三葉香茶菜提取物對肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞TLR4/NF-κB/NLRP3通路的影響Δ

覃 樂，陳 勇，黃桂東，吳瑞勝，劉代華，周至品#（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 53000；.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院藥學(xué)部/廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會廣西臨床疾病生物技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/柳州市胃腸道中成藥工程技術(shù)研究中心，廣西柳州 545006）

三葉香茶菜Isodon ternifolius（D.Don）Kudo 為唇形科植物，又名細(xì)葉香茶菜，常用于治療黃疸、風(fēng)濕腫痛等，其復(fù)方制劑可用于臨床治療急慢性肝炎[1-2]。有研究表明，三葉香茶菜乙醇提取物具有保肝、降酶活性，其主要藥效成分為齊墩果酸和熊果酸[3-4]。另有研究發(fā)現(xiàn)，三葉香茶菜的多種苯基木脂素成分可減少小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 的炎性損傷，可能是其藥效成分之一[5]。動物實(shí)驗(yàn)表明，三葉香茶菜能減輕四氯化碳致大鼠肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）程度，下調(diào)Toll 樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、磷酸化核因子κB 抑制蛋白（phosphorylated inhibitor of NF-κB，p-IκB）、NOD 樣受體蛋白3（NODlike receptor protein 3，NLRP3）的表達(dá)，減少白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥因子的釋放，提示其可通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3 通路來減輕大鼠的炎性損傷，從而發(fā)揮抗HF 作用[6-7]。有研究指出，NLRP3炎癥小體可誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡，并可在細(xì)胞外被肝星狀細(xì)胞吞噬，從而激活肝星狀細(xì)胞，使得IL-1β、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）分泌上調(diào)，進(jìn)而加重HF[8]，提示肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞所構(gòu)成的肝臟微環(huán)境在HF的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用?；诖?，本研究在前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以TLR4/NF-κB/NLRP3通路為切入點(diǎn)，探討三葉香茶菜提取物對肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞的影響，進(jìn)一步揭示其抗HF的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括CC-170T-8型三氣培養(yǎng)箱（新加坡ESCO 公司）、FilterMax F3 型多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）公司]、FC-1100型超微量核酸檢測儀（杭州遂真生物技術(shù)有限公司）、AriaMx型實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）系統(tǒng)（美國Agilent 公司）、Tanon 5200型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

三葉香茶菜飲片（批號20190501，產(chǎn)地廣西）于2019年10月購自廣西仙茱中藥科技有限公司，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室梁子寧教授鑒定為唇形科植物三葉香茶菜I.ternifolius（D.Don）Kudo的干燥根莖。

TAK-242 對照品（TLR4 阻斷劑，批號SML0832，純度≥98%）、秋水仙堿對照品（陽性對照，批號C3915，純度≥95%）均購自美國Sigma 公司；脂多糖（LPS，批號L8880）、MTT 細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒（批號M1020）均購自北京索萊寶科技有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光底物（批號BL523A）購自北京蘭杰柯科技有限公司；IL-1β、IL-18、Ⅰ型膠原蛋白（type Ⅰcollagen，COL-Ⅰ）、COL-Ⅲ、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為JYM0419Ra、JYM0650Ra、JYM0413Ra、JYM0811Ra、JYM0722Ra、JYM0994Ra）均購自武漢基因美生物科技有限公司；α-SMA、轉(zhuǎn)化生長 因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA 試劑盒（批號分別為ml038078、ml002856）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔源TLR4、NF-κB p65、NLRP3、Gasdermin D（GSDMD）、凋亡相關(guān)微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號分別為ab13867、ab76302、ab263899、ab219800、ab180799、ab8227）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（批號ab6721）均購自英國Abcam 公司；兔源p-IκBα單克隆抗體（批號2859S）購自美國CST公司；其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞

SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為180～200 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004。所有動物均飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心動物房（室內(nèi)保持通風(fēng)、干燥、潔凈）內(nèi)，并自由攝食、飲水。動物處置符合相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

