感冒清熱顆粒中藏柴胡摻偽檢測方法的建立及摻偽限度擬定Δ

趙丹彤，高一軍，畢天琛，劉靖華，朱偉堃，王素香，容 蓉（.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東菏澤 274000；2.山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南 25055；.菏澤市立醫(yī)院藥學部，山東菏澤 2740）

感冒清熱顆粒由荊芥穗、薄荷、防風、柴胡、紫蘇葉、葛根、桔梗、苦杏仁、白芷、苦地丁和蘆根11味中藥組方而成，具有疏風散寒、解表清熱之功效[1]。其中，柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumWilld.的干燥根，兩者分別習稱“北柴胡”和“南柴胡”[1]。我國柴胡屬植物種類較多且性狀相似，在采集和使用時難以鑒別，多種混偽品與正品柴胡混淆使用，摻偽摻雜投料的現(xiàn)象較為普遍[2-3]，使得含柴胡中成藥的安全性和有效性受到影響。

藏柴胡為傘形科植物窄竹葉柴胡Bupleurum marginatumWall.ex DC.var.stenophyllum（Wolff.）Shan et Y.Li 的干燥根[4]，因其產量和柴胡皂苷含量顯著高于其他同屬植物，且價格較低，常摻偽或混入北柴胡使用[5]。藏柴胡與北柴胡、南柴胡等性狀相似，化學成分基本一致，考察到以感冒清熱顆粒為代表的含柴胡中成藥成分多樣[6-7]，故對摻偽篩查方法的專屬性和準確性要求較高，而僅采用薄層色譜法、高效液相色譜（HPLC）法等手段難以進行有效區(qū)分[8-11]。

nepasaikosaponin K為五環(huán)三萜齊墩果烷型衍生物，是藏柴胡特征性柴胡皂苷類成分[12-13]。本課題組前期研究表明，藏柴胡中nepasaikosaponin K 的含量為北柴胡、南柴胡的25～140倍。因此，本研究擬以該成分為指標，采用高效液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用（HPLCMS/MS）技術建立感冒清熱顆粒藏柴胡摻偽檢測方法，并擬定摻偽限度，以期為含柴胡中成藥質量評價與監(jiān)管提供補充檢驗方法和技術保障，也為中藥摻偽檢測技術研究提供新的思路與方法。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260-6460型HPLC-MS/MS儀（美國Aglient 公司），XPR2 型百萬分之一分析天平、AB104-S 型萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司），F(xiàn)RQ-1010T型超聲波清洗器（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

nepasaikosaponin K 對照品（批號DSTAC019202，純度≥98%）購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；氨水為分析純；水為超純水。15批感冒清熱顆粒樣品來自6家生產企業(yè)，其具體來源信息見表1。自制感冒清熱標準湯劑流浸膏樣品所需荊芥穗、薄荷、紫蘇葉、北（南）柴胡、藏柴胡、防風、葛根、桔梗、苦杏仁、白芷、苦地丁、蘆根飲片均由山東舜王城藥業(yè)集團有限公司提供，經菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院沙啟營主任中藥師鑒定均為真品。

表1 15批感冒清熱顆粒樣品的來源信息

2 方法與結果

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件 以Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液為流動相A、含0.1%甲酸的乙腈為流動相B進行梯度洗脫（0～2 min，70%A；2～5 min，70%A→55%A；5～8 min，55%A；8～9 min，55%A→70%A；9～10 min，70%A）；柱溫為40 ℃；流速為0.25 mL/min；進樣量為5 μL。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子源，以多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進行負離子掃描。毛細管電壓為3 500 V；霧化器壓力為20 psi；干燥氣溫度為300 ℃，干燥氣流速為10 L/min；鞘流氣溫度為350 ℃，鞘流氣流速為10 L/min；以m/z943.6→635.5（定量離子對）、m/z943.6→797.4（定性離子對）、m/z943.6→781.5（定性離子對）為特征離子對，碎裂電壓均為330 V，碰撞能量分別為53、41、50 eV。nepasaikosaponin K的一級、二級質譜圖見圖1。

