細(xì)菌整合子檢測(cè)方法研究進(jìn)展

郝佳慧， 楊澤華

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，山西 太原 030008）

20世紀(jì)80年代，澳大利亞學(xué)者在研究耐藥質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了整合子，并于1989年首次報(bào)道，他們認(rèn)為整合子是一種新的抗性決定基因[1]。1991年，HALL等[2]提出整合子-基因盒系統(tǒng)概念，認(rèn)為整合子-基因盒系統(tǒng)介導(dǎo)了微生物對(duì)多種抗菌藥物的耐藥。目前，約有130個(gè)不同的基因盒已經(jīng)被鑒定出來(lái)，且大部分基因盒都在抗菌藥物耐藥性方面起到了一定作用。整合子是一個(gè)可移動(dòng)的遺傳元件，其基本組件包括整合酶基因intI、重組位點(diǎn)attI和啟動(dòng)子Pc。在抗菌藥物選擇壓力下，整合酶基因編碼整合酶蛋白切除和整合耐藥基因盒，使耐藥基因盒插入到重組位點(diǎn)attI，啟動(dòng)子Pc啟動(dòng)耐藥基因盒的轉(zhuǎn)錄與后續(xù)表達(dá)，使細(xì)菌獲得耐藥性。在其他選擇壓力下，整合子還可以捕獲不同功能的基因盒，在細(xì)菌基因組進(jìn)化中也發(fā)揮著重要作用。所以，盡早判斷細(xì)菌是否攜帶整合子，可以更好地掌握細(xì)菌的耐藥情況。確定細(xì)菌中的整合子一般是通過(guò)檢測(cè)整合子的整合酶基因和可變區(qū)基因盒，主要檢測(cè)方法包括基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的各種方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）、宏基因組測(cè)序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）、基因芯片等分子生物學(xué)方法。本文對(duì)上述方法和非典型1類(lèi)整合子檢測(cè)方法的原理、特點(diǎn)和應(yīng)用進(jìn)行介紹，為臨床實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)菌中的整合子，預(yù)判細(xì)菌耐藥提供參考。

1 基于PCR的整合子檢測(cè)

1.1 常規(guī)PCR

PCR技術(shù)是模擬DNA的天然復(fù)制過(guò)程，通過(guò)變性、退火、延伸3個(gè)步驟來(lái)擴(kuò)增特定的DNA片段的一種方法，每完成1個(gè)循環(huán)需要2～ 4 min，2～3 h就能將待擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍?；赑CR擴(kuò)增技術(shù)的原理，可根據(jù)整合酶基因設(shè)計(jì)引物，選擇合適的擴(kuò)增條件擴(kuò)增整合酶，從而判斷整合子的攜帶情況[3]。除此之外，PCR可以通過(guò)擴(kuò)增整合子可變區(qū)來(lái)檢測(cè)整合子，針對(duì)5'-CS和3'-CS之間含有抗性基因盒的內(nèi)部可變區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，并進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定細(xì)菌中的整合子[4]。2001年，KOELEMAN等[5]對(duì)采用PCR技術(shù)擴(kuò)增整合酶和整合子可變區(qū)這2種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)整合酶基因的PCR檢測(cè)與整合子可變區(qū)PCR檢測(cè)相比，可多檢測(cè)到2個(gè)整合子，原因可能是細(xì)菌的整合子可變區(qū)不攜帶基因盒，或者攜帶的基因盒數(shù)量超過(guò)了PCR的擴(kuò)增能力，從而造成整合子的漏檢。提示整合子PCR通過(guò)擴(kuò)增可變區(qū)檢測(cè)整合子可能造成假陰性。因此，整合酶PCR檢測(cè)似乎是一種快速而簡(jiǎn)單的方法，可以用于常規(guī)篩查細(xì)菌中的整合子。目前，大部分細(xì)菌整合子的檢測(cè)主要是通過(guò)PCR擴(kuò)增整合酶基因，對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性的菌株再進(jìn)行可變區(qū)基因盒的擴(kuò)增，然后對(duì)可變區(qū)陽(yáng)性菌株進(jìn)行測(cè)序，得到基因盒具體序列和排列順 序[6-10]，從而發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因盒。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（r e a ltime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）

