豬繁殖與呼吸綜合征的研究進(jìn)展

史靜，王許剛，盧佳慧，李龍飛，張瑞華，徐彤★

（1.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，河北張家口 075000；2.兆豐華生物科技（南京）有限公司，江蘇南京 211100）

豬繁殖與呼吸綜合征,俗稱“藍(lán)耳病”，是由繁殖呼吸綜合征病毒 （porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PPRSV)引起豬的一種具有高度接觸性和高死亡率的傳染性疾病。 典型的臨床癥狀為斷奶前后的仔豬會出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病以及妊娠后期母豬繁殖障礙， 該病自1987 年首次報(bào)道以來，尤其是2006 年變異性高致病性PPRSV 的出現(xiàn)，給我國生豬養(yǎng)殖行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 盡管非洲豬瘟在我國的發(fā)生對生豬養(yǎng)殖業(yè)導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失， 但是在常態(tài)化非洲豬瘟防控下如何做好以繁殖呼吸綜合征等重要疾病對于提高生豬養(yǎng)殖業(yè)提質(zhì)增效仍具有重要意義?，F(xiàn)將PPRS 的現(xiàn)狀以及防控措施綜述如下。

1 PRRSV 的歷史

1987 年美國首次報(bào)道了PRRS 的存在，隨后在歐洲和亞洲分別報(bào)道該病的存在(1990-1992)。 科學(xué)家Vensvoort 和Collins 分別于1991年和1992 年在荷蘭和美國分離出豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。 最初分離的毒株分別為命名為Lelystad 病毒（歐洲毒株）和豬不育和呼吸綜合征(SIRS) 病毒（也稱為ATCC VR-2332，北美毒株）。1992 年正式命名為豬繁殖呼吸綜合征病毒。 我國于1996 年分離出PRRSV 兩種不同毒株分別為CH-1a 和BJ-4。 同年，從加拿大進(jìn)口種豬中成功分離出PRRSV 毒株， 與BJ-4的基因組同源性約為99.6%，CH-1a 與JA142的基因組同源性約為94.5%。 兩者（尤其是BJ-4）與北美分離株密切相關(guān)，說明PRRSV 的傳播很大可能由進(jìn)口種豬傳入我國。另外，PRRSV 在1995～2005 年間主要呈地方性流行。 2006 年，在中國出現(xiàn)的HP-PRRSV 變種導(dǎo)致PRRS 大流行和20%的豬死亡率。自2013 年以來，PRRS 再次在中國流行， 這是由新的PRRSV 變種NADC30樣毒株引起， 是從北美進(jìn)口并在中國發(fā)生了毒株變異。 此后，PRRSV 迅速蔓延到中國其他地區(qū)，對中國養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了很大的影響。

PRRSV 屬于多尼病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬。 PRRSV 分為歐洲型(PRRSV-1)和北美型(PRRSV-2)兩個基因型，共有核苷酸序列只有55%～70%。最近國際病毒委員會（ICVA）新分類為豬乙型動脈炎病毒1 型(Betaarterivirus suid1) 和豬乙型動脈炎毒2 型(Betaarterivirus suid2）即種1 和種2。 我國的流行毒株主要以2型PRRSV 為主。 PRRSV 為球狀顆粒，直徑不超過100 納米，有囊膜，表面有刺突，磷脂雙分子層構(gòu)成病毒外殼。 內(nèi)部是由核衣殼蛋白包裹著病毒單股正鏈RNA 組成， 基因組全長約為15kb。 病毒模型見下圖。 PRRSV 易受光照、溫度和pH 的影響，耐低溫不耐高溫，可在-70℃和-20℃下存活數(shù)年及數(shù)月。在4℃存活1 個月；20℃～21℃下可存活1～6 天；在37℃下只可存活數(shù)小時；56℃時20 分鐘就會將其滅活。 PRRSV 對酸堿易感，在pH6.5～7.5 穩(wěn)定，但當(dāng)pH 高于7.5 或低于6.5 時， 感染力迅速喪失。 從宿主分離的PRRSV 是沒有血凝活性， 但經(jīng)非離子去污劑及脂質(zhì)溶劑處理后， 可使小鼠紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象。 此外，經(jīng)Tween-80 或乙醚處理后也可出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，但凝集特性可以被PRRSV 特異性抗血清所抑制。

