授粉后不同時期玉米籽粒含水量相關(guān)QTL定位

吳文強， 趙 強， 趙滿義， 郭向陽， 王安貴， 劉鵬飛， 祝云芳， 吳 迅， 陳澤輝(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所， 貴陽 550006)

玉米(ZeamaysL.)作為我國第一大糧食作物[1]，是國家糧食安全和經(jīng)濟社會發(fā)展的重要物質(zhì)保障[2]。伴隨勞動力成本的不斷升高，全程機械化是玉米生產(chǎn)發(fā)展的必然之路[3]，在玉米全程機械化過程中，成熟期籽粒含水量是影響玉米機械收獲質(zhì)量、安全貯藏和經(jīng)濟效益的關(guān)鍵因素之一。我國許多玉米產(chǎn)區(qū)，收獲時玉米籽粒含水量通常在30%～40%之間，難以實現(xiàn)機械粒收，易導(dǎo)致堆積晾曬過程中的霉變，影響玉米商用品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)[4]。選用成熟期籽粒脫水速度快的玉米雜交種既可以解決成熟期籽粒霉爛的問題，又能適應(yīng)機械化生產(chǎn)的實際需求。因此，剖析籽粒含水量變異的遺傳基礎(chǔ)，鑒定控制玉米籽粒含水量變異的關(guān)鍵遺傳區(qū)段，對于快速改良不同來源玉米種質(zhì)的籽粒脫水性狀，創(chuàng)新玉米材料具有較好的指導(dǎo)性。

Sala等[5]利用包含181份F2∶3家系的分離群體為材料，結(jié)合122個SSR標記對該群體的基因型鑒定結(jié)果，對成熟期玉米籽粒含水量進行研究，結(jié)果共定位到10個控制玉米籽粒含水量的QTL，可累積解釋54.8%的籽粒含水量變異。李露露等[6]利用242個重組自交系群體為材料，結(jié)合916個SSR標記的基因型鑒定結(jié)果，定位到4個在兩個環(huán)境下穩(wěn)定表達的成熟期玉米籽粒含水量相關(guān)QTL，可累積解釋21.71%的表型變異。Xiang等[7]通過對已報道的96個玉米籽粒含水量相關(guān)的QTL進行一致性分析，獲得44個控制玉米籽粒含水量的關(guān)鍵QTL(Quantitative Trait Locus數(shù)量性狀基因座)。這些研究結(jié)果為玉米籽粒含水量的遺傳基礎(chǔ)解析以及相關(guān)的分子輔助改良提供了很好的科學(xué)支撐。然而，玉米籽粒含水量作為復(fù)雜數(shù)量性狀，是大量微效等位基因共同作用的結(jié)果[8-14]。基于少數(shù)玉米種質(zhì)材料尤其是溫帶來源的玉米群體，以及低密度SSR標記所揭示的玉米籽粒含水量的遺傳基礎(chǔ)，對于深度揭示玉米種質(zhì)籽粒含水量變異的遺傳基礎(chǔ)所提供的信息較為有限。尤其是關(guān)于熱帶種質(zhì)成熟期籽粒含水量高的遺傳機制的研究則鮮見報道。近年來，隨著高通量的基因型鑒定技術(shù)的大量應(yīng)用，結(jié)合連鎖分析和高通量的基因型鑒定技術(shù)，深入解析重要性狀變異的遺傳研究，能夠有效縮小目標QTL，提高定位結(jié)果的分辨率，該方法已經(jīng)被大量應(yīng)用在玉米重要性狀的遺傳區(qū)段鑒定上[15-16]，為玉米籽粒含水量變異的遺傳基礎(chǔ)解析提供了很好的借鑒作用。