RT-qPCR是把熒光染料或探針加入反應(yīng)體系中，通過(guò)熒光信號(hào)對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，記錄每個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最后通過(guò)循環(huán)閾值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。2017年，車(chē)潔等[11]利用小溝結(jié)合物（minor groove binder，MGB）探針標(biāo)記技術(shù)，將intI基因和ISCR1元件的檢測(cè)融合到1個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系中，建立了一套雙元件二重RT-qPCR方法，可在1個(gè)反應(yīng)管里同時(shí)檢測(cè)intI基因和ISCR1元件這2種多藥耐藥相關(guān)基因，且僅需40 min，檢測(cè)靈敏度均在101拷貝/μL數(shù)量級(jí)。BARRAUD等[12]對(duì)引物-探針定量PCR檢測(cè)整合子的方法進(jìn)行了驗(yàn)證和評(píng)估，發(fā)現(xiàn)每對(duì)引物-探針對(duì)相應(yīng)的intI基因都是特異的，不含整合子的菌株和含超級(jí)整合子的弧菌菌株均未獲得信號(hào)，所有含有整合子的菌株均獲得了特異性擴(kuò)增信號(hào)；他們還發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR可以準(zhǔn)確測(cè)出模板的濃度，而普通PCR只能對(duì)模板進(jìn)行定性或半定量測(cè)定；熒光定量PCR比普通PCR檢測(cè)細(xì)菌中整合子耗時(shí)更短，可免去凝膠電泳成像過(guò)程，快速檢測(cè)整合子，非常適合用于對(duì)大量多重耐藥細(xì)菌整合子的初篩。

1.3 多重PCR

多重PCR又稱(chēng)多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一反應(yīng)體系中加入最少2對(duì)引物，可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)核酸片段，其反應(yīng)原理和過(guò)程與普通PCR類(lèi)似，一般使用多重PCR技術(shù)在1個(gè)PCR體系中加入1、2和3類(lèi)整合酶基因的上、下游引物，檢測(cè)細(xì)菌是否存在1、2和3類(lèi)整合子[13]。TEWARI等[14]針對(duì)intI 1、intI 2和intI 3整合酶基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)多重PCR檢測(cè)78株大腸埃希菌攜帶整合子的情況，發(fā)現(xiàn)有1株同時(shí)含有2類(lèi)和3類(lèi)整合子。劉旭等[15]為了建立一種能同時(shí)檢測(cè)1類(lèi)整合子、4類(lèi)超級(jí)整合子和1型插入序列共同區(qū)的多重PCR檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，還通過(guò)對(duì)單引物靈敏度檢測(cè)和退火溫度的不斷測(cè)試，優(yōu)化了引物最佳濃度和最佳退火溫度。引物是影響多重PCR目的片段成功擴(kuò)增的關(guān)鍵，不同的引物在同一PCR體系中靈敏度不同，彼此會(huì)形成一種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，可能會(huì)互相抑制。因此，對(duì)不同基因引物濃度的選擇至關(guān)重要。目前，檢測(cè)整合子的方法多為單基因PCR檢測(cè)，即檢測(cè)1種整合酶基因[16]。然而，單基因PCR檢測(cè)可能會(huì)造成漏檢，特別是當(dāng)有2種或2種以上整合酶基因同時(shí)存在時(shí)；且單基因PCR檢測(cè)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)；而多重PCR可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因，克服了單基因PCR的缺點(diǎn)，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間，降低了成本。

1.4 簡(jiǎn)并聚合酶鏈反應(yīng)（degenerate oligonucleotide primed-polymerase chain reaction，DOP-PCR）

DOP-PCR是根據(jù)遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，一般是根據(jù)整合酶基因的保守序列設(shè)計(jì)1、2和3類(lèi)整合酶基因的簡(jiǎn)并引物，檢測(cè)細(xì)菌攜帶的3類(lèi)整合酶基因，并使用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，根據(jù)酶切片段的大小來(lái)判斷所攜帶整合酶的類(lèi)型[17]。有研究者設(shè)計(jì)了DOP-PCR引物hep35和hep36進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于篩查53株志賀菌中的1、2和3類(lèi)整合子[18]。DOP-PCR可以同時(shí)檢測(cè)1、2和3類(lèi)整合酶基因[19-20]，縮短了檢測(cè)時(shí)間，也降低了檢測(cè)成本。雖然DOP-PCR簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，但擴(kuò)增產(chǎn)物仍需酶切和電泳技術(shù)才能確定分類(lèi)[18]。簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)決定了PCR能否成功擴(kuò)增，這一方法本身有一定的偶然性，反應(yīng)條件尚需摸索，且DOP-PCR對(duì)模板也有一定要求，若模板具有很高的GC含量，經(jīng)常會(huì)擴(kuò)增出許多不正確片段，造成檢測(cè)結(jié)果的偏差。

