枯草芽孢桿菌菌劑對不同品種長柄扁桃抗旱酶系和光合特性的影響

王玉寶， 姜文婷， 高翔菲， 陳國梁， 龔 雷 ， 宋錦浩， 郝婉怡， 馬卓裕(.榆林市榆陽區(qū)林業(yè)工作站， 陜西 榆林 79000； .延安大學生命科學學院， 陜西 延安 76000；.東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院， 黑龍江 哈爾濱 5000)

長柄扁桃(Amygdaluspedunculata)別稱巴丹杏、野櫻桃、毛櫻桃，在我國有1 300多年的栽培歷史，其抗旱、抗寒能力極強，其種質(zhì)資源較為豐富，主要分布種植在我國西北干旱、半干旱山地區(qū)域，尤其在內(nèi)蒙古、河北和陜西等地分布最廣[1-3]，在西伯利亞地區(qū)也有分布[4]。長柄扁其根系發(fā)達，能夠適應多種土壤類型和土壤濕度條件，是用于防治土壤沙化的首選樹種之一，成林之后能夠達到長效治沙的目的[5-6]。長柄扁桃還是我國重要的生態(tài)經(jīng)濟型樹種，具有潛在的經(jīng)濟價值和藥用價值，其富含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸及微量元素等，其果仁含油率高，出油率高達45%～55.8%[7-8]。不飽和脂肪酸含量也高達98.1%，其含量與橄欖油相近，完全達到了食用油的標準，具有較高的開發(fā)價值潛力[9-11]。另外，臨床上常采用長柄扁桃葉子的提取物進行殺滅指環(huán)蟲，其種子(含苦扁桃球蛋白氫氯化物)也可制作為治療病毒性感冒的中藥，因此長柄扁桃也具有很高的藥用價值。

長期以來，長柄扁桃一直處于野生狀態(tài)，而近年來我國西北部的干旱和半干旱地區(qū)已對其進行基地建設和資源開發(fā)利用，目前已成為國家木本油料重點研究和發(fā)展的對象[12-14]。同時，中外學者研究了長柄扁桃在抑制心腦血管疾病及提取成新型的植物蛋白方面都取得了很大進展，特別是在化學成分、營養(yǎng)學以及藥理學方面均有廣泛報道[15-17]。

目前，在人們關注長柄扁桃造林技術與藥用價值的同時，很少注意到不同品種的長柄扁桃生理性狀的變化,尤其在旱作地區(qū)對于長柄扁桃的抗旱酶系的研究幾乎為空白。近年來，關于長柄扁桃的蛋白質(zhì)組分和酶已陸續(xù)有一些究報道。有研究表明,不同種源長柄扁桃在相對含水量、質(zhì)膜透性、可溶性蛋白、丙二醛及過氧化氫酶等指標差異較大[18]。但在干旱環(huán)境下不同品種植物會有不同的生理特征，尤其在菌劑處理下植物的抗旱酶系方面鮮見報道。因此，本試驗以四種長柄扁桃為研究對象,探究不同濃度枯草芽孢桿菌菌劑對長柄扁桃葉片谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和可溶性糖(SS)等生理指標的影響，旨在為揭示長柄扁桃抗旱機理提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以榆林榆陽區(qū)巴拉素鎮(zhèn)的多年生長柄扁桃苗木為試驗材料，4種長柄扁桃分別為豐寧壩下群體3號、固陽群體1號、神木群體22號、榆陽群體19號。

菌劑為SL-19枯草芽孢桿菌菌劑(鄜州神鹿有限公司生產(chǎn))。

1.2 試驗地概況

試驗地位于榆林市榆陽區(qū)巴拉素鎮(zhèn)(38°14′N, 109°18′E)，該地處毛烏素沙丘南緣風沙草灘地帶，該地帶地勢平緩、大多為波狀起伏固定、半固定沙丘，土壤類型為風沙土。年平均降雨量423 mm，降雨主要集中在6—9月，約占全年降雨量的80%以上，平均海拔高度為1 067 m，年平均氣溫7.6 ℃，年均蒸發(fā)量896 mm。該地區(qū)日照充足，干旱和霜凍等災害頻繁發(fā)生。地貌類型為沙質(zhì)土壤。