為滿足復(fù)雜生態(tài)環(huán)境條件對綜合農(nóng)藝性狀、抗性等的特殊要求，育種家們通過構(gòu)建溫?zé)崛后w并進行大量研究，證明了熱帶玉米種質(zhì)具有較溫帶種質(zhì)更為豐富的遺傳多樣性，熱帶種質(zhì)攜帶了大量的優(yōu)勢等位基因[17-18]。但熱帶種質(zhì)存在成熟期籽粒含水量高的不足，以熱帶種質(zhì)改良選系所培育出的雜交種常常因為成熟期籽粒含水量高，導(dǎo)致其易感染穗腐病以及機械收獲困難[19]。因此，利用脫水快的溫帶材料對熱帶種質(zhì)進行改良，選育成熟期籽粒含水量低，且綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的玉米自交系一直是熱帶種質(zhì)改良和創(chuàng)新利用的核心內(nèi)容。解析玉米籽粒含水量變異的遺傳基礎(chǔ)，挖掘控制籽粒含水量相關(guān)性狀的遺傳區(qū)段，對于充分利用熱帶種質(zhì)的遺傳優(yōu)勢以及改良其成熟期籽粒含水量高的不足，將具有十分重要的科學(xué)理論意義和實踐利用價值。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究以玉米自交系HCL 645和ZHL 908為親本構(gòu)建的150份F2分離群體以及F2：3分離家系為材料。其中HCL 645是孟山都公司選育的溫帶玉米自交系，具有成熟期籽粒含水量低的特點，作為迪卡517的親本，在溫帶地區(qū)，特別是中國北方地區(qū)得到廣泛應(yīng)用。ZHL 908是蘇灣種質(zhì)選育的自交系，成熟期籽粒含水量高，在中國南方廣泛應(yīng)用。

1.2 田間試驗設(shè)計及表型評價

試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，單行區(qū)，行長3 m，株距0.25 m，行距0.6 m，并于2016年冬季在海南九所貴州南繁基地種植親本和150個F2單株。于2017年夏季在貴州省農(nóng)業(yè)院科學(xué)院試驗基地(貴陽)種植親本和150個F2∶3家系，田間管理同大田生產(chǎn)。籽粒含水量測定步驟如下：授粉后30 d開始測定籽粒含水量，每個家系連續(xù)選擇10個單株，利用便攜式籽粒測定儀(SMART SESOR)對果穗中部籽粒進行水分測定，每隔7 d重復(fù)測量一次，直到籽粒完全成熟(黑層出現(xiàn))。

1.3 DNA提取和基因型鑒定

玉米5葉期，取F2單株幼嫩葉片，利用改良CTAB法提取基因組DNA，并將合格的DNA樣品送北京康普森生物技術(shù)公司進行DNA質(zhì)量評估和簡化基因組測序(GBS)，鑒定基因型。

注：每行代表一個SNP標記，不同的顏色顯示不同的標記密度。淺色表示標記的密度低，深色表示標記的密度高。圖1 高密度遺傳圖譜Fig.1 High-density genetic map

注：圖2～圖6中x軸表示每個染色體上SNP標記的物理位置；y軸表示LOD值，虛線表示閾值。圖2 控制授粉后30 d玉米籽粒含水量的相關(guān)QTLFig.2 QTL related to maize kernel moisture content after 30 days of pollination

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SAS 9.0、IciMapping等軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和QTL定位，鑒定出控制玉米籽粒含水量的遺傳區(qū)段。

1.5 QTL區(qū)段與玉米參考基因組比對

本研究QTL定位結(jié)果參照WU XUN等[20]研究結(jié)果，以物理位置表示。將定位到的控制授粉后不同時期玉米籽粒含水量相關(guān)QTL與已報道的相關(guān)QTL做一致性分析，獲得相應(yīng)的QTL重疊區(qū)段，并將這些重疊區(qū)段與玉米參考基因序列(Zm-B 73-REFERENCE-NAM-5.0)的物理位置進行比對，篩選相關(guān)功能基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 高密度遺傳圖譜構(gòu)建

