3種干腌火腿中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和風(fēng)味的差異及相關(guān)性分析

徐薈，鄧潔瑩，2，李小敏，吳瑩，李沛軍，2，徐寶才，2*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥工業(yè)大學(xué)肉類微生物控制與利用輕工業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

干腌火腿是發(fā)酵肉制品中具有代表意義的一類產(chǎn)品，是以豬后腿為原料，經(jīng)過腌制、晾曬和長時(shí)間地發(fā)酵、后熟而制成的。除了被稱為中國三大火腿的金華、宣威和如皋火腿，意大利的Parma和Speck Alto Adige火腿、西班牙的Iberian和Serrano火腿、法國的Bayonne火腿等都是世界上廣受好評的火腿產(chǎn)品[1]。由于原料、加工工藝和地理環(huán)境等條件的不同，不同地區(qū)火腿的風(fēng)味、質(zhì)地和色澤均有明顯差異[2]。

微生物和內(nèi)源酶是決定火腿品質(zhì)和風(fēng)味的重要因素[3-4]，在發(fā)酵過程中使原料肉發(fā)生一系列物理及生化反應(yīng)，進(jìn)而形成特殊的風(fēng)味并能夠長期保存[5]。不同產(chǎn)地的火腿由于采用的原料、加工工藝和環(huán)境等條件不同，其發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)也不同，這對其風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值有直接的影響[6]。

隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)被廣泛用于發(fā)酵食品的微生物多樣性研究中[7-9]。Lin等[10]結(jié)合宏基因組和代謝組學(xué)分析，闡明不同成熟階段的老撾火腿的微生物群和代謝譜，并對優(yōu)勢微生物與代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析。Wang等[4]探究發(fā)酵過程中金華火腿的優(yōu)勢菌群與主要揮發(fā)性化合物的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌與醛類物質(zhì)的生成有關(guān)。Zhu等[5]基于高通量測序和代謝組學(xué)證實(shí)了微生物和代謝物之間存在正相關(guān)關(guān)系，微生物發(fā)酵可以促進(jìn)火腿的口感和風(fēng)味。研究表明，火腿發(fā)酵過程中的微生物多樣性對其風(fēng)味和品質(zhì)有重要影響[11]。然而，關(guān)于比較不同火腿產(chǎn)品中微生物的差異及其與風(fēng)味差異的相關(guān)性研究鮮見報(bào)道。本文采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspacesolid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）測定金華、如皋和宣威3種傳統(tǒng)干腌火腿的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)利用高通量測序技術(shù)研究3種火腿微生物的群落結(jié)構(gòu)，將優(yōu)勢菌群信息與風(fēng)味物質(zhì)信息關(guān)聯(lián)，探討微生物對風(fēng)味產(chǎn)生的影響，為分析微生物與火腿風(fēng)味之間的關(guān)系提供參考，對火腿生產(chǎn)過程中穩(wěn)定和改善火腿品質(zhì)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金華火腿、如皋火腿、宣威火腿：市售。每組火腿取平行樣品3份。金華火腿、如皋火腿、宣威火腿分別標(biāo)記為JH、RG、XW，置于凍存管中-80℃冰箱保存用于高通量測序試驗(yàn)，剩余樣品儲存于-20℃冰箱進(jìn)行后續(xù)風(fēng)味物質(zhì)分析。

環(huán)己酮標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：美國Sigma公司；17種氨基酸（天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸）標(biāo)準(zhǔn)品：德國Sykam公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動氨基酸分析儀（S-433D）：德國Sykam公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀（CMS-QP2010）：日本島津公司；固相微萃取針（50/30DVB/CAR/PDMS）、固相微萃取手柄（57330U）：美國Supelco公司。

