基因芯片技術(shù)在腎移植術(shù)后患者肺部感染病原菌 快速檢測(cè)中的臨床價(jià)值

李達(dá)明， 呂 星， 蔣傳好， 胡 敏

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

為了防止移植排斥反應(yīng)，腎移植術(shù)后患者需長(zhǎng)期服用免疫抑制劑，這會(huì)使機(jī)體的免疫功能受到影響，增加感染的風(fēng)險(xiǎn)，其中泌尿系感染最為常見(jiàn)，但是肺部感染的病死率最 高[1]。早期診斷和治療有助于有效控制病情，但由于接受免疫抑制治療導(dǎo)致患者免疫功能低下，炎癥反應(yīng)往往不典型，病情很難被及時(shí)發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌培養(yǎng)是診斷細(xì)菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于細(xì)菌培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)的體內(nèi)、體外條件不能達(dá)到完全相同，導(dǎo)致檢出率不高，容易耽誤治療。近年來(lái)，分子生物技術(shù)已成為傳統(tǒng)細(xì)菌感染診斷方法的重要補(bǔ)充，也是快速診斷病原菌的主要研究方向?；蛐酒夹g(shù)是一種新型核酸檢測(cè)方法，在細(xì)菌感染檢測(cè)中具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。本研究將基因芯片技術(shù)與細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)腎移植術(shù)后患者肺部感染病原菌的應(yīng)用效果進(jìn)行比較，分析基因芯片技術(shù)在此類(lèi)感染中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2018年11月—2019年12月中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院290例腎移植術(shù)后患者[男195例、女95例，年齡（40.87±11.31）歲]的呼吸道樣本（痰樣本136例、肺泡灌洗液樣本152例、咽拭子樣本2例）。根據(jù)是否發(fā)生肺部感染，分為肺部感染組[149例，其中男101例、女48例，年齡（41.56±10.92）歲]和非肺部感染組[141例，其中男94例、女47例，年齡（39.65±10.89）歲]。肺部感染診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)2016年發(fā)布的《中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》[2]：（1）社區(qū)發(fā)?。唬?）新近出現(xiàn)的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；發(fā)熱；肺實(shí)變體征和（或）聞及濕性啰音；白細(xì)胞＞ 10×109/L或＜4×109/L，伴或不伴細(xì)胞核左移；以上任意1項(xiàng)；（3）胸部X線檢查顯示片狀、斑片狀浸潤(rùn)性陰影或間質(zhì)性改變，伴或不伴胸腔積液。排除肺結(jié)核、肺部腫瘤、非感染性肺間質(zhì)性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)癥及肺血管炎患者。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 儀器和試劑

北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司呼吸道病原體核酸檢測(cè)試劑盒、RTisochip-A恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀。美國(guó)BD公司Phoenix 100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套細(xì)菌鑒定/藥敏板。鄭州貝瑞特生物技術(shù)有限責(zé)任公司哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、沙保弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基/中國(guó)藍(lán)瓊脂二分格培養(yǎng)基。江門(mén)凱林貿(mào)易有限公司嗜血桿菌巧克力瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集患者術(shù)后次日晨起后經(jīng)清水反復(fù)漱口后的痰樣本136例，經(jīng)支氣管纖維鏡沖洗后的肺泡灌洗液樣本152例，咽拭子 2例。及時(shí)送檢。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定 將留取的臨床樣本接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基和沙保弱葡萄糖/中國(guó)藍(lán)二分格培養(yǎng)基、嗜血桿菌巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，置于35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～ 24 h，采用Phoenix 100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套細(xì)菌鑒定/藥敏板進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.3 基因芯片技術(shù)檢測(cè) 采用呼吸道病原體核酸檢測(cè)試劑盒配套的核酸提取試劑，按照其說(shuō)明書(shū)要求處理呼吸道樣本，并進(jìn)行核酸提取。提取核酸后，采用RTisochip-A恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)合配套的軟件分析，可一次性檢測(cè)12種常見(jiàn)呼吸道病原體：肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、肺炎支原體、肺炎衣原體。檢測(cè)完成后，采用最大二階導(dǎo)數(shù)法結(jié)合其他算法計(jì)算出“S型”擴(kuò)增曲線進(jìn)入快速擴(kuò)增期的第1個(gè)拐點(diǎn)，拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)的時(shí)刻與原點(diǎn)時(shí)刻的差值定義為T(mén)p值，結(jié)合Tp值陽(yáng)性判斷值進(jìn)行結(jié)果判讀?！盁晒馇€區(qū)域”顯示歸一化曲線，“檢測(cè)結(jié)果”區(qū)域顯示質(zhì)控結(jié)果和各檢測(cè)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)檢測(cè)指標(biāo)的Tp值≤陽(yáng)性判斷值時(shí)，判讀為陽(yáng)性；當(dāng)檢測(cè)指標(biāo)的Tp值＞陽(yáng)性判斷值時(shí)，判讀為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2種方法檢測(cè)結(jié)果