利用5 636個SNP構(gòu)建了高質(zhì)量的遺傳圖譜(圖2)。結(jié)果顯示所有SNP均勻分布于10條染色體上。其中第四條染色體上SNP分布最多，為767個；第十條染色體上分布最少，為338個；其余染色體上SNP分布情況為：第一條染色體761個；第二條染色體654個；第三條染色體674個；第五條染色體556個；第六條染色體437個；第七條染色體523個；第八條染色體512個；第九條染色體414個。

2.2 授粉后不同時期控制玉米籽粒含水量的QTL

利用完備區(qū)間作圖法，定位到控制授粉后不同時期玉米籽粒含水量的QTL共21個，結(jié)果列于表1。分析發(fā)現(xiàn)，這些QTL分別位于第一、第二、第三、第五、第六、第七、第八、第九條以及第十條染色體上。單個位點可解釋4.02%～16.10%的籽粒含水量變異，單個QTL大小在69.17 ～5 814.12 kb之間，其中qKC 51-6與qKC 58-6為同一個QTL，控制授粉后51 d以及58 d玉米籽粒含水量(表2)。

表1 控制授粉后不同時期玉米籽粒含水量的相關(guān)QTLTable 1 QTL related to maize kernal moisture content at different periods after pollination

其中，控制授粉后30 d玉米籽粒含水量的QTL qKC 30-9位于第九染色體上(表1，圖2)，大小為798.00 kb，LOD值為3.50，貢獻率為13.76%(表1)，表現(xiàn)出較高的遺傳效應(yīng)。

定位到控制授粉后37 d玉米籽粒含水量的QTL總共5個，分別是qKC 37-3、qKC 37-5、qKC 37-6、qKC 37-7、qKC 37-9(表1)，其中，qKC 37-3位于第三染色體(表1，圖3)，大小為592.24 kb，LOD值為7.29，貢獻率為13.15%(表1)；qKC 37-5位于第五染色體(表1，圖3)，大小為2 844.67 kb，LOD值為3.45，貢獻率為5.91%(表1)；qKC 37-6位于第六染色體(表1，圖3)，大小為93.04 kb，LOD值為6.12，貢獻率為10.81%(表1)；qKC 37-7位于第七染色體(表1，圖3)，大小為884.15 kb，LOD值為7.63，貢獻率為14.99%(表1)；qKC 37-9位于第九染色體(表1，圖3)，大小為948.64 kb，LOD值為4.34，貢獻率為8.60%(表1)。qKC 37-3和qKC 37-6表現(xiàn)出較高的遺傳效應(yīng)。

圖3 控制授粉后37 d玉米籽粒含水量相關(guān)QTLFig.3 QTL related to maize kernel moisture content after 37 days of pollination

定位到控制授粉后44 d玉米籽粒含水量的QTL共計2個，分別是C 44-2、qKC 44-5，其中，qKC 44-2位于第二染色體(表1，圖4)，大小為476.60 kb，LOD值為3.41，貢獻率為16.10%(表1)；qKC 44-5位于第五染色體，大小為790.90 kb，LOD值為4.38，貢獻率為9.91%(表1)。qKC 44-2表型表現(xiàn)出較高的遺傳效應(yīng)。

圖4 控制授粉后44 d玉米籽粒含水量相關(guān)QTLFig.4 QTL related to maize kernel moisture content after 44 days of pollination