圖 病毒模型圖

2 PRRSV 的基因組及蛋白結(jié)構(gòu)

PRRSV 基因組長約為15.4kb，由11 個已知的開放閱讀框（ORFs）互相重疊構(gòu)成。 其中位于5′-近端的ORF1a 和1b 長度占整個基因組的80%左右，其翻譯產(chǎn)物均為多聚蛋白，編碼病毒RNA 聚合酶以及復(fù)制酶。ORF1a 和ORF1b 區(qū)域編碼兩個復(fù)制酶-多聚蛋白前體pp1a （polyprotein 1a）、pplab。pp1a 和pplab 被病毒自身的蛋白酶Nsp1，Nsp2 及Nsp4 分解成16 個不同的非結(jié)構(gòu)蛋白，包括Nsp1α/β、Nsp2-6、Nsp7α/β、Nsp8-12、Nsp2TF 和Nsp2N。它們攜帶具有酶活性如病毒RNA 聚合酶、解旋酶、核酸內(nèi)切酶等。 這些蛋白在病毒的基因組轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯和蛋白組裝過程中可以激活蛋白酶、 復(fù)制酶和剪切酶的活性。 ORF2a、ORF2b、ORF3-ORF7 和ORF5a 編碼八種結(jié)構(gòu)蛋白：GP2、包膜蛋白(E)、GP3-5、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和ORF5a 蛋白。

Nsp4 是主要的蛋白酶， 可介導(dǎo)大多數(shù)Nsp加工。 Nsp1α、Nsp1β 和Nsp2 為三種輔助半胱氨酸蛋白酶，其作用是單個切割位點(diǎn)自催化加工。Nsp2 包含幾個免疫顯性B 細(xì)胞表位， 雖然對于病毒復(fù)制是可有可無的， 但是可以以某種方式調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)。 ORF1b 編碼的Nsp9-11，包含病毒RNA 依賴性RNA 聚合酶(RdRp)、解旋酶的假定結(jié)構(gòu)域和尿苷酸特異性內(nèi)切核糖核酸酶 (NendoU)。 在 不 同 程 度 上，Nsp1α、Nsp1β、Nsp2 和Nsp4 、Nsp11 通過抑制干擾素β （IFNβ）啟動子的激活來減弱I 型IFN 反應(yīng)，破壞宿主先天免疫。

ORF2a 與ORF3-5 編碼四種膜相關(guān)N-糖基 化 蛋 白， 分 別 為GP2a、GP3、GP4 和GP5，ORF2b 與ORF6 編碼E 和M 兩種非糖基化膜蛋白。 ORF7 編碼包裹病毒RNA 基因組的核衣殼蛋白N。GP2a、GP3 和GP4 形成異源三聚體復(fù)合物， 是組裝感染性PRRSV 病毒粒子所必需的，還可與GP5 的相互作用， 但只有GP2a 和GP4被發(fā)現(xiàn)與PCD163 PRRSV 受體相互作用。

N 蛋白是ORF7 病毒基因所編碼，為病毒衣殼的唯一組成部分， 可通過共價和非共價相互作用與自身相互作用。N 蛋白基本作用是病毒生命周期的細(xì)胞外階段為病毒基因組提供保護(hù)性外殼。鑒于N 蛋白是PRRSV 衣殼的唯一組成部分，具有高度免疫原性的蛋白，因而成為檢測病毒特異性抗體和診斷疾病的合適候選蛋白。PRRSV N 蛋白在病毒感染過程中起雙重作用,細(xì)胞核/核仁中的病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白功能和非結(jié)構(gòu)蛋白作用， 表明這些隔間中的N 蛋白定位可能在病毒發(fā)病機(jī)制中起基礎(chǔ)作用， 例如細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)等。