圖1 nepasaikosaponin K的一級質譜圖和二級質譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取nepasaikosaponin K 對照品5.05 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得對照品儲備液。取對照品儲備液適量，分別制成質量濃度為0.051、0.101、0.202、0.505、1.010、2.525、5.050、10.100、20.200 μg/mL的系列對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取感冒清熱顆粒樣品，研細，混勻，精密稱取樣品適量（相當于柴胡0.5 g），置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇（含5%濃氨試液）25 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率350 W，頻率37 kHz，下同）處理30 min，取出，放冷，再次稱定質量，用甲醇（含5%濃氨試液）補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 模擬樣品溶液 （1）標準樣品溶液：取北（南）柴胡、荊芥穗、薄荷、紫蘇葉、防風、葛根、桔梗、苦杏仁、白芷、苦地丁、蘆根飲片10、20、6、6、10、10、6、8、6、20、16 g，按2020年版《中國藥典》（一部）“感冒清熱顆粒”項下制法[1]，分別制得含北柴胡或南柴胡的感冒清熱標準湯劑流浸膏各3批。精密稱取上述標準湯劑流浸膏適量（相當于柴胡0.5 g），按“2.2.2”項下方法處理，即得標準樣品溶液。（2）缺柴胡陰性樣品溶液：除不加北（南）柴胡外，其余同“2.2.3（1）”項下處方、制法，制得缺柴胡陰性樣品溶液。（3）藏柴胡陽性樣品溶液：取藏柴胡10 g 替代北（南）柴胡，其余同“2.2.3（1）”項下處方、制法，制得藏柴胡陽性樣品溶液。（4）摻偽50%藏柴胡陽性樣品溶液：取藏柴胡5 g，北（南）柴胡5 g，其余同“2.2.3（1）”項下處方、制法，制得摻偽50%藏柴胡陽性樣品溶液。（5）摻偽10%藏柴胡陽性樣品溶液：取藏柴胡1 g，北（南）柴胡9 g，其余同“2.2.3（1）”項下處方、制法，制得摻偽10%藏柴胡陽性樣品溶液。

2.2.4 感冒清熱顆粒摻偽混合樣品溶液 取感冒清熱顆粒樣品，研細，混勻，精密稱取樣品適量（相當于柴胡0.45 g），精密加入藏柴胡粉末0.05 g，其余同“2.2.2”項下處方、制法，制得感冒清熱顆粒摻偽混合樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別取1.010 μg/mL nepasaikosaponin K對照品溶液、缺柴胡陰性樣品溶液、標準樣品溶液（含北柴胡或南柴胡）、摻偽50%藏柴胡陽性樣品溶液（含北柴胡）和藏柴胡陽性樣品溶液，按“2.1”項下檢測條件進樣測定?？傠x子流（total ion current，TIC）圖和典型MRM 圖如圖2 所示，在與nepasaikosaponin K 對照品溶液相應保留時間位置上，缺柴胡陰性樣品溶液中3對特征離子對峰均未檢出，說明缺柴胡陰性樣品對檢測無干擾。標準樣品溶液檢出微量nepasaikosaponin K，與其余色譜峰的分離度均大于1.5；摻偽50%藏柴胡陽性樣品溶液、藏柴胡陽性樣品溶液均檢出nepasaikosaponin K，其色譜峰峰面積分別約為標準樣品的12 倍和25 倍，與其余色譜峰的分離度均大于1.5。

2.3.2 線性關系考察 分別取“2.2.1”項下系列對照品溶液，按“2.1”項下檢測條件進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X）、定量離子對對應色譜峰峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程為Y＝3 113.2X+19.084（r＝0.999 1），表明nepasaikosaponin K 檢測質量濃度的線性范圍為0.051～20.200 μg/mL。

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.1”項下質量濃度為1.010 μg/mL的對照品溶液，按“2.1”項下檢測條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，nepasaikosaponin K 定量離子對對應色譜峰峰面積的RSD為1.51%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 按“2.2.3（5）”項下方法平行制備摻偽10%藏柴胡陽性樣品溶液（含北柴胡），共6 份，按“2.1”項下檢測條件進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算樣品中的nepasaikosaponin K 含量。結果顯示，該成分含量的RSD為2.02%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.3（5）”項下方法制備摻偽10%藏柴胡陽性樣品溶液（含北柴胡），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h 時按“2.1”項下檢測條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，nepasaikosaponin K 定量離子對對應色譜峰峰面積的RSD為1.89%（n＝8），表明摻偽10%藏柴胡陽性樣品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知nepasaikosaponin K含量的感冒清熱顆粒樣品（編號S7）9份（每份約相當于柴胡0.5 g），分別加入低（1.01 μg/mL）、中（10.10 μg/mL）、高（50.50 μg/mL）質量濃度的對照品溶液（按“2.2.1”項下方法配制）1 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下檢測條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，上述溶液中nepasai-kosaponin K的平均加樣回收率為97.58%，RSD 為2.09%（n＝9），表明方法準確度良好。

2.3.7 檢測限與定量限考察 取感冒清熱顆粒供試品溶液（編號S7），適當稀釋后按“2.1”項下檢測條件進樣測定。結果顯示，當含量為0.59 μg/g時，nepasaikosaponin K定量、定性離子對對應色譜峰的信噪比均大于3；當含量為1.75 μg/g 時，nepasaikosaponin K 定量離子對對應色譜峰的信噪比大于10。綜合考慮樣品間差異及方法偏差，擬定感冒清熱顆粒中nepasaikosaponin K 的檢測限為0.60 μg/g，定量限為1.80 μg/g。

