔樹脂作為吸附分離介質(zhì)，具有吸附性好、穩(wěn)定性高、可再生等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)脫色、活性物質(zhì)分離純化等領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用[12]。本試驗(yàn)采用大孔樹脂純化法，在6種大孔樹脂中篩選出對(duì)余甘子多酚純化效果良好的樹脂，并確定最佳吸附-解吸條件，對(duì)純化后的多酚采用高效液相色譜法測(cè)定具體成分及含量[13]。為工業(yè)化生產(chǎn)其多酚類物質(zhì)及成分分析提供參考。

1 材料與試劑

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮余甘子：福建惠安采摘園，采摘后立即運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)處理。

1.2 試驗(yàn)試劑

福林酚（分析純）：上海藍(lán)李科技發(fā)展有限公司；沒(méi)食子酸、無(wú)水乙醇（均為分析純）、甲醇（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；訶子林鞣酸、柯里拉京、鞣花酸（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司；X-5、D101、S-8型大孔樹脂：東鴻化工有限公司；AB-8型大孔樹脂：安徽皖樹化工銷售有限公司；D1400型大孔樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司；XAD-7HP型大孔樹脂：美國(guó)ROHM AND HAAS公司。

1.3 儀器與設(shè)備

U3000高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技公司；BS-100自動(dòng)部分收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司；PHS-25酸度計(jì)：上海理達(dá)儀器廠；層析柱（1.6 cm×20 cm）：上海亞榮生化儀器廠；CX-HL-20004F恒流泵：上海瓷熙儀器儀表有限公司；BSD-YX（F）3200立式智能精密搖床：上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 原料處理

運(yùn)用超聲波輔助法對(duì)余甘子多酚進(jìn)行提取，將濃縮后的提取液冷凍干燥，獲得余甘子多酚凍干粉，并對(duì)其多酚含量進(jìn)行測(cè)定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

余甘子多酚濃度使用福林酚法測(cè)定[14]，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 大孔樹脂預(yù)處理

使用無(wú)水乙醇對(duì) X-5、D-101、S-8、AB-8、D-1400、XAD-7HP大孔樹脂進(jìn)行活化，攪拌至無(wú)氣泡產(chǎn)生，靜置24 h使其活化充分后，用蒸餾水將樹脂中乙醇洗凈[15]。

2.4 大孔樹脂的篩選

稱取5 g大孔樹脂于錐形瓶中，加入2.5 mg/mL余甘子粗多酚溶液50 mL，置于搖床上靜態(tài)吸附24 h，測(cè)定上清液中多酚質(zhì)量濃度，按公式（1）、（2）計(jì)算吸附量、吸附率[16]。

吸附后的大孔樹脂表面殘留多酚使用蒸餾水洗凈，加入50 mL 85%乙醇溶液，置于搖床上靜態(tài)解吸24 h，測(cè)定上清液中多酚質(zhì)量濃度，按公式（3）計(jì)算解吸率[17]。

式中：Q為吸附量，mg/g；C0為吸附前多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附后多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為解吸后多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為多酚溶液體積，mL；V2為乙醇溶液體積，mL；m為樹脂質(zhì)量，g。

2.5 XAD-7HP大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸條件優(yōu)化

稱取XAD-7HP大孔樹脂5 g于錐形瓶中，分別加入 1、2、3、4、5 mg/mL 的余甘子多酚溶液 50 mL，置于搖床上靜態(tài)吸附，充分吸附后測(cè)定上清液中多酚質(zhì)量濃度，篩選最佳上樣液質(zhì)量濃度。

配制 pH 值為 2、3、4、5、6、7，質(zhì)量濃度為 4 mg/mL余甘子多酚溶液，稱取XAD-7HP大孔樹脂5 g于錐形瓶中，分別加入多酚溶液50 mL后，置于搖床上靜態(tài)吸附，充分吸附后測(cè)定上清液中多酚質(zhì)量濃度，篩選最佳上樣液pH值。