M 蛋白是一種18 至19KDa 的III 類膜蛋白，由ORF6 病毒基因編碼。 該蛋白膜結(jié)構(gòu)由三個連續(xù)跨膜結(jié)構(gòu)域的核心組成， 其前為13-18AA 的外結(jié)構(gòu)域， 后為81-87 AA 的C 端內(nèi)結(jié)構(gòu)域。 正如冠狀病毒密切相關(guān)的M 蛋白實(shí)驗(yàn)所證明的那樣，M 蛋白可能在病毒組裝和出芽過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 M蛋白是非糖基化的， 是動脈病毒和PRRSV 最保守的結(jié)構(gòu)蛋白。

GP5–M 異二聚體對病毒感染性至關(guān)重要，是馬動脈炎病毒（EAV）病毒粒子組裝的關(guān)鍵步驟。 PRRSV GP5 和M蛋白之間的二硫鍵可能分別發(fā)生在位置50 和8（歐盟分離株）的半胱氨酸殘基之間。這些殘基中的任何一個突變都會導(dǎo)致粒子產(chǎn)生的完全阻斷， 這表明GP5 和M 的共價結(jié)合對于病毒組裝至關(guān)重要。

GP5 蛋白是最豐富的包膜糖蛋白， 含有主要的中和表位。 GP5 蛋白是一種重要的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，暴露于病毒粒子表面，并參與感染或免疫動物的細(xì)胞凋亡、識別與結(jié)合、免疫保護(hù)及抗體依賴性病毒中和等。 GP5 通過N-糖基化降低中和表位的免疫原性， 同時也是逃避中和抗體免疫反應(yīng)的一種途徑。 其他能夠誘導(dǎo)中和抗體但程度明顯低于GP5 的病毒表位似乎駐留在其他PRRSV 蛋白上，如M、GP2a、GP3 和GP4。GP5免疫動物可產(chǎn)生部分保護(hù)性免疫反應(yīng)， 與單獨(dú)使 用GP5 相 比，GP5 融 合 蛋 白 （如MGP5、GP3GP5、GP4GP5、或者GP3GP4GP5）可增強(qiáng)接種動物的保護(hù)性免疫反應(yīng)。 因此， 在疫苗開發(fā)中，GP5 應(yīng)該通過與其他病毒蛋白進(jìn)行融合或者通過降低N-糖基化狀態(tài)，提高其誘導(dǎo)中和抗體的能力。

GP3 蛋白由ORF3 基因編碼， 是最可變的PRRSV 蛋白之一，具有高度的抗原性。盡管豬體內(nèi)存在極低水平的GP3 抗體， 但據(jù)報(bào)道它在清除病毒感染方面發(fā)揮作用， 并可能與GP5 和M蛋白一起參與病毒中和作用。

GP4 蛋白是一種I 類整合膜蛋白分子量為31 至35 KDa，具有N 端信號序列和C 端膜錨定區(qū)。 GP4 蛋白在通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)過程中高度糖基化。 在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了四個假定的N-連接糖基化位點(diǎn)， 在NA 和EU PRRSV 毒株中是保守的。 氨基酸序列顯示，GP4在位置1-22 處含有一個假定的N-末端信號序列，在C-末端的位置162-178 處含有一個額外的疏水序列。 GP4 蛋白是一種次要結(jié)構(gòu)蛋白，分別由178 和183 個氨基酸組成， 適用于NA 和EU 毒株，與GP5 類似，能夠在較小程度上誘導(dǎo)中和抗體。用ORF4 缺失的感染性cDNA 克隆轉(zhuǎn)染PRRSV 許可細(xì)胞表明ORF4 基因?qū)Σ《緩?fù)制至關(guān)重要。