2.4 感冒清熱顆粒模擬樣品中nepasaikosaponin K 的含量

分別取“2.2.3”項下各模擬樣品溶液（摻偽10%藏柴胡陽性樣品溶液除外）適量，按“2.1”項下檢測條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算各樣品中nepasaikosaponin K的含量，結果見表2。

2.5 感冒清熱顆粒中藏柴胡摻偽比例檢測方法的建立及驗證

2.5.1 感冒清熱顆粒中藏柴胡摻偽比例線性關系的考察 取藏柴胡和北柴胡飲片適量，其余同“2.2.3（1）”項下處方、制法，分別制得藏柴胡摻偽比例5%、8%、10%、20%、40%、50%、70%、90%、100%的感冒清熱顆粒摻偽樣品溶液共9份，按“2.1”項下檢測條件進樣測定。以摻偽樣品溶液中藏柴胡摻偽比例為橫坐標（a）、nepasaikosaponin K定量離子對對應色譜峰峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程為Y＝26 147a+44.603（r＝0.990 9），表明感冒清熱顆粒中藏柴胡摻偽比例在5%～100%范圍內與峰面積成良好的線性關系。

2.5.2 感冒清熱顆粒中藏柴胡摻偽比例測定方法的驗證 取感冒清熱顆粒樣品3 批（編號分別為S1、S6、S15），分別加入一定量的藏柴胡粉末，參照“2.2.4”項下方法制成藏柴胡比例分別為10%、20%、50%的摻偽混合樣品溶液，按“2.1”項下檢測條件進樣測定，記錄峰面積并代入“2.5.1”項下線性回歸方程計算藏柴胡摻偽比例。結果顯示，感冒清熱顆粒摻偽混合樣品中藏柴胡的理論摻偽比例與實測摻偽比例的平均偏差為1.25%～1.53%，說明該方法能準確測定感冒清熱顆粒中藏柴胡的摻偽比例。結果見表3。

圖2 專屬性試驗的TIC圖和典型MRM圖

表2 感冒清熱顆粒模擬樣品中nepasaikosaponin K 含量的測定結果（n＝3）

表3 感冒清熱顆粒摻偽混合樣品中藏柴胡實測摻偽比例與理論摻偽比例的比較

2.6 市售感冒清熱顆粒中nepasaikosaponin K 含量分布及摻偽情況分析

分別取感冒清熱顆粒樣品（編號S1～S15），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下檢測條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品中nepasaikosaponin K 的含量。同時，將各樣品中nepasaikosaponin K的峰面積代入“2.5.1”項下線性回歸方程計算藏柴胡摻偽比例?？紤]到不同批次感冒清熱顆粒中nepasaikosaponin K 含量差異和線性擬合誤差，擬定疑似摻偽比例低于6%為未摻偽，結果見表4。由表4 可知，15批市售感冒清熱顆粒樣品中nepasaikosaponin K 含量檢測結果為2.584～56.661 μg/g，其中2個批次樣品含量測定值異常，其摻偽比例分別為9.91%和13.40%，異常率為13.33%。

2.7 感冒清熱顆粒中藏柴胡摻偽擬定限度研究

根據(jù)市場調研及數(shù)據(jù)分析，參照2020 年版《中國藥典》（四部）“0212藥材和飲片檢定通則”所述雜質通常不得過3%[14]，考慮柴胡存在交叉種植、種質多樣及性狀易混淆的情況，結合感冒清熱顆粒制法與柴胡處方量，同時考慮北（南）柴胡制感冒清熱顆粒標準樣品中均含有微量的nepasaikosaponin K，本研究擬定感冒清熱顆粒中藏柴胡的摻偽限度為10%。

表4 15批感冒清熱顆粒樣品中nepasaikosaponin K含量測定結果及摻偽情況（n＝3）

按感冒清熱顆粒處方和制法，分別取不同批次藏柴胡和北柴胡飲片各5批，按“2.2.3（5）”項下方法制備摻偽10%藏柴胡陽性樣品溶液，再按“2.1”項下檢測條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算得5批摻偽10%藏柴胡陽性樣品溶液中nepasaikosaponin K 的平均含量為1.01 μg/mL，按處方量折算得每1 g 柴胡所含nepasaikosaponin K的質量為50.42 μg。因此，本研究擬定感冒清熱顆粒供試品溶液中nepasaikosaponin K 的含量限度為1 μg/mL。