1.3 游離氨基酸的測定

取適量火腿樣品于121℃下烘干油脂和水分后，稱取0.1 g，加入4 mL 4%磺基水楊酸溶液，超聲輔助提取30 min[12]。浸提結(jié)束后靜置10 min，取1.5 mL上清液于 2 mL 離心管中，離心 30 min（8 000×g、4 ℃）；移取1 mL上清液過0.22 μm水相濾膜，所得溶液采用全自動氨基酸分析儀檢測，同時(shí)檢測17個(gè)游離氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。引用味覺活性值（taste activity value，TAV）來評價(jià)物質(zhì)的味覺活性強(qiáng)度[13]。

1.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

采用固相頂空微萃取法萃取風(fēng)味化合物，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定[14]。取火腿肉樣切碎，稱?。?.0±0.2）g樣品，加入環(huán)己酮標(biāo)準(zhǔn)品，于55℃下加熱吸附40 min。

色譜條件：色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），柱箱初始溫度 40 ℃持續(xù) 3 min，然后以5℃/min升溫至180℃，再以10℃/min升溫至240℃并持續(xù)3 min。載氣為氦氣，純度≥99.999%，流速為1.0 mL/min，選擇不分流模式。質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃、接口溫度250℃、掃描質(zhì)量范圍m/z 30～500。

將獲得的GC-MS圖譜與NIST和WILEY數(shù)據(jù)庫對比檢索，選擇結(jié)果中相似度≥80%的化合物。采用面積歸一化法[15]計(jì)算每種物質(zhì)的相對含量，進(jìn)行定量分析。引用氣味活度值（odor activity value，OAV）來判定所測定的金華火腿風(fēng)味物質(zhì)中的主要活性物質(zhì)。

1.5 高通量測序

火腿樣品中微生物DNA的提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增、純化和測序方法按照試劑公司提供的試驗(yàn)操作指南進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)中數(shù)據(jù)處理主要使用Excel及SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)法，以P＜0.05表示差異顯著。相關(guān)性分析利用spearman系數(shù)進(jìn)行分析，使用Origin及Graphpad prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干腌火腿中游離氨基酸含量及TAV值

游離氨基酸是反映干腌火腿滋味的重要指標(biāo)，其測定結(jié)果與TAV值見表1。

表1 干腌火腿中游離氨基酸含量及TAV值Table 1 Content of free amino acids and TAV value in dry-cured hams

由表1可知，在金華、如皋和宣威3種干腌火腿中共檢測出17種游離氨基酸。金華火腿中總游離氨基酸含量最高，達(dá)到4 355.02 mg/100 g；宣威火腿中總游離氨基酸含量最低，為3 930.62 mg/100 g。3種火腿中，TAV值大于1的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸等；如皋火腿中TAV值最大的是谷氨酸，金華火腿和宣威火腿中TAV值最大的是賴氨酸。谷氨酸是食品中常見的鮮味物質(zhì)，賴氨酸對火腿的特殊滋味具有重要作用[16]。

游離氨基酸是影響火腿風(fēng)味的重要物質(zhì)，按照呈味特性可分類為鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和無味氨基酸[17]。丙氨酸是3種火腿中的主要甜味氨基酸，金華和如皋火腿中丙氨酸含量均顯著高于宣威火腿（P＜0.05），分別為 406.21mg/100 g和 421.65 mg/100 g。丙氨酸在甜味氨基酸中閾值最低，且后期可以轉(zhuǎn)化為醛類化合物促進(jìn)火腿的風(fēng)味[18]，對火腿的滋味具有重要作用。天冬氨酸和谷氨酸是鮮味物質(zhì)，3種火腿中谷氨酸含量均高于天冬氨酸，且其閾值更低、TAV值更高，說明谷氨酸是主要的呈鮮物質(zhì)。如皋火腿和金華火腿中谷氨酸含量較高，分別為549.28 mg/100 g和507.98mg/100g，宣威火腿中鮮味氨基酸的總含量顯著低于金華火腿和如皋火腿（P＜0.05），為 646.64 mg/100 g。