3 PRRSV 的致病機(jī)理

豬是唯一已知的PRRSV 自然宿主。 PRRSV感染后最先攻擊的是肺臟器官，PRRSV 破壞呼吸道假復(fù)層纖毛上皮， 并且在豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM) 進(jìn)行復(fù)制， 阻止微生物從呼吸系統(tǒng)中清除。PAM 主要功能包括吞噬作用、抗原呈遞和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。PRRSV 誘導(dǎo)PAM 的壞死或凋亡并且還誘導(dǎo)肺和淋巴器官中淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡，損害宿主免疫反應(yīng)。

PRRSV 感染分為急性感染、 持續(xù)感染與消亡三個階段。第一階段為急性感染，PRRSV 首先攻擊肺部的巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞， 并在感染后6～12 小時內(nèi)出現(xiàn)病毒血癥。雖然存在循環(huán)抗體，但血清病毒血癥一直存在數(shù)周。 第二階段為持續(xù)感染，由于病毒的復(fù)制減弱，此時在血液及肺部檢測不到病毒，臨床癥狀不明顯。 在這個階段病毒復(fù)制主要局限在扁桃體和淋巴結(jié)。 局部淋巴結(jié)中持續(xù)的病毒復(fù)制是病毒通過口鼻分泌物和精液傳播給未感染的豬的主要原因。 感染的最后階段為病毒的消亡，隨著病毒復(fù)制的減少，宿主清除病毒，直至消失。 目前病毒消失的時間尚不明確， 但感染后的排毒最高可持續(xù)8 個月以上，造成“終身”感染。 因此，PRRSV 復(fù)制不會建立穩(wěn)定狀態(tài)的平衡， 而是隨著時間的推移逐漸下降， 淋巴器官是病毒消亡前病毒復(fù)制的最后部位。

母胎界面內(nèi)的細(xì)胞變化和局部免疫反應(yīng)的機(jī)制以及在PRRS 相關(guān)生殖疾病中的病理生理作用尚不清楚。 PRRSV 到達(dá)子宮內(nèi)膜結(jié)締組織最可能與通過子宮內(nèi)膜血管遷移的單核細(xì)胞有關(guān)；隨后病毒可在Sn/CD169 和CD163 巨噬細(xì)胞中復(fù)制。 病毒復(fù)制通過凋亡和可能的繼發(fā)性壞死導(dǎo)致局部感染細(xì)胞和周圍細(xì)胞死亡， 導(dǎo)致胎兒胎盤的局灶性脫離和變性， 這可能是胎兒死亡的原因，而不是PRRSV 在胎兒組織內(nèi)復(fù)制的直接結(jié)果。 病毒復(fù)制受子宮內(nèi)膜和胎兒胎盤中靶細(xì)胞數(shù)量的影響。 盡管CD163 細(xì)胞的數(shù)量在整個妊娠期一直較高，但Sn/CD169 細(xì)胞的數(shù)量在胎兒胎盤內(nèi)的細(xì)胞及妊娠晚期最高。 PRRSV到達(dá)胎兒后，病毒復(fù)制發(fā)生在肺、肝、脾、心和腎等組織中。 可以在淋巴組織和胎兒胸腺中檢測到病毒，后者被認(rèn)為是病毒復(fù)制的主要位點(diǎn)。