1.3 試驗方法

長柄扁桃種植株行距為2 m×6 m，栽植時坑深為50 cm，寬為40 cm，栽植密度為55株/667 m2。栽植深度以35 cm為宜，地上留苗高5 cm。栽植時將土和肥料按200∶1的比例混勻，將苗木根部完全沾到泥漿，進行造林。試驗共設4個不同濃度枯草芽孢桿菌菌劑處理：(i)對照(ck)；(ii)施用3 g/L枯草芽孢桿菌菌劑；(iii)施用6 g/L枯草芽孢桿菌菌劑；(iv)施用9 g/L枯草芽孢桿菌菌劑；(v)施用12 g/L枯草芽孢桿菌菌劑。在花期前進行5個試驗處理，用同一濃度的枯草芽孢桿菌菌劑灌澆長柄扁桃，每5 d灌施一次，保持土壤水分充足，持續(xù)處理35 d，根據(jù)葉片特征變化測定抗旱酶生理生化指標，測定重復3次。

1.4 測定項目與方法

選取長柄扁桃上部的第4～5片功能葉，置于-80 ℃保存用于測定。SOD活性測定采用氮藍四唑光化還原法，POD活性測定選用愈創(chuàng)木酚法，CAT活性測定采用紫外吸收法，MDA測定用雙組分光光度法、SS含量測定用分光光度計法。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 2021和SPSS軟件進行作圖、統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌菌劑對不同品種長柄扁桃GST活性的影響

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是植物代謝的關鍵酶，在遭受脅迫時，GST可清除活性氧，保護植物細胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)活性。從圖1中可以看出，豐寧壩群體3號的GST活性為330～703 nmol/(g·min)，固陽群體1號的GST活性為302～678 nmol/(g·min)，神木群體22號的GST活性為280～640 nmol/(g·min)。在ck處理條件下，榆陽群體19號GST的酶活性最低，為272 nmol/(g·min)，在枯草芽孢桿菌濃度最高時榆陽群體19號GST活性取得最低值，為603 nmol/(g·min)。綜上，4個長柄扁桃品種的葉片GST活性均隨枯草芽孢桿菌濃度的升高而逐漸提高，并在枯草芽孢桿菌菌劑9 g/L濃度條件下達到最高，之后隨之降低。豐寧壩下群體3號GST活性要普遍高于其他3種品種，固陽群里1號次之，榆陽群體19號最低。

圖1 不同濃度枯草芽孢桿菌菌劑對長柄扁桃葉片GST活性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of bacillus subtilis on glutathione S-transferase (GST) in Amygdalus pedunculata

2.2 枯草芽孢桿菌菌劑對不同品種長柄扁桃SOD、POD、CAT活性的影響

從表1可看出，4種長柄扁桃品種的SOD、POD和CAT活性隨枯草芽孢桿菌菌劑濃度的升高而呈先升后降的趨勢，當枯草芽孢桿菌菌劑濃度達9 g/L，4個品種酶活性均為最高。而隨著枯草芽孢桿菌濃度升高時，4種品種的SOD、POD和CAT活性均逐漸降低。其中，當ck處理時,榆陽群體19號在SOD、POD和CAT為最低,最高的CAT活性是固陽群體1號，SOD活性最高為豐寧壩下群體3號，而最高POD活性是神木群體22號。其中，當枯草芽孢桿菌菌劑濃度在9 g/L時，豐寧壩下群體3號的SOD、POD和CAT活性為最高。

表1 不同枯草芽孢桿菌菌劑濃度處理下不同長柄扁桃葉片酶活性的影響Table 1 Effects of different concentrations of bacillus subtilis on enzyme activities in Amygdalus pedunculata leaves