吸附后的XAD-7HP大孔樹脂使用蒸餾水將表面殘留多酚洗凈，分別加入55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液50 mL后，置于搖床上靜態(tài)解吸，充分解吸后測(cè)定上清液中多酚質(zhì)量濃度，篩選最佳解吸乙醇體積分?jǐn)?shù)。

配制 pH 值為 2、3、4、5、6、7、8、9、10 的乙醇溶液，重復(fù)上述步驟，篩選最佳解吸液pH值。

2.6 XAD-7HP大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸條件優(yōu)化

濕法裝柱XAD-7HP大孔樹脂于1.6 cm×20 cm的層析柱，將樣液分別以1、2、3、4、5mL/min速度通過(guò)恒流泵上樣，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液（5 mL/管），測(cè)定管中多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算泄漏點(diǎn)體積[18]，確定最佳上樣流速及上樣體積。達(dá)到平衡后，使用蒸餾水以相同流速洗柱直至無(wú)色，用苯酚硫酸法每50 mL測(cè)定多糖濃度，考察洗脫液體積。當(dāng)雜質(zhì)洗凈后，以 1、2、3、4、5mL/min 速度將解吸液注入層析柱中解吸，收集流出液（5 mL/管），測(cè)定流出液多酚質(zhì)量濃度，確定最佳解吸液流速。

2.7 余甘子多酚純度測(cè)定方法

稱取一定量的余甘子粗多酚凍干粉和經(jīng)過(guò)純化后的余甘子多酚凍干粉，配制成溶液按步驟計(jì)算余甘子多酚質(zhì)量濃度后，按公式（4）計(jì)算余甘子多酚純度。

式中：C0為多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；m 為凍干粉質(zhì)量，mg。

2.8 余甘子多酚組分分析

采用高效液相色譜法測(cè)定多酚組分，稱取0.01 g純化后的余甘子多酚凍干粉，甲醇為溶劑，定容于5 mL棕色容量瓶中，然后經(jīng)過(guò)C18固相萃取小柱，收集3 mL后的流出液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，加入棕色進(jìn)樣瓶，用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析測(cè)定余甘子多酚組分。以對(duì)照品色譜圖的保留時(shí)間為參考，進(jìn)行分析鑒定其中的有效成分，并通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算各組分的含量[19]。

色譜條件：Diamonsil C18色譜柱；柱溫30℃；總流速 1 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng) 270 nm；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.2%醋酸溶液。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用 Excel 2010、SPSS 17.0、Origin 2018及Design-Expert 8.0.6進(jìn)行分析及繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。回歸方程為y=104.050 0x+0.045 8，R2=0.999 3，線性關(guān)系良好。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

3.2 大孔樹脂的篩選結(jié)果

6種大孔樹脂對(duì)余甘子多酚的靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6種大孔樹脂對(duì)余甘子多酚的靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果Table 2 Static adsorption and desorption results of polyphenols from Phyllanthus emblica L.by six macroporous resins

由表2可以看出，S-8、XAD-7HP大孔樹脂的吸附效果較好，在解吸方面XAD-7HP的解吸效果明顯高于其余5種大孔樹脂，綜合考慮，余甘子多酚的純化材料選擇XAD-7HP大孔樹脂。

3.3 XAD-7HP大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸結(jié)果與分析3.3.1 余甘子多酚質(zhì)量濃度對(duì)吸附量的影響

余甘子多酚質(zhì)量濃度對(duì)吸附量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 余甘子多酚質(zhì)量濃度對(duì)吸附量的影響Fig.2 Effect of polyphenol concentration of Phyllanthus emblica L.on adsorption capacity

由圖2可知，隨著多酚質(zhì)量濃度的增加X(jué)AD-7HP大孔樹脂對(duì)余甘子多酚的吸附量呈先上升后下降的趨勢(shì)，余甘子多酚質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，大孔樹脂的吸附量最大為（30.18±0.12）mg/g，當(dāng)余甘子多酚的質(zhì)量濃度大于4 mg/mL時(shí)，吸附量降低，這是由于當(dāng)余甘子多酚質(zhì)量濃度過(guò)大時(shí)會(huì)在層析柱內(nèi)產(chǎn)生絮狀物沉淀，阻塞樹脂空隙，同時(shí)雜質(zhì)的含量也在增加，和余甘子多酚爭(zhēng)奪XAD-7HP大孔樹脂的活性位點(diǎn)；而低質(zhì)量濃度的余甘子多酚會(huì)使XAD-7HP大孔樹脂吸附活性降低。所以，XAD-7HP大孔樹脂對(duì)余甘子多酚進(jìn)行純化時(shí)選定質(zhì)量濃度為4 mg/mL最佳。