定位到授粉后51 d控制籽粒含水量的QTL共計9個，分別是qKC 51-1、qKC 51-2-1、qKC 51-2-2、qKC 51-3-1、qKC 51-3-2、qKC 51-6、qKC 51-9、qKC 51-10-1、qKC 51-10-2(表1)。其中，qKC 51-1位于第一染色體(表1，圖5)，大小為1 232.10 kb，LOD值為6.41，貢獻率為7.11%(表1)；qKC 51-2-1位于第二染色體(表1，圖5)，大小為5 814.12 kb，LOD值為3.79，貢獻率為4.02%；qKC 51-2-2位于第二染色體(表1，圖5)，大小為442.80 kb，LOD值為5.46，貢獻率為7.907 5%(表1)；qKC 51-3-1位于第三染色體(表1，圖5)，大小為503.88 kb，LOD值為5.19，貢獻率為5.67%(表1)；qKC 51-3-2位于第三染色體(表1，圖5)，大小為387.71 kb，LOD值為6.34，貢獻率為7.13%(表1)；qKC 51-6位于第六染色體(表1，圖5)，大小為1 599.36 kb，LOD值為11.70，貢獻率為14.77%(表1)；qKC 51-9位于第九染色體(表1，圖5)，大小為739.28 kb，LOD值為4.47，貢獻率為5.81%(表1)；qKC 51-10-1位于第十染色體(表1，圖5)，大小為135.77 kb，LOD值為9.35，貢獻率為12.50%(表1)；qKC 51-10-2位于第十染色體(圖5)，大小為424.88 kb，LOD值為6.25，貢獻率為7.387 7%(表1)。qKC 51-6表現(xiàn)出較高的遺傳效應(yīng)。

圖5 控制授粉后51 d玉米籽粒含水量相關(guān)QTLFig.5 QTL related to maize kernel moisture content after 51 days of pollination

定位到控制授粉后58 d玉米籽粒含水量的QTL共計4個，分別是qKC 58-2、qKC 58-3、qK C58-6、qKC 58-8(表1)。其中，qKC 58-2位于第一染色體(表1，圖6)，大小為1 242.86 kb，LOD值為5.98，貢獻率為11.88%(表1)；qKC 58-3位于第三染色體(表1，圖6)，大小為69.167 kb，LOD值為4.24，貢獻率為7.60%(表1)；qKC 58-6位于第六染色體(表1，圖6)，大小為1 599.36 kb，LOD值為6.16，貢獻率為11.51%(表1)；qKC 58-8位于第八染色體(表1，圖6)，大小為583.61 kb，LOD值為3.91，貢獻率為7.002 1%(表1)。qKC 58-2和qKC 58-6表現(xiàn)出較高的遺傳效應(yīng)。

圖6 控制授粉后58 d玉米籽粒含水量相關(guān)QTLFig.6 QTL related to maize kernel moisture content after 58 days of pollination

2.3 QTL一致性分析與功能基因篩選

通過將本研究所定位到的控制玉米籽粒含水量相關(guān)QTL與已報道的QTL做一致性分析，結(jié)果(表2)顯示，本研究所定位到的QTL qKC 44-2和qKC 51-6/qKC 58-6分別與Xiang K等[7]定位到的QTL GM 13和GM 28相重疊；其中，qKC 44-2與GM 13重疊區(qū)段為207 170 196～207 285 485， QTL大小由2 412.28 kb縮短至115.29 kb；qKC 51-6/qKC 58-6與GM 28重疊區(qū)段為115 308 486～115 350 163，QTL區(qū)段由1 675.60 kb縮短至41.68 kb；通過一致性分析，大幅縮短了目標QTL區(qū)段大小。

通過一致性分析，獲得2個控制授粉后不同時期玉米籽粒含水量的QTL重疊區(qū)段，分別將兩個QTL重疊區(qū)段與玉米參考基因組進行線性比對，共篩選到6個候選功能基因(表2，圖7，圖8)。

圖8 QTL qKC 51-6/qKC 58-6和GM 28重疊區(qū)段內(nèi)的候選基因Fig.8 Candidate genes located in the common regions between QTL qKC 51-6/qKC 58-6 and GM 28

其中，在qKC 44-2與GM 13重疊區(qū)段內(nèi)共鑒定出3個候選功能基因：Zm00001eb105320、Zm00001eb105330和GRMZM5G803419(表2，圖7),其中Zm00001eb105320和GRMZM5G803419為蛋白編碼基因，Zm00001eb105330為非蛋白編碼基因(圖7)[21-22]，并且兩個蛋白編碼基因所編碼的蛋白功能尚未明確，其與控制授粉后不同時期玉米籽粒含水量是否相關(guān)需要進一步研究。