根據(jù)上述擬定摻偽限度，由表4和圖3可知，本次收集的15批次市售感冒清熱顆粒中，1批次樣品超出擬定摻偽限度，不合格率為6.67%。同時，根據(jù)北（南）柴胡制標準樣品含量數(shù)據(jù)（表2）所繪參考線可知，13個批次含量檢測結果接近或略低于北（南）柴胡制感冒清熱顆粒標準樣品參考線，2 批次樣品偏離感冒清熱顆粒標準樣品參考線。

圖3 15批感冒清熱顆粒中nepasaikosaponin K含量分布柱狀圖

3 討論

3.1 感冒清熱顆粒差異標志物的選擇

課題組前期分別對各模擬樣品中nepasaikosaponin K的含量進行測定，結果顯示，nepasaikosaponin K 在缺柴胡陰性樣品中未被檢出，而藏柴胡陽性樣品中該成分的含量為標準樣品的25～115 倍。因此，nepasaikosaponin K 可作為感冒清熱顆粒中藏柴胡摻偽檢測方法的差異標志物。

3.2 檢測條件優(yōu)化

3.2.1 供試品溶液制備方法 課題組前期以甲醇（含濃氨試液）為提取溶劑，考察了不同超聲時間（30、45、60 min）、溶劑體積（25、50、75 mL）及濃氨試液體積分數(shù)（2%、5%、10%）對感冒清熱顆粒供試品溶液中待測成分定量離子對對應色譜峰峰面積的影響，最終確定了甲醇所含濃氨試液的體積分數(shù)為5%，提取溶劑用量為25 mL，超聲時間為30 min。

3.2.2 色譜條件 課題組分別考察了水、甲醇、乙腈、甲（乙）酸溶液等不同流動相體系的分離效果。結果顯示，當以甲醇為有機相時，基線噪聲較大，色譜響應值偏低，且分離度小于1.5；采用乙腈為有機相，上述問題均有所改善；同時，為改善待測成分色譜峰的峰形，課題組嘗試在流動相中加入一定量的酸。最終確定流動相為0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的乙腈，并建立了“2.1.1”項下梯度洗脫程序。課題組還考察了不同柱溫（30、35、40 ℃）對供試品溶液中待測成分色譜峰峰面積及分離度的影響，最終確定柱溫為40 ℃。

3.2.3 質譜條件 課題組分別考察了電噴霧正、負離子模式下對照品溶液和供試品溶液中目標成分的檢出情況。結果顯示，采用負離子模式可檢出nepasaikosaponin K 的分子離子峰m/z943.6[M-H]-、氯離子加合峰m/z979.7[M+Cl]-和羧基加合峰m/z989.6[M+HCOO]-，其中分子離子峰m/z943.6[M-H]-的豐度最高；而采用正離子模式未能檢測出nepasaikosaponin K 色譜峰。因此，最終選取母離子為m/z943.6[M-H]-，主要碎片離子為m/z781.5[M-H-Glu]-、m/z797.4[M-H-Rha]-、m/z635.5[M-H-Glu-Rha]-。課題組前期分別檢測了對照品和供試品溶液中m/z943.6→635.5、m/z943.6→781.5、m/z943.6→797.4特征離子對對應色譜峰，結果顯示，3 組特征離子對均能被檢出；其中m/z943.6→635.5對應色譜峰峰面積最大、信噪比高、分離度好，故選擇其作為定量離子對。

3.3 市售感冒清熱顆粒中nepasaikosaponin K 含量及藏柴胡摻偽情況分析

采用本研究建立的感冒清熱顆粒中藏柴胡摻偽檢測方法，對6家生產企業(yè)的15批市售感冒清熱顆粒樣品中nepasaikosaponin K 的含量進行檢測，結果表明，1 批次樣品超出擬定限度，不合格率為6.67%。同時，本研究對感冒清熱顆粒中摻偽比例進行了調查，結果表明，2批次市售樣品中nepasaikosaponin K 的含量偏離感冒清熱顆粒標準樣品參考線，摻偽比例分別為9.91%和13.40%，說明市售樣品存在摻偽現(xiàn)象，應予以關注?，F(xiàn)有研究表明，藏柴胡因價格低、產量高的優(yōu)勢常摻偽或混入北柴胡使用[5]；而且其柴胡皂苷含量顯著高于其他品種，具有一定的毒性風險[9]，因此本研究建立的方法可對感冒清熱顆粒中藏柴胡摻偽情況進行有效排查和控制。

綜上所述，本研究建立了以nepasaikosaponin K 為指標的感冒清熱顆粒中藏柴胡摻偽的檢測方法，初步擬定了藏柴胡摻偽限度為10%，并對市售感冒清熱顆粒中nepasaikosaponin K含量和藏柴胡摻偽比例進行了調查，可為該制劑質量評價及藏柴胡摻偽篩查提供檢測手段，同時也為中成藥摻偽檢測技術研究提供新的思路與方法。