2 方法

2.1 三葉香茶菜提取物的制備

取適量三葉香茶菜飲片，加10 倍量水浸泡30 min，煮沸60 min，用紗布過濾，收集濾液。同法重復(fù)提取3次，合并濾液，加95%乙醇適量使乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為70%，攪拌，靜置24 h后，過濾除渣，收集濾液，回收乙醇并濃縮成浸膏（每1 g 浸膏相當(dāng)于生藥20 g），冷藏。將浸膏用DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋，過濾除菌后用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.2 大鼠原代肝星狀細(xì)胞、原代肝細(xì)胞的分離

參照張玉等[9]所建方法，依次通過肝逆向兩步酶灌注法原位消化，密度梯度離心分離，特征性表面抗原α-SMA、結(jié)蛋白免疫熒光法鑒定，獲得原代肝星狀細(xì)胞。參照葉娟等[10]所建方法，依次通過改良原位兩步灌流法和多次過濾低速離心法分離，抗肝細(xì)胞角蛋白18免疫化學(xué)法鑒定，獲得原代肝細(xì)胞。所獲細(xì)胞均接種于完全培養(yǎng)基[含10%胎牛血清、青鏈霉素雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基，下同]中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)（下同）。

2.3 三葉香茶菜提取物對肝星狀細(xì)胞及肝細(xì)胞增殖影響的檢測

取原代肝星狀細(xì)胞或肝細(xì)胞適量，按6×104個(gè)/mL接種于96孔板中，分別用不同質(zhì)量濃度的三葉香茶菜提取物[肝星狀細(xì)胞：0.2、0.4、1、2、4 mg/mL，肝細(xì)胞：0.1、0.5、1、1.5、2.5 mg/mL，均按生藥量計(jì)（下同），質(zhì)量濃度參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置]干預(yù)，并設(shè)不含藥物的空白對照組。培養(yǎng)24 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定各孔的吸光度，計(jì)算增殖抑制率[增殖抑制率＝（空白對照組吸光度-實(shí)驗(yàn)組吸光度）/空白對照組吸光度×100%]和半數(shù)抑制濃度（IC50）。每質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞分組與處理

將原代肝星狀細(xì)胞或肝細(xì)胞傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，分為空白對照組、LPS 模型組、秋水仙堿（1 μmol/L）組、三葉香茶菜提取物（1 mg/mL，質(zhì)量濃度參考“2.3”項(xiàng)下IC50設(shè)置）組、TLR4 阻斷劑（TAK-242，1 μmol/L）組和TLR4 阻斷劑+三葉香茶菜提取物（1 μmol/L+1 mg/mL）組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔?？瞻讓φ战M細(xì)胞加入無LPS的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；LPS模型組細(xì)胞加入含LPS（100 ng/mL）的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；各藥物組細(xì)胞先用含相應(yīng)藥物或阻斷劑的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，再用含LPS 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。LPS、TLR4、秋水仙堿的質(zhì)量濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)置[11-12]。

2.5 指標(biāo)檢測

2.5.1 纖維因子和炎癥因子含量 收集各組細(xì)胞上清液，以2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清液，采用ELISA 法以酶標(biāo)儀于570 nm 波長處檢測肝星狀細(xì)胞上清液中α-SMA、TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的含量和肝細(xì)胞上清液中ALT、AST、IL-1β、IL-18的含量。

2.5.2 TLR4/NF-κB/NLRP3 通路相關(guān)基因表達(dá) 采用real-time PCR 法進(jìn)行檢測。收集各組細(xì)胞并提取其總RNA。待測定濃度后，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系包括：cDNA 模板1 μL、SYBR Premix Ex Taq（Ti RNaseH plus）7.5 μL、上/下游引物各0.6 μL、ddH2O 5.3 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。反應(yīng)結(jié)束后，以β-actin 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因mRNA 的表達(dá)量，并以空白對照組作為參照，計(jì)算各組目標(biāo)基因mRNA 的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)、合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