表2 QTL一致性分析Table 2 QTL consistency analysis

圖7 QTL qKC44-2和GM 13重疊區(qū)段內(nèi)的候選基因Fig.7 Candidate genes located in the common regions between QTL qKC44-2 and GM 13

此外，qKC 51-6/qKC 58-6與GM 28重疊區(qū)段與玉米參考基因組比對篩選到3個候選功能基因Zm00001eb277540、Zm00001d036986、GRMZM2G029506(表2，圖8),3個候選功能基因均為蛋白編碼基因(圖8)；其中，Zm00001d036986，GRMZM2G029506所編碼的蛋白功能尚未明解；而Zm00001eb277540基因所編碼的ABC transporter G family member 34蛋白與ATP酶偶聯(lián)跨膜轉(zhuǎn)運體活性相關(guān)[21]；ATP酶偶聯(lián)跨膜轉(zhuǎn)運體活性直接影響相關(guān)的跨膜運動活動的強弱，可能與授粉后不同時期玉米籽粒含水量相關(guān)，該基因?qū)⒆鳛檠芯渴诜酆蟛煌瑫r期玉米籽粒含水量的目標基因，進行相關(guān)基因功能的研究。

3 討 論

在前人的研究中，已發(fā)現(xiàn)一些與玉米籽粒含水量相關(guān)的QTL，例如Sala等[5]定位到10個相關(guān)QTL，可累積解釋54.80%的表型變異；李露露等[6]定位到4個相關(guān)QTL，可累積解釋21.71%的表型變異；Xiang等[7]通一致性分析，獲得44個與籽粒含水量相關(guān)的關(guān)鍵QTL。本研究以籽粒含水量差異較大的兩個親本構(gòu)建的雙親分離群體為材料，基于GBS測序和表型鑒定結(jié)果，利用完備區(qū)間作圖法定位到控制玉米授粉后不同時期籽粒含水量的QTL共21個(表1)，單個QTL大小變幅在69.17～5 814.12 kb之間；單個QTL的LOD值變幅在3.41～11.70之間；單個QTL可解釋4.02%～16.10%表型變異(表1)。其中，定位于第二條染色體控制授粉后44 d玉米籽粒含水量的QTL qKC 44-2(物理位置為：207 170 196～207 646 801)與GM 13(物理位置：183 162 723～207 285 485)[7]重疊，重疊區(qū)域為第二條染色體核苷酸207 170 196～207 285 485，成功將該QTL區(qū)段由2 412.28 kb縮小至115.29 kb(表2)。定位于第六條染色體控制授粉后51 d和58 d籽粒含水量的QTL qKC 51-6/qKC 58-6(物理位置：113 750 808～115 350 163)(表1)與GM 28(物理位置：115 308 486～132 064 497)[7]重疊，重疊區(qū)域為第六條染色體核苷酸115 308 486～115 350 163，成功將該QTL由1 675.60 kb縮小至41.68 kb(表2)。生物信息分析發(fā)現(xiàn)，在這兩個區(qū)段內(nèi)共篩選到6個候選功能基因，其中5個為編碼蛋白基因，1個為非編碼蛋白基因。其中編碼ABC transporter G family member 34蛋白的Zm00001eb277540基因?qū)⒆鳛榭刂剖诜酆蟛煌瑫r期玉米籽粒含水量的目標功能基因，進行深入研究(表2，圖8)。此外，本研究還檢測到19個新的控制授粉后不同時期玉米籽粒含水量QTL，分別位于除第四條染色體以外的9條染色體上(表1)。這些研究結(jié)果可為深度解析玉米籽粒含水量相關(guān)性狀變異的遺傳基礎(chǔ)提供分子依據(jù)，還為下一步玉米籽粒含水量相關(guān)候選基因的圖位克隆提供靶標。