總體上，金華火腿和如皋火腿的氨基酸組成結(jié)構(gòu)相似，與宣威火腿相比，其主要呈味氨基酸中鮮味和甜味氨基酸較為突出。肉制品的發(fā)酵及成熟過程中，蛋白質(zhì)在微生物酶和內(nèi)源酶的作用下分解產(chǎn)生游離氨基酸[19]，而不同種類的火腿中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異會使氨基酸含量不同，最終導(dǎo)致滋味和風(fēng)味的不同。

2.2 不同干腌火腿中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

金華、如皋、宣威火腿中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量及OAV值見表2。

表2 干腌火腿中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量及OAV值Table 2 Content of volatile flavor substances and OAV value in dry-cured hams

續(xù)表2 干腌火腿中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量及OAV值Continue table 2 Content of volatile flavor substances and OAV value in dry-cured hams

由表2可知，在金華、如皋、宣威3種干腌火腿中共檢測出醛類、酸類、醇類、酯類、酮類、烴類和其它共7類、72種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。金華火腿中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總含量最高，達(dá)到1 173.56 μg/100 g，如皋火腿和宣威火腿中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量較低，分別為959.26 μg/100 g和 808.99 μg/100 g。3 種火腿中醛類化合物在所有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中所占比例最大，這一結(jié)果與Huan等[20]的研究一致。本研究中金華火腿的酯類、烴類化合物的含量顯著高于如皋和宣威火腿（P＜0.05）。

己醛和壬醛是3種干腌火腿中含量較高的醛類化合物，其含量遠(yuǎn)高于其它醛類化合物。宣威火腿中的己醛含量顯著高于金華和如皋火腿（P＜0.05），己醛通常被認(rèn)為是干腌肉制品中的主要氧化產(chǎn)物，可能會產(chǎn)生蔬菜和水果味。金華火腿中壬醛含量最高為173.28 μg/100 g，其次是如皋火腿中 166.29 μg/100 g，宣威火腿中壬醛含量最低為150.09 μg/100 g，壬醛具有甜味和果味[21]。苯甲醛有一種宜人的杏仁味，是由Strecker反應(yīng)產(chǎn)生的[22]，只在金華和如皋火腿中被檢測出。

壬醛的OAV值大于10，是干腌火腿的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。本文中檢測到的醛類化合物也是國內(nèi)外其它火腿中常見的風(fēng)味物質(zhì)[23]。由于醛類化合物的含量高且閾值較低，一般被認(rèn)為對干腌火腿風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)[24]。

金華火腿中酸類化合物的總含量高于如皋和宣威火腿中酸類化合物的含量。酸類化合物是金華火腿的重要標(biāo)志，可能是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生[25]，但其較高的閾值對火腿的風(fēng)味貢獻(xiàn)值不大。金華火腿中檢測到的醇類化合物種類和含量較少，宣威火腿的中1-辛烯-3-醇是其主要醇類化合物，也是肉制品中常見的醇類化合物質(zhì)，但在另外兩種火腿中未檢測到，其OAV值大于1，對宣威火腿的風(fēng)味有重要作用。茴香腦一般來源于植物香料中，如皋火腿中茴香腦含量較高，而金華火腿中未檢測到，可能是不同火腿腌制過程中添加的配料不同導(dǎo)致的。

2.3 不同干腌火腿微生物群落組成

對3種干腌火腿微生物的高通量測序結(jié)果見圖1。

圖1 不同干腌火腿微生物群落組成Fig.1 Microbial community composition of different dry-cured hams

由圖1可知，3種火腿注釋到細(xì)菌門水平上主要有厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteriota）。其中厚壁菌門占據(jù)主要地位，金華火腿中的厚壁菌門所占比例要大于如皋火腿和宣威火腿，相對豐度達(dá)到87%。與葛慶豐[26]的研究一致，厚壁菌門是所有火腿中絕對優(yōu)勢的細(xì)菌門。如皋火腿中放線菌門相對豐度明顯高于金華火腿和宣威火腿。