母體來源或通過接種獲得的PRRSV 特異性抗體可促進(jìn)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞， 從而增加傳染性，稱為抗體依賴性增強(qiáng)(ADE)，其潛在機(jī)制目前尚不清楚， 但ADE 現(xiàn)象影響PRRSV 疫苗的開發(fā)。 其他RNA 病毒研究發(fā)現(xiàn)表明ADE 不僅能增強(qiáng)病毒攝取，還可能抑制宿主的I 型干擾素系統(tǒng)。 ADE 使病毒避免于自分泌和旁分泌所產(chǎn)生的IL-10 的抗炎和免疫抑制作用。 由于PRRSV 感染豬的支氣管肺泡灌洗液中IL-10 的產(chǎn)生顯著增加， 推測在PRRSV 感染的ADE 過程中，PAM 中IL-10 會發(fā)生顯著的上調(diào)，這可能有助于下調(diào)IFN-α/β 和其他炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。 因此， 減弱或消除可能由疫苗接種引起的ADE 的負(fù)面影響應(yīng)被視為開發(fā)新型PRRSV 疫苗的關(guān)鍵因素。

由于對免疫細(xì)胞的影響導(dǎo)致的免疫抑制，PRRSV 增加了宿主對多種病毒及細(xì)菌呼吸道病原的易感性，使豬的臨床癥狀更加明顯，肺部病變也更為嚴(yán)重。PRRSV 常與一些疾病混合感染，包括豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)、 豬流感病毒（SIV）和豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）等疾病。與單獨(dú)感染PRRSV 的豬相比，混合感染的豬會出現(xiàn)更嚴(yán)重的臨床癥狀和生長遲緩等現(xiàn)象。 在同時感染PRRSV 和PRCV 的豬中，嚴(yán)重的臨床癥狀與肺部先天免疫反應(yīng)受損有關(guān)， 特別是由于干擾素(IFN)-α 表達(dá)降低導(dǎo)致自然殺傷細(xì)胞(NK) 介導(dǎo)的細(xì)胞毒性降低。 適應(yīng)性免疫反應(yīng)也受損，白細(xì)胞介素IL-6 和IL-10 濃度增加進(jìn)而引起PAM 細(xì)胞凋亡增強(qiáng)有關(guān)。

4 國內(nèi)PRRSV 感染情況

湯國祥對2006～2007 年湖南省5 個市豬藍(lán)耳病感染情況進(jìn)行調(diào)查。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)藍(lán)耳病感染率68.94%。 其中6～8 月感染率最高，12～2 月最低。 范京惠等研究發(fā)現(xiàn)2008～2009 年河北省不同豬場PRRS 的總體陽性率53.04%， 其中未免疫疫苗的豬場陽性率33.57%； 免疫過的陽性率73.94%； 仔豬的陽性率為33.86%。 高許雷等對2008～2009 年我國五省區(qū) 屠宰場的樣品進(jìn)行了HPPRRSV 檢測， 結(jié)果檢出陽性率為44%。張子佳等研究發(fā)現(xiàn)2006～2011 年唐山地區(qū)64 個縣級屠宰場的總陽性率為51.56%。 另外，樣品總陽性率為20.29%， 其中高致病性PRRSV 和 經(jīng) 典PRRSV 樣 品分別為15.94%和4.35%。 汪招雄等對湖北省12 個集約化養(yǎng)豬場血清藍(lán)耳病毒（PRRSV） 抗體檢測結(jié)果顯示PRRSV 總陽性率為26.38%，其中母豬群陽性率最高，保育仔豬陽性率最低。楊克禮等研究發(fā)現(xiàn)鄂西山區(qū)2013～2015 年間全部未免疫PRRSV 疫苗豬的PRRSV 抗體陽性率為48.45%并且PRRSV 與PCV2、PRV 出現(xiàn)混合感染。 鄒秀明等發(fā)現(xiàn)2016～2018 年懷化市部分地區(qū)豬場PRRS 抗體陽性率為75.52%。 免疫疫苗的抗體陽性率為86.41%， 未免疫的規(guī)?；i場為27.63%。 綜上所述，PRRSV 感染已在全國各省不同地區(qū)豬場中普遍存在,同時存在較高比例的隱性感染豬群， 以NADC30-like 株為主多種毒株共存，臨床癥狀多樣化，因此繁殖呼吸綜合征病毒感染仍然是影響我國生豬健康養(yǎng)殖的重要傳染病之一。