在SOD活性上，當枯草芽孢桿菌濃度在9 g/L時，豐寧壩下群體3號較固陽群體1號、神木群體22號和榆陽群體19號分別高8.42%、14.2%和17.07%(表1)。而在0～12 g/L枯草芽孢桿菌處理時，SOD活性排序為豐寧壩下群體3號>固陽群體1號>神木群體22號>榆陽群體19號。

在POD活性上，當枯草芽孢桿菌菌劑濃度為0～6 g/L時，固陽群體1號均高于其他3個品種。當枯草芽孢桿菌菌劑濃度為9～12 g/L時，固陽群體1號微低于豐寧壩下群體3號，高于神木群體22號和榆陽群體19號。在CAT活性上，當枯草芽孢桿菌菌劑濃度為9 g/L時，豐寧壩下群體3號較固陽群體1號、神木群體22號和榆陽群體19號分別高15.3%、18.9%和19.5%。從枯草芽孢桿菌菌劑濃度為0～12 g/L時，其排序為豐寧壩下群體3號>固陽群體1號>神木群體22>榆陽群體19號(表1)。

2.3 枯草芽孢桿菌菌劑對不同品種長柄扁桃可溶性糖(SS)含量的影響

從圖2中可以看出，不同濃度枯草芽孢桿菌對長柄扁桃葉片的SS含量具有顯著影響。當枯草芽孢桿菌濃度0～12 g/L，豐寧壩群體3號的SS含量范圍為2.3～3.5 mg/g，神木群體22號SS含量為1.8～3.1 mg/g，榆陽群體19號的SS含量為2.6～4.1 mg/g，豐寧壩群體3號的SS含量為2.6～4.1 mg/g。4個品種的SS含量均隨著枯草芽孢桿菌濃度升高逐漸升高，當枯草芽孢桿菌濃度最高時，4個品種的SS含量達到最高。當枯草芽孢桿菌濃棗為0～12 g/L，SS含量在豐寧壩群體3號最高，固陽群體1號次之，較低的是神木群體22號和榆陽群體1號，兩者之間在各個枯草芽孢桿菌濃度下差異不顯著。

圖2 不同濃度枯草芽孢桿菌菌劑對長柄扁桃的SS的影響Fig.2 Effects of different concentrations of bacillus subtilis on soluble sugar (SS) in Amygdalus pedunculata

2.4 長柄扁桃生理生化指標相關性分析

通過不同抗旱酶系組分的Spearman等級相關分析表明(圖3)，GST與SOD呈極顯著的正相關關系(p<0.01)，POD與CAT之間呈極顯著的正相關關系(p<0.01)，SS與POD呈顯著正相關關系(p<0.01)。

圖3 長柄扁桃的抗旱酶系因子的相關性分析Fig.3 Correlation analysis of drought resistance enzymes in Amygdalus pedunculata

2.5 不同品種長柄扁桃的凈光合速率日變化

以9 g/L枯草芽孢桿菌施用條件下為例，研究了4種長柄扁桃的凈光合速率日變化。由圖4顯示，4個品種的葉片均在晴天條件下凈光合速率呈“雙峰型”曲線，長柄扁桃葉片在09：00時凈光合速率(Pn)較低，其中最低的是神木群體22號為7.9 μmol CO2/(m2·s)。隨著溫度上升和光照逐漸增強，從09：00—13：00時之間，4種長柄扁桃的Pn處于顯著增加的趨勢(圖3)。至13：00時，長柄扁桃葉片Pn達到最高是固陽群體1號，為22.2 μmol CO2/(m2·s)。在13：00—14：00時之間，4種長柄扁桃葉片在此時段中(Pn)出現(xiàn)持平并略微下降趨勢，尤其榆陽群體19下降到17.6 μmol CO2/(m2·s)。從14：00—16：00時，長柄扁桃的Pn呈現(xiàn)明顯下降趨勢。至18：00時，長柄扁桃葉片Pn開始繼續(xù)下降，最低達到9.8 μmol CO2/(m2·s)(榆陽群體19號)。也就是說，隨著溫度和光照強度的減弱，長柄扁桃進行光合作用變少，因此在這個時段Pn出現(xiàn)明顯下降趨勢。研究表明，長柄扁桃對于光較敏感，盡管在同一濃度的枯草芽孢桿菌菌劑濃度下，不同品種長柄扁桃類型通過葉片進行光合作用也具有很大差異。