表1 TLR4等目標(biāo)基因的引物序列及產(chǎn)物長度

2.5.3 TLR4/NF-κB/NLRP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá) 采用Western blot 法進(jìn)行檢測。收集各組細(xì)胞，裂解后勻漿，以12 000 r/min離心5 min，取上清液。采用BCA法檢測蛋白濃度后，加buffer 適量并于100 ℃下變性10 min。取變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入TLR4、p-IκBα、NF-κB p65、NLRP3、GSDMD、ASC、β-actin 一抗（稀釋度均為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；用TBST溶液清洗15 min×3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1∶4 000），于37 ℃下孵育90 min。以ECL 化學(xué)發(fā)光底物顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)下曝光成像并使用Image J 1.53 e軟件進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LDS-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 三葉香茶菜提取物對2種細(xì)胞增殖的影響

隨著三葉香茶菜提取物質(zhì)量濃度的增加，肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸降低，提取物對上述2種細(xì)胞的IC50分別為1.66、1.88 mg/mL。因此，在不影響細(xì)胞增殖活力的前提下，本研究選擇1 mg/mL（此質(zhì)量濃度下，該提取物對2 種細(xì)胞的增殖抑制率分別約為65%、71%）作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中三葉香茶菜提取物的干預(yù)濃度。

3.2 三葉香茶菜提取物對2 種細(xì)胞上清液中纖維因子和炎癥因子含量的影響

與空白對照組比較，LPS模型組肝星狀細(xì)胞上清液中TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量和肝細(xì)胞上清液中ALT、AST、IL-1β、IL-18 含量均顯著升高（P＜0.05）；與LPS 模型組比較，各藥物組上述指標(biāo)含量均顯著降低（P＜0.05）。與TLR4 阻斷劑組比較，TLR4 阻斷劑+三葉香茶菜提取物組細(xì)胞上清液中TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅲ和ALT、AST、IL-1β、IL-18 含量均顯著降低（P＜0.05）；而三葉香茶菜提取物組上述指標(biāo)與TLR4阻斷劑組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 三葉香茶菜提取物對2種細(xì)胞上清液中纖維因子和炎癥因子含量的影響（±s，n＝3）

表2 三葉香茶菜提取物對2種細(xì)胞上清液中纖維因子和炎癥因子含量的影響（±s，n＝3）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與LPS模型組比較，P＜0.05；c：與TLR4阻斷劑組比較，P＜0.05

組別空白對照組LPS模型組秋水仙堿組三葉香茶菜提取物組TLR4阻斷劑組TLR4阻斷劑+三葉香茶菜提取物組肝星狀細(xì)胞肝細(xì)胞TGF-β1/（ng/mL）4.08±0.51 23.43±4.52a 14.38±2.67b 12.02±1.88b 11.19±1.52b 6.47±1.05bc α-SMA/（pg/mL）6.38±1.42 68.18±14.11a 39.64±8.84b 32.65±6.45b 30.04±5.01b 14.63±3.11bc COL-Ⅰ/（ng/mL）1.58±0.25 5.01±0.98a 3.46±0.55b 3.09±0.44b 2.83±0.38b 2.10±0.22b COL-Ⅲ/（pg/mL）266.88±37.12 671.71±93.79a 476.75±64.00b 434.92±56.82b 430.08±55.59b 298.57±42.67bc ALT/（pg/mL）635.89±126.58 2 306.14±369.98a 1 553.16±262.80b 1 375.39±212.38b 1 326.68±186.49b 879.14±138.04bc AST/（ng/mL）1.25±0.28 5.26±0.89a 3.46±0.61b 3.05±0.51b 2.92±0.45b 1.85±0.32bc IL-1β/（pg/mL）6.81±1.29 26.20±4.55a 17.16±2.89b 15.26±2.79b 14.83±2.65b 8.41±1.85bc IL-18/（pg/mL）33.47±4.96 92.86±14.04a 64.83±9.31b 57.87±8.53b 57.36±7.72b 38.03±6.17bc