3.3.2 余甘子多酚溶液pH值對(duì)吸附量的影響

余甘子多酚溶液pH值對(duì)吸附量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 余甘子多酚溶液pH值對(duì)吸附量的影響Fig.3 Effect of pH value of Phyllanthus emblica L.polyphenol solution on adsorption capacity

由圖3可知，XAD-7HP大孔樹脂的吸附量隨著余甘子多酚溶液pH值的增大先增加后減少，當(dāng)余甘子多酚溶液pH值為3時(shí)，吸附量最大為（31.76±0.16）mg/g，而余甘子多酚多為酚酸類，在酸性條件下會(huì)以分子形式存在，利于XAD-7HP大孔樹脂對(duì)其吸附；多酚分子本身呈微極性，其極性會(huì)隨著pH值的不同而改變，從而影響其與XAD-7HP大孔樹脂之間的吸附作用。綜上所述，XAD-7HP大孔樹脂對(duì)余甘子多酚進(jìn)行純化時(shí)樣液的pH值為3最佳。

3.3.3 解吸液體積分?jǐn)?shù)對(duì)XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響

解吸液體積分?jǐn)?shù)對(duì)XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on desorption effect of XAD-7HP macroporous resin

由圖4可知，XAD-7HP大孔樹脂的解吸率與乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)95%時(shí)，解吸率最大為（90.47±0.97）%。這是因?yàn)殡S乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，溶劑的極性減小，與樹脂的極性更加相近，余甘子多酚越容易從樹脂上洗脫下來(lái)。綜上所述，對(duì)XAD-7HP大孔樹脂進(jìn)行解吸時(shí)所選乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為95%最佳。

3.3.4 解吸液pH值對(duì)XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響

解吸液pH值對(duì)XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響見(jiàn)圖5。

圖5 乙醇溶液pH值對(duì)XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響Fig.5 Effect of pH value of ethanol solution on desorption effect of XAD-7HP macroporous resin

由圖5可知，XAD-7HP大孔樹脂隨著乙醇溶液pH值的增加，解吸率先增大后減小，pH值為7時(shí)，解吸率達(dá)到最大為（90.61±0.97）%；當(dāng)乙醇溶液pH值大于7時(shí)，解吸率急速減小。造成此種現(xiàn)象一方面可能是在酸性條件下，溶液的極性較大，XAD-7HP大孔樹脂屬于弱極性，致使余甘子多酚不易脫離，導(dǎo)致解吸率較低；另一方面是在堿性條件下，余甘子多酚分子與堿發(fā)生反應(yīng)，致使多酚含量減少，解吸率降低。所以，對(duì)XAD-7HP大孔樹脂進(jìn)行解吸時(shí)所選乙醇溶液的pH值定為7最佳。

3.4 XAD-7HP大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸結(jié)果與分析

3.4.1 上樣流速對(duì)XAD-7HP大孔樹脂吸附效果的影響

上樣流速對(duì)XAD-7HP大孔樹脂吸附效果的影響見(jiàn)圖6。

圖6 不同流速的動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.6 Dynamic adsorption curves at different flow rates

樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附時(shí)，當(dāng)流出液中多酚質(zhì)量濃度為原液的10%時(shí)，定為泄漏點(diǎn)，即吸附終點(diǎn)，上樣液質(zhì)量濃度為4 mg/mL。由圖6可知，當(dāng)上樣流速分別為1、2、3、4、5 mL/min時(shí)，其泄漏點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)上樣體積分別在400、310、210、150、95 mL。上樣流速過(guò)快，使大孔樹脂對(duì)余甘子多酚的吸附不充分，降低吸附效果，而上樣流速過(guò)低，會(huì)增加試驗(yàn)周期。綜合以上因素，在XAD-7HP大孔樹脂對(duì)余甘子多酚進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附時(shí)上樣流速為2 mL/min最佳，此時(shí)最佳上樣體積為310 mL。