圖4 不同品種長柄扁桃的(Pn)的日變化Fig.4 Diurnal variation of net photosynthetic rate of Amygdalus pedunculata in different cultivars

3 討 論

適中濃度枯草芽孢桿菌添加時，顯著增強長柄扁桃的抗旱性。長柄扁桃作為是我國荒山造林和生態(tài)建設的優(yōu)選樹種[19-20]，可承受干旱程度較高土壤[21-23]。而篩選最宜旱地造林的長柄扁桃品種及促進抗旱的枯草芽孢桿菌的濃度，對于探明長柄扁桃抗旱原理具有重要意義。

本研究表明，不同濃度枯草芽孢桿菌對4種品種長柄扁桃的GST、SOD、POD、CAT的活性及可溶性糖含量均有顯著提升作用。這與枯草芽孢桿菌菌劑中所含的大量有效活菌密切相關，枯草芽孢桿菌可以增加多種酶合菌類物質(zhì)，通過吸收土地的養(yǎng)分和水分提升長柄扁桃體內(nèi)的碳水化合物，從而提升植物的抗逆性，因此形成高度抗旱的內(nèi)生孢子來抵抗逆境環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)，4種品種的GST、SOD、POD、CAT均隨枯草芽孢桿菌濃度的升高而逐漸提高，并在枯草芽孢桿菌9 g/L濃度條件下達到最高，之后隨之降低，說明枯草芽孢桿菌濃度過高時，對長柄扁桃的抗旱酶卻有抑制作用。在0～12 g/L枯草芽孢桿菌濃度范圍內(nèi)，4種長柄扁桃的抗旱效果依次為：豐寧壩下群體3號>固陽群體1號>神木群體22號>榆陽群體19號。因此，在品種生理生化適應性方面，當豐寧壩下群體3號和固陽群體1號受到干旱脅迫后，能夠更好地優(yōu)于神木群體22號和榆陽群體19號。尤其當細胞膜受損或受到電解質(zhì)外滲等因素影響，較好品種的長柄扁桃其體內(nèi)會快速積累谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，來降低體內(nèi)的滲透勢，使其在逆境下仍可獲得維持正常生長所需的水分[24-26]，因此，不同長柄扁桃品種間抗旱酶均有顯著差異。

而同一枯草芽孢桿菌濃度下不同品種長柄扁桃的凈光合速率日變化也證明了這一特性。通過對Pn的研究，目的是為分析不同品種長柄扁桃的光合生產(chǎn)力和葉片生理作用形成提供理論依據(jù)。研究表明，在上午時段4種長柄扁桃的Pn均較低，而進入中午時段(為一天中光照強度和溫度最高的時段)，葉片進入光合作用的旺盛期，此時豐寧壩下群體3號和固陽群體1號Pn均較高。隨著時間至14：00時，葉片也會遇到“午休”，長柄扁桃Pn發(fā)生持平。隨著光照強度減弱，光合作用變少，長柄扁桃Pn不斷出現(xiàn)下降趨勢，因此至18：00時左右，最低Pn是榆陽19號。

綜合分析表明，在9 g/L枯草芽孢桿菌濃度時，4種長柄扁桃的抗旱酶系均達到最高，其中豐寧壩下群體3號的抗旱酶活性為最高和葉片光合能力最強，榆陽群體19號的抗旱性和葉片發(fā)生光合能力最弱。因此，在毛烏素沙丘地帶更適宜栽植豐寧壩下群體3號，配施適宜濃度枯草芽孢桿菌菌劑更有益于長柄扁桃旱地造林。