在細(xì)菌屬水平上，金華火腿中的優(yōu)勢菌屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）。如皋火腿中的優(yōu)勢菌屬為葡萄球菌屬、四聯(lián)球菌屬和科貝特氏菌屬（Cobetia）。宣威火腿中的優(yōu)勢菌屬為葡萄球菌屬、鹽單胞菌屬（Halomonas）和科貝特氏菌屬。葡萄球菌屬在3種干腌火腿的微生物群落中均占據(jù)主要地位，與Wang等[4]的研究一致。葡萄球菌屬在金華火腿中的相對豐度為63.77%，明顯高于如皋火腿和宣威火腿。四聯(lián)球菌屬和鹽單胞菌屬等均屬于耐鹽性細(xì)菌，可以在鹽含量較高的火腿產(chǎn)品中生存，是成品中較為優(yōu)勢的細(xì)菌屬。

3種干腌火腿中的葡萄球菌屬在各自微生物群落結(jié)構(gòu)中相對豐度均最大，金華火腿中葡萄球菌屬、四聯(lián)球菌屬相對豐度明顯高于如皋、宣威火腿，而如皋火腿中的科貝特氏菌屬和宣威火腿中的鹽單胞菌屬要高于金華火腿。有研究表明，宣恩火腿表面細(xì)菌主要為葡萄球菌屬、沙雷氏菌屬等[27]，盤縣火腿中的優(yōu)勢細(xì)菌屬為葡萄球菌屬和鹽單胞菌屬[28]。葛慶豐[26]對不同金華火腿成熟車間的微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，車間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異會導(dǎo)致火腿肉樣中微生物的不同。因此，火腿菌落結(jié)構(gòu)的差異可能由原料、制作工藝、產(chǎn)地、工廠環(huán)境等因素的不同導(dǎo)致，而不同的微生物組成可能使發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味不同。

2.4 主要呈味氨基酸與優(yōu)勢菌屬的相關(guān)性分析

在比較不同干腌火腿氨基酸和微生物群落差異的基礎(chǔ)上，利用相關(guān)性分析火腿主要細(xì)菌屬與TAV＞1的呈味氨基酸可能的相關(guān)作用，通過相關(guān)性熱圖表示。干腌火腿主要氨基酸與優(yōu)勢菌屬相關(guān)性熱圖見圖2。

圖2 干腌火腿主要氨基酸與優(yōu)勢菌屬相關(guān)性熱圖Fig.2 Heat map of correlation between main amino acids and dominant bacterial genera in dry-cured hams

由圖2可知，火腿中的葡萄球菌屬與谷氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸和丙氨酸均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。金華火腿和如皋火腿中的葡萄球菌屬比例較高，同時(shí)谷氨酸、纈氨酸等鮮味苦味氨基酸含量較高，表明干腌火腿中TAV＞1的主要呈味氨基酸的變化與優(yōu)勢菌屬存在一定的相關(guān)作用。

鹽單胞菌屬與火腿中天冬氨酸和蘇氨酸的含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而宣威火腿中鹽單胞菌屬的比例、天冬氨酸和蘇氨酸的含量要高于如皋火腿和金華火腿，可能是鹽單胞菌屬的存在促進(jìn)了宣威火腿中蛋白質(zhì)水解生成天冬氨酸和蘇氨酸。嗜冷桿菌屬、假單孢菌屬與纈氨酸和蛋氨酸等部分苦味氨基酸呈正相關(guān)，且有利于甘氨酸和絲氨酸等甜味氨基酸的產(chǎn)生。干腌火腿中的微生物與游離氨基酸的產(chǎn)生具有一定的相關(guān)性，可能是由于蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶的作用下被分解成小分子肽，被微生物酶進(jìn)一步水解成游離氨基酸，從而影響游離氨基酸的組成和含量及火腿的滋味[29]。