3.4.2 蒸餾水洗脫用量對(duì)除雜效果的影響

蒸餾水洗脫用量對(duì)除雜效果的影響見(jiàn)圖7。

圖7 水洗曲線Fig.7 Water washing curve

由圖7可知，隨著洗脫體積的增加多糖濃度減小，當(dāng)洗脫體積為200 mL時(shí)，層析柱中多糖基本被洗凈，而此時(shí)流出液也基本為無(wú)色，說(shuō)明未被吸附的余甘子多酚也被洗出。為了將未被吸附的余甘子多酚、多糖等雜質(zhì)清洗干凈，水洗體積定為300 mL。

3.4.3 解吸流速對(duì)XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響

解吸流速對(duì)XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響見(jiàn)圖8。

圖8 解吸流速對(duì)洗脫效果的影響Fig.8 Effect of desorption flow rate on elution effect

由圖8可知，在相同吸附條件下，隨著洗脫流速的增加，余甘子多酚洗脫峰越寬，拖尾現(xiàn)象越重，使得解吸效果變差。而過(guò)快的洗脫流速會(huì)導(dǎo)致XAD-7HP大孔樹脂上的余甘子多酚不能充分溶解，使得洗脫體積增加，造成資源浪費(fèi)。而洗脫流速過(guò)低會(huì)延長(zhǎng)試驗(yàn)周期，綜合考慮，對(duì)XAD-7HP大孔樹脂進(jìn)行解吸時(shí)，洗脫流速定為2 mL/min，而此時(shí)的洗脫體積為280 mL。

3.5 余甘子多酚純化結(jié)果與分析

經(jīng)顯色反應(yīng)，測(cè)得余甘子粗凍干粉中多酚純度為16.45%，經(jīng)上述工藝純化后多酚純度提高到60.67%，甘瑾等[20]使用NKA-II大孔吸附樹脂對(duì)余甘子多酚進(jìn)行純化，純化后多酚純度為36.08%，與其相比，XAD-7HP大孔樹脂能夠有效提高余甘子多酚純度。

3.6 高效液相色譜儀分析純化后余甘子多酚組分結(jié)果與分析

純化后余甘子凍干粉經(jīng)高效液相色譜分析，根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間，余甘子多酚樣品中均有相應(yīng)峰出現(xiàn)，具體見(jiàn)圖9、圖10。

圖9 混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜Fig.9 HPLC chromatogram of mixed standard

圖10 純化后余甘子多酚的HPLC色譜Fig.10 HPLC chromatogram of purified Phyllanthus emblica L.polyphenols

經(jīng)測(cè)定，樣品中標(biāo)準(zhǔn)品的含量分別為沒(méi)食子酸72.179 mg/g、柯里拉京35.443 mg/g、柯子林鞣酸42.731mg/g、鞣花酸38.652mg/g。合計(jì)占總多酚31.15%，為余甘子中主要多酚類物質(zhì)。

4 結(jié)論

研究比較了 X-5、D101、S-8、AB-8、D1400、XAD-7HP型大孔樹脂對(duì)余甘子多酚靜態(tài)吸附-解吸能力，篩選出XAD-7HP樹脂對(duì)余甘子多酚的純化效果最佳，并對(duì)其純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。最佳純化工藝為上樣液濃度4 mg/mL、pH3、上樣體積 310mL、上樣液流速 2 mL/min，解吸時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)95%、體積280mL、流速2mL/min。

在此純化工藝條件下余甘子多酚純度由16.45%提升到60.67%，經(jīng)HPLC法分析后，凍干粉中沒(méi)食子酸的含量為72.179 mg/g、柯里拉京的含量為35.443 mg/g、柯子林鞣酸的含量為42.731 mg/g、鞣花酸的含量為38.652 mg/g。本試驗(yàn)可為余甘子多酚工業(yè)化生產(chǎn)和其深入研究提供參考。