5 PRRSV 防治措施

PRRS 具有致病力強(qiáng)、致死率高、傳播快、易變異等特點(diǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 當(dāng)今豬場危害最大的疾病是PRRS，增強(qiáng)豬群免疫力，最大限度的降低感染壓力，綜合防治結(jié)合疫苗的策略進(jìn)行防控。PRRSV 的傳播多樣且復(fù)雜，均能引起動物發(fā)病。 有研究表明，新感染的豬一部分是直接通過病豬或者感染公豬的精液的途徑而感染，75%以上的比例是由飛禽，老鼠，蚊蟲以及運(yùn)輸途中攜帶病毒的運(yùn)輸工具引起。

對于PRRS 的防控管理是首位；其次是做好臨床監(jiān)測和規(guī)范合理的疫苗免疫， 最終實(shí)現(xiàn)凈化和根除PRRS 才是根本。在管理上要制定科學(xué)合理的生物安全制度，如豬場的合理布局、堅(jiān)持全進(jìn)全出制度、堅(jiān)持自繁自養(yǎng)、豬場內(nèi)的消毒問題、做好藥物保健降低寄生蟲疾病，細(xì)菌性疾病的感染壓力、 加強(qiáng)免疫營養(yǎng)減少應(yīng)激增強(qiáng)豬群的非特異性免疫、 豬場物資和人員進(jìn)場制定使用合理的消毒程序；要控制合理的養(yǎng)殖密度，在養(yǎng)殖密集區(qū)可以選擇安裝空氣過濾系統(tǒng)以降低感染風(fēng)險(xiǎn)； 當(dāng)今豬場引種成了最大的生物安全挑戰(zhàn)，因?yàn)橐N而導(dǎo)致重大疾病時有發(fā)生，因此在引種前要建立引種及隔離程序， 而且程序是經(jīng)過技術(shù)驗(yàn)證科學(xué)可行的，并保證執(zhí)行到位。 做好豬場生物安全能夠降低感染病原微生物的壓力， 阻止疾病傳播， 提高養(yǎng)殖場經(jīng)濟(jì)效益的目的。

PRRS 防控的核心是科學(xué)合理的疫苗免疫，目前我國使用的PRRS 疫苗按疫苗種類分為：滅活疫苗、減毒活疫苗、基因工程苗。 按毒株分類有：經(jīng)典毒株疫苗、高致病性毒株疫苗、經(jīng)典毒株(ORF1a)+高致病性毒株(ORF2-7)疫苗三類。其中經(jīng)典毒株疫苗包括滅活疫苗的CH-1a 株，減毒活疫苗的CH-IR 株、R98 株、VR-2332 株。 高致病性毒株包括滅活疫苗的JXA1 株、減毒活疫苗的GDr180、 JXA1-R 株、TJM-F92 株、HuN4-F112 株。 經(jīng)典毒株 (ORF1a)+高致病性毒株(ORF2-7)為基因工程疫苗PC 株。 這10 種疫苗在我國各個地區(qū)廣泛使用， 而且有研究證實(shí)經(jīng)典毒株或高致病性毒株疫苗面對現(xiàn)在的NADC30-like 主導(dǎo)毒株能提供60%～70%的保護(hù)。 面對種類繁多的疫苗豬場要選擇適合本場實(shí)際情況的疫苗，切忌多毒株疫苗混用，要充分考慮活疫苗的安全性問題和滅活苗的有效性問題，規(guī)模化豬場建議進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測，制定合理免疫程序，做好定期的抗體檢測。 未來希望可以研究出可以具有標(biāo)記的DIVA 疫苗，來區(qū)分自然感染和疫苗免疫， 提供更廣的交叉保護(hù)并能刺激較好的非特異性免疫應(yīng)答的PRRS 疫苗，終止現(xiàn)在多疫苗混用的局面。實(shí)現(xiàn)PRRS 的凈化與根除才是根本。