3.3 三葉香茶菜提取物對2 種細(xì)胞中TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

與空白對照組比較，LPS模型組肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞中TLR4、NF-κB p65、NLRP3、GSDMD、ASC mRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05），IκBα mRNA 的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05）。與LPS模型組比較，各藥物組2種細(xì)胞中TLR4、NF-κB p65、NLRP3、GSDMD、ASC mRNA的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05），IκBα mRNA 的表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05）。與TLR4 阻斷劑組比較，TLR4 阻斷劑+三葉香茶菜提取物組2種細(xì)胞中TLR4、NF-κB p65、NLRP3、GSDMD、ASC mRNA 的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05），IκBα mRNA 的表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05）；而三葉香茶菜提取物組上述指標(biāo)與TLR4 阻斷劑組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 三葉香茶菜提取物對2種細(xì)胞中TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)基因表達(dá)的影響（±s，n＝3）

表3 三葉香茶菜提取物對2種細(xì)胞中TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)基因表達(dá)的影響（±s，n＝3）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與LPS模型組比較，P＜0.05；c：與TLR4阻斷劑組比較，P＜0.05

組別空白對照組LPS模型組秋水仙堿組三葉香茶菜提取物組TLR4阻斷劑組TLR4阻斷劑+三葉香茶菜提取物組肝星狀細(xì)胞肝細(xì)胞TLR4 mRNA 1.01±0.16 5.21±0.67a 2.97±0.48b 3.00±0.35b 3.00±0.38b 0.97±0.18bc IκBα mRNA 1.01±0.18 0.69±0.09a 1.17±0.16b 1.18±0.17b 1.12±0.17b 1.78±0.23bc NF-κB p65 mRNA 1.01±0.12 4.96±0.53a 2.69±0.34b 2.42±0.30b 2.45±0.31b 1.05±0.15bc NLRP3 mRNA 1.01±0.18 5.54±0.44a 3.72±0.49b 3.53±0.63b 3.40±0.42b 1.02±0.18bc GSDMD mRNA 1.02±0.18 5.35±0.70a 3.66±0.48b 3.45±0.48b 3.48±0.43b 1.07±0.16bc ASC mRNA 1.01±0.15 4.92±0.72a 2.31±0.30b 2.39±0.34b 2.36±0.35b 1.03±0.20bc TLR4 mRNA 1.01±0.13 5.54±0.54a 3.15±0.51b 3.21±0.41b 3.33±0.49b 1.11±0.17bc IκBα mRNA 1.01±0.14 0.63±0.07a 0.97±0.16b 0.99±0.17b 1.00±0.17b 1.90±0.27bc NF-κB p65 mRNA 1.01±0.1 5.07±0.59a 2.93±0.48b 2.99±0.51b 3.04±0.53b 1.08±0.17bc NLRP3 RNA 1.01±0.16 4.95±0.54a 3.08±0.32b 2.92±0.36b 3.00±0.45b 1.13±0.17bc GSDMD mRNA 1.01±0.17 5.66±0.56a 3.77±0.44b 3.47±0.50b 3.58±0.43b 1.04±0.15bc ASC mRNA 1.01±0.17 5.14±0.54a 3.33±0.67b 3.27±0.47b 3.11±0.46b 1.08±0.18bc

3.4 三葉香茶菜提取物對2 種細(xì)胞中TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，LPS模型組肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞中TLR4、p-IκBα、NF-κB p65、NLRP3、GSDMD、ASC蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。與LPS 模型組比較，各藥物組2種細(xì)胞中上述蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。與TLR4阻斷劑組比較，TLR4阻斷劑+三葉香茶菜提取物組2 種細(xì)胞中TLR4、p-IκBα（肝星狀細(xì)胞除外）、NF-κB p65、NLRP3、GSDMD、ASC 蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；而三葉香茶菜提取物組上述指標(biāo)與TLR4 阻斷劑組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4、圖1。

表4 三葉香茶菜提取物對2種細(xì)胞中TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

表4 三葉香茶菜提取物對2種細(xì)胞中TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與LPS模型組比較，P＜0.05；c：與TLR4阻斷劑組比較，P＜0.05