2 9 0例樣本中，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性5 0例（17.24%），包括11種病原菌，以革蘭陰性桿菌為主（36株，72.00%），其中肺炎克雷伯菌9株（18.00%）、嗜麥芽窄食單胞菌和銅綠假單胞菌各6株（12.00%）；基因芯片技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性84例（28.97%），包括11種呼吸道病原菌，其中肺炎克雷伯菌17株（20.24%）、流感嗜血桿菌和銅綠假單胞菌各16株（19.05%）。見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌培養(yǎng)與基因芯片技術(shù)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果 株

2.2 基因芯片技術(shù)、細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷比較

290例患者中，基因芯片技術(shù)檢出84例陽(yáng)性、2 0 6例陰性，臨床敏感性為6 5.4 8%（55/84），臨床特異性為54.37%（112/206）；二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.62，P＜0.01）。細(xì)菌培養(yǎng)檢出50例陽(yáng)性、240例陰性，臨床敏感性為64.00%（32/50），臨床特異性為51.25%（123/240）；二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.266，P=0.07）。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片技術(shù)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為36.91%（55/149），陰性預(yù)測(cè)值為79.43%（112/141）；細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為21.48%（32/149），陰性預(yù)測(cè)值87.23%（123/141）。見(jiàn)表2。

表2 基因芯片技術(shù)、細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷比較例

3 討論

目前，臨床治療終末期腎臟疾病的方法主要是腎移植術(shù)，然而腎移植術(shù)往往伴隨著很多風(fēng)險(xiǎn)。為盡量避免術(shù)后可能產(chǎn)生移植物抗宿主反應(yīng)和宿主抗移植物反應(yīng)等排斥反應(yīng)，患者術(shù)后需要長(zhǎng)期、大劑量服用免疫抑制劑，導(dǎo)致患者免疫功能低下，易發(fā)生一系列可能危及生命的并發(fā)癥，其中最容易發(fā)生的就是感染[1]。有研究結(jié)果顯示，有70%的腎移植患者術(shù)后3年內(nèi)發(fā)生過(guò)感染[3]。我國(guó)的相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，9%～16%的腎移植患者術(shù)后會(huì)出現(xiàn)肺部感染[4]，腎移植術(shù)后3個(gè)月左右是細(xì)菌感染的高發(fā)階段，其感染部位多為泌尿系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，尤其是呼吸系統(tǒng)感染，起病隱匿、進(jìn)展迅速，病死率為28.3%～37.9%[5-6]，重度肺部感染病死率甚至可達(dá)40%～72%[7]。因此，早期確定腎移植患者術(shù)后肺部感染的病原菌，可有效幫助臨床選用敏感抗菌藥物，不僅能夠達(dá)到更好的治療效果，還能避免盲目使用大量廣譜抗菌藥物導(dǎo)致的不良后果。很長(zhǎng)一段時(shí)間以來(lái)，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室確定呼吸系統(tǒng)感染病原菌主要是采用細(xì)菌培養(yǎng)的方法，該方法也一直被視為細(xì)菌感染檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，從培養(yǎng)細(xì)菌、鑒定，直至得出藥物敏感性結(jié)果，往往需要超過(guò)48 h；此外，由于某些苛養(yǎng)菌在一般的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，從而存在著較高的漏檢風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，臨床在腎移植術(shù)后常會(huì)預(yù)防性使用抗菌藥物控制感染，也會(huì)導(dǎo)致病原菌無(wú)法被培養(yǎng)出來(lái)，出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這些都會(huì)進(jìn)一步影響臨床治療效果。