2.5 關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與優(yōu)勢菌屬的相關(guān)性分析

將干腌火腿中OAV值＞1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與主要細(xì)菌屬進(jìn)行Spearman關(guān)聯(lián)分析，并通過相關(guān)性熱圖表示，結(jié)果見圖3。

圖3 干腌火腿中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與優(yōu)勢細(xì)菌屬的相關(guān)性熱圖Fig.3 Heat map of correlation between key volatile flavor substances and dominant bacterial genera in dry-cured hams

由圖3可知，葡萄球菌屬、四聯(lián)球菌屬、鹽單胞菌屬、嗜冷桿菌屬與火腿中的主要醛類物質(zhì)有一定的正相關(guān)性。葡萄球菌屬與四聯(lián)球菌屬有利于苯甲醛、壬醛、3-辛醇和3-甲硫基丙醛的產(chǎn)生。葡萄球菌屬在其它類型的火腿制品中也占主導(dǎo)地位[30]，如中國盤縣火腿[31]和西班牙伊比利亞火腿[32]，因此葡萄球菌屬可能是干腌火腿風(fēng)味產(chǎn)生的重要貢獻(xiàn)者。苯甲醛含量變化與葡萄球菌屬呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），苯甲醛可能是由葡萄球菌屬的氨基酸代謝產(chǎn)生的[33]。已有研究表明四聯(lián)球菌屬在發(fā)酵食品中可以提高食品中有機(jī)酸、醛類和酯類等風(fēng)味物質(zhì)含量[34]，因此，在本試驗(yàn)中四聯(lián)球菌屬與庚醛、苯甲醛等物質(zhì)有顯著正相關(guān)性，具有一定的產(chǎn)香能力。鹽單胞菌屬與己醛、（E）-2-壬烯醛、（Z）-2-庚烯醛等主要風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。與其它研究相似，葡萄球菌屬和鹽單胞菌屬可能是火腿風(fēng)味的潛在貢獻(xiàn)者[28]。由此可知，傳統(tǒng)發(fā)酵火腿獨(dú)特風(fēng)味的形成與微生物的生長代謝密切相關(guān)[29]，微生物發(fā)酵促進(jìn)了肉類蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的水解，這可能有助于風(fēng)味和感官質(zhì)量的發(fā)展[35]。

3 結(jié)論

本文通過高通量測序的方法比較了不同種類干腌火腿的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，并將菌群結(jié)構(gòu)差異與游離氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味變化進(jìn)行相關(guān)性分析，探究可能影響火腿滋味與風(fēng)味的因素。金華和如皋火腿中呈鮮味的谷氨酸和呈甜味的丙氨酸顯著高于宣威火腿，宣威火腿中的天冬氨酸顯著高于金華、如皋火腿。己醛和壬醛都是火腿中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，宣威火腿中己醛含量最高，而金華火腿中壬醛含量最高。從微生物群落結(jié)構(gòu)來看，金華火腿中的葡萄球菌屬、四聯(lián)球菌屬比例較高，而宣威火腿中鹽單胞菌屬的含量高于另兩種火腿。相關(guān)性分析表明火腿中的葡萄球菌屬與谷氨酸、蛋氨酸等氨基酸的含量呈顯著正相關(guān)，同時(shí)對壬醛和苯甲醛等風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生也有著重要的促進(jìn)作用；鹽單胞菌屬與己醛、（E）-2-壬烯醛等主要風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生呈顯著正相關(guān)。說明主要微生物屬對火腿的滋味和風(fēng)味的形成有重要的相關(guān)作用。對火腿中的微生物菌群和優(yōu)勢菌種的研究有利于制備優(yōu)良的肉品發(fā)酵劑以縮短發(fā)酵過程的時(shí)間、提高干腌發(fā)酵火腿的品質(zhì)。