組別空白對照組LPS模型組秋水仙堿組三葉香茶菜提取物組TLR4阻斷劑組TLR4阻斷劑+三葉香茶菜提取物組肝星狀細(xì)胞肝細(xì)胞TLR4 0.58±0.16 1.37±0.24a 0.94±0.17b 0.92±0.16b 0.91±0.12b 0.54±0.11bc p-IκBα 0.72±0.10 1.51±0.24a 1.12±0.19b 1.05±0.15b 0.98±0.15b 0.75±0.09b NF-κB p65 0.40±0.08 1.53±0.27a 0.96±0.13b 0.91±0.13b 0.93±0.11b 0.44±0.06bc NLRP3 0.96±0.16 2.19±0.46a 1.37±0.20b 1.27±0.27b 1.26±0.29b 0.76±0.12bc ASC 0.40±0.10 1.16±0.24a 0.71±0.18b 0.73±0.16b 0.63±0.12b 0.34±0.05bc GSDMD 0.58±0.11 1.42±0.26a 0.87±0.17b 0.84±0.18b 0.83±0.16b 0.41±0.08bc TLR4 0.70±0.12 1.63±0.30a 0.96±0.23b 1.11±0.26b 1.11±0.15b 0.61±0.12bc p-IκBα 0.54±0.09 1.16±0.15a 0.76±0.10b 0.80±0.10b 0.74±0.10b 0.53±0.09bc NF-κB-p65 0.25±0.05 1.02±0.18a 0.54±0.11b 0.71±0.14b 0.73±0.16b 0.29±0.05bc NLRP3 0.50±0.10 1.22±0.28a 0.78±0.16b 0.80±0.15b 0.78±0.12b 0.49±0.10bc GSDMD 0.35±0.06 0.97±0.19a 0.55±0.20b 0.68±0.18b 0.64±0.13b 0.34±0.05bc ASC 0.47±0.09 1.03±0.10a 0.68±0.08b 0.72±0.11b 0.68±0.10b 0.38±0.05bc

圖1 三葉香茶菜提取物對2 種細(xì)胞中TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響的電泳圖

4 討論

本研究在前期動物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用原代肝星狀細(xì)胞和原代肝細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，研究三葉香茶菜提取物對TLR4/NF-κB/NLRP3通路的影響，以進(jìn)一步揭示其抗HF 的分子機(jī)制。研究表明，肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞所構(gòu)成的肝臟微環(huán)境直接影響HF 的進(jìn)展，肝細(xì)胞通常是損傷的初始目標(biāo)，隨后通過與肝星狀細(xì)胞間的相互作用（包括炎癥反應(yīng)和再生反應(yīng)）來直接或間接激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成、分泌[8，13]。因此，本研究采用原代肝星狀細(xì)胞和原代肝細(xì)胞開展體外實(shí)驗(yàn)。

ECM 沉積是HF 的主要特征，也是該癥的主要驅(qū)動因素[14]。膠原蛋白是ECM 的主要結(jié)構(gòu)性纖維不溶性蛋白，也是ECM 的主要成分[15]。TGF-β1在多種纖維化疾?。ê琀F）中起核心作用，能激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)ECM產(chǎn)生、沉積，從而導(dǎo)致HF 的形成[16-17]。在肝損傷期間，肝星狀細(xì)胞被激活并轉(zhuǎn)化為表達(dá)α-SMA的收縮性肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致血管變形和血管阻力增加，從而引發(fā)門靜脈高壓，可見抑制α-SMA 可減緩HF 的進(jìn)展[18]。本研究結(jié)果顯示，三葉香茶提取物能降低肝星狀細(xì)胞上清液中TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的含量，表明其可抑制TGF-β1活化，從而使肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為收縮性肌成纖維細(xì)胞的途徑受阻，最終抑制了COL-Ⅰ、COL-Ⅲ等ECM成分的分泌。

在肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞組成的微環(huán)境中，瀕死的肝細(xì)胞會觸發(fā)先天免疫系統(tǒng)，激活無菌性炎癥反應(yīng)，從而對鄰近肝細(xì)胞造成進(jìn)一步損傷并激活肝星狀細(xì)胞[19]。有證據(jù)表明，從死亡肝細(xì)胞中釋放的物質(zhì)可作為肝星狀細(xì)胞激活和分化的重要介質(zhì)，從而上調(diào)TGF-β1和COL-Ⅰ的分泌[20]。研究表明，LPS 可通過刺激肝細(xì)胞、激活NF-κB 通路來促進(jìn)肝細(xì)胞中NLRP3、IL-1β、IL-18 的表達(dá)[21]，上述炎癥因子可激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)膠原沉積，從而加重HF[8]。本研究結(jié)果顯示，三葉香茶菜提取物能降低肝細(xì)胞上清液中ALT、AST、IL-1β、IL-18的含量，表明其能減輕肝細(xì)胞的炎性損傷。

有研究指出，TLR4/NF-κB/NLRP3是一條重要的炎癥反應(yīng)通路，TLR4 與LPS 結(jié)合可活化其下游IκB 激酶，使IκBα 磷酸化后降解，從而激活NF-κB，促進(jìn)NLRP3、ASC 和胱天蛋白酶1 前體表達(dá)并組裝形成NLRP3 炎癥小體，活化的NLRP3 炎癥小體可促進(jìn)細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白GSDMD活化、成熟，使細(xì)胞腫脹、裂孔而釋放IL-1β、IL-18 等炎癥因子，最終造成肝星狀細(xì)胞或肝細(xì)胞受損[22-23]。經(jīng)LPS 刺激后，肝星狀細(xì)胞可通過TLR4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和NF-κB 活化而被激活，分泌TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ等因子，從而促進(jìn)HF的發(fā)展；經(jīng)LPS刺激后，肝細(xì)胞的TLR4 被激活，使IL-1β、IL-18 等炎癥因子分泌增加，從而造成炎性損傷[24-25]。此外有研究表明，NLRP3炎癥小體可誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡并釋放至細(xì)胞外被肝星狀細(xì)胞吞噬，導(dǎo)致IL-1β 和α-SMA 分泌的增加，從而加重HF[8]。本研究結(jié)果顯示，三葉香茶菜提取物能下調(diào)肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞中TLR4、NF-κB p65、NLRP3、GSDMD、ASC mRNA 的表達(dá)，上調(diào)IκBα mRNA 的表達(dá)，并可降低TLR4、p-IκBα、NF-κB p65、NLRP3、GSDMD、ASC 蛋白的表達(dá)，降低肝星狀細(xì)胞上清液中TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的含量和肝細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18 的含量，提示三葉香茶菜提取物可通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3 通路活化來減輕肝細(xì)胞的炎性損傷，抑制肝星狀細(xì)胞的活化，減少纖維因子的合成分泌。

此外，本課題組前期動物實(shí)驗(yàn)研究表明，作為陽性對照的秋水仙堿可明顯減輕大鼠HF 程度，本研究結(jié)果也得出了相似的結(jié)果。TLR4 阻斷劑可阻斷TLR4/NFκB/NLRP3 通路，抑制炎癥因子和纖維因子的表達(dá)[12]。本結(jié)果顯示，TLR4 阻斷劑同樣可下調(diào)肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞中上述指標(biāo)的分泌或表達(dá)，且TLR4 阻斷劑聯(lián)合三葉香茶菜提取物對上述多數(shù)指標(biāo)的下調(diào)趨勢更加明顯，表明三葉香茶菜提取物抗HF作用除調(diào)控TLR4/NF-κB/NLRP3 通路外，可能還存在其他作用途徑，但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，三葉香茶菜提取物能通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路活化，減少纖維因子、炎癥因子釋放，減輕肝細(xì)胞炎性損傷，抑制肝星狀細(xì)胞活化，從而發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞、抗HF的作用。但是，本研究尚未明確三葉香茶菜對肝星狀細(xì)胞與肝細(xì)胞相互作用的影響，有待后續(xù)研究予以完善。