本研究采用基因芯片技術(shù)進(jìn)行腎移植術(shù)后肺部感染患者病原菌檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等在2000年開(kāi)發(fā)出來(lái)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，從核酸提取到最終結(jié)果報(bào)告只需2 h左右，其檢測(cè)呼吸道病原體陽(yáng)性率可達(dá)40%～60%[8-10]。而目前傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間為66～115 h[11]，且陽(yáng)性檢出率一般低于20%[12]，故基因芯片技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，大大縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，提高了病原菌檢出率，檢測(cè)效率大幅提高，有助于及時(shí)指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物。

本研究發(fā)現(xiàn)，基于LAMP的快速基因芯片技術(shù)更加靈敏，臨床敏感性達(dá)65.48%，略高于細(xì)菌培養(yǎng)（64.00%），其中4株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而細(xì)菌培養(yǎng)為陰性。通常來(lái)說(shuō)，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)需要在羅氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)42 d才能生長(zhǎng)出來(lái)，普通的血瓊脂培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)條件難以滿足該種細(xì)菌的生長(zhǎng)需求；此外，基因芯片技術(shù)檢測(cè)出流感嗜血桿菌16株、肺炎鏈球菌4株、肺炎支原體6株、肺炎衣原體3株，而細(xì)菌培養(yǎng)均未檢出，這很有可能是因?yàn)槿苏：粑乐杏写罅康恼＞?，它們很容易在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，從而覆蓋了病原菌，使臨床漏檢率升高。同樣，由于感染也有可能是多種病原菌造成的，其中1種致病菌在培養(yǎng)皿上的生長(zhǎng)速度更快，會(huì)導(dǎo)致微生物檢測(cè)人員在觀察培養(yǎng)皿時(shí)遺漏其他病原菌。李輝騰等[13]的研究結(jié)果顯示，基因芯片技術(shù)特異性強(qiáng)、穩(wěn)定度高，能快速、準(zhǔn)確地檢出嗜肺軍團(tuán)菌。楊俊發(fā)等[14]的研究也證實(shí)了基因芯片技術(shù)可高靈敏度、高特異性和高穩(wěn)定性地檢出肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團(tuán)菌。楊艷兵等[15]發(fā)現(xiàn)基因芯片技術(shù)檢測(cè)白念珠菌也有著高靈敏度和高特異性。上述幾種非典型肺部感染病原菌在常規(guī)條件下難培養(yǎng)，或難以判斷是否為致病菌，因此，僅進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)很容易造成漏檢。本研究也發(fā)現(xiàn)了基因芯片技術(shù)的局限性，由于本研究所用基因芯片的設(shè)計(jì)僅能檢測(cè)10種臨床常見(jiàn)的病原菌，故由其他病原菌導(dǎo)致的感染無(wú)法被診斷；細(xì)菌培養(yǎng)檢出的皮氏伯克霍爾德菌、洋蔥伯克霍爾德菌、嗜酸假單胞菌、惡臭假單胞菌、頭狀葡萄球菌、陰溝腸桿菌、抗壞血酸克呂沃爾菌、念珠菌、曲霉菌，該基因芯片均未檢出，提示在基因芯片技術(shù)和細(xì)菌培養(yǎng)的一致性降低的同時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致基因芯片技術(shù)的特異性不如細(xì)菌培養(yǎng)。

綜上所述，基因芯片技術(shù)在腎移植患者術(shù)后感染病原菌快速檢測(cè)中有較高的敏感性，但受限于芯片的設(shè)計(jì)，特異性不理想。建議在腎移植術(shù)后患者中若發(fā)生可疑肺部感染，可優(yōu)先應(yīng)用基因芯片技術(shù)來(lái)進(jìn)行初步判斷，再通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)加以證實(shí)。