2 LAMP

LAMP是NOTOMI等[21]2000年開(kāi)發(fā)的一種新的恒溫核酸擴(kuò)增方法，是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異性引物，包括2條內(nèi)引物和2條外引物，在恒定溫度（65 ℃）條件下，通過(guò)一種鏈置換DNA聚合酶進(jìn)行核酸擴(kuò)增。2018年，CHEN等[22]優(yōu)化了高通量LAMP技術(shù)，并將其應(yīng)用于整合子和耐藥基因盒的檢測(cè)，針對(duì)整合子上的intI 1、intI 2、intI 3和基因盒特定序列設(shè)計(jì)了內(nèi)引物和外引物，僅耗時(shí)2.5 h。LAMP僅需在水浴和加熱塊等簡(jiǎn)易設(shè)備上分別進(jìn)行加熱和擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用SYBR Green染色，這使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅通過(guò)觀察顏色變化即可判定，大大簡(jiǎn)化了判斷結(jié)果的步驟，節(jié)省了時(shí)間[23]。有學(xué)者篩選出1、2、3類(lèi)整合子的特異性保守序列，設(shè)計(jì)了LAMP引物組，采用多重LAMP方法檢測(cè)細(xì)菌中的整合子，結(jié)果顯示，1類(lèi)整合子陽(yáng)性比例最高，其次是2類(lèi)整合子，未檢測(cè)到3類(lèi)整合子，也未發(fā)現(xiàn)1類(lèi)和2類(lèi)整合子均為陽(yáng)性的菌株[24]。然而，多重LAMP方法與多重PCR技術(shù)一樣，在引物設(shè)計(jì)上更為復(fù)雜，同時(shí)要避免不同引物間的互相競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致的抑制作用，所以限制了多重LAMP方法的進(jìn)一步應(yīng)用。普通PCR需要經(jīng)過(guò)熱循環(huán)來(lái)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物還需通過(guò)凝膠電泳驗(yàn)證[25]；LAMP技術(shù)可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，不需要進(jìn)行模板的預(yù)變性，不需要昂貴、精密的儀器，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。因此，LAMP方法可以用于大規(guī)模臨床分離株整合子的快速篩查。

3 基因測(cè)序技術(shù)

基因測(cè)序是為了獲得目的DNA片段的全部堿基序列，在分子生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，目前已經(jīng)發(fā)展到第4代，第2代、第3代和第4代測(cè)序技術(shù)統(tǒng)稱(chēng)為下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)。第1代測(cè)序技術(shù)主要基于Sanger雙脫氧終止法的原理，要將提取的樣品打碎成DNA片段，最后通過(guò)凝膠電泳獲得序列，2次只能獲得1條長(zhǎng)度為700～1 000個(gè)堿基的序列，通量低、成本高。第2代測(cè)序也被稱(chēng)為高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS），有許多測(cè)序平臺(tái)，1次可對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定，通量高、成本低，已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)菌中的整合子。有學(xué)者在巴西不同地區(qū)醫(yī)院的患者身上收集了21株含KPC-KP基因的肺炎克雷伯菌，從中篩選出10株進(jìn)行全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS），再利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已存入的1、2和3類(lèi)整合子的整合酶基因與測(cè)得的基因序列進(jìn)行比對(duì)，最后得到的WGS數(shù)據(jù)中顯示有9株肺炎克雷伯菌含有1類(lèi)整合子和不同的基因盒[26]。除此之外，CURY等[27]制作了一個(gè)名為IntegronFinder的程序，在全基因組序列中檢索，能夠準(zhǔn)確、靈敏地識(shí)別整合子。IntegronFinder能夠檢測(cè)細(xì)菌基因組中的整合子和整合子相關(guān)結(jié)構(gòu)[28]，且通過(guò)測(cè)序技術(shù)可以獲知細(xì)菌中整合子基因盒的具體種類(lèi)和序列，進(jìn)而掌握細(xì)菌耐藥的新進(jìn)展[29-31]。隨著NGS技術(shù)的快速發(fā)展，測(cè)序成本變得越來(lái)越低，臨床和實(shí)驗(yàn)室逐漸開(kāi)始大量采用測(cè)序技術(shù)解決問(wèn)題。

4 非典型1類(lèi)整合子的檢測(cè)方法

典型的整合子系統(tǒng)包括3個(gè)部分，2端是一段高度保守序列，即5'-CS和3'-CS，5'-CS和3'-CS之間的區(qū)域即可變區(qū)，其間可插入不同數(shù)量的基因盒，但基因盒并非整合子的必需組成部分。1類(lèi)整合子通常通過(guò)5'-CS和3'-CS設(shè)計(jì)引物，以擴(kuò)增整合子的可變區(qū)[32]。然而，一般非典型1類(lèi)整合子3'-CS結(jié)構(gòu)異常，所以非典型1類(lèi)整合子用標(biāo)準(zhǔn)引物可能無(wú)法擴(kuò)增出復(fù)雜的基因盒序列。反向PCR可擴(kuò)增1段已知序列兩端的未知序列，擴(kuò)增前先用限制性?xún)?nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成1個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過(guò)反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段。LEE等[33]設(shè)計(jì)了intI 1和sul 1基因的反向引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行反向PCR分析和DNA測(cè)序，在霍亂沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌中分別檢測(cè)到3個(gè)異常結(jié)構(gòu)——sul3相關(guān)突變整合子、缺陷型1類(lèi)整合子和qnrB2相關(guān)復(fù)合體1類(lèi)整合子。XIAO等[34]使用引物對(duì)INTRR和INTRF對(duì)96株1類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株基因組DNA進(jìn)行反向PCR分析，然后通過(guò)電泳和測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)到常規(guī)不能擴(kuò)增的非典型1類(lèi)整合子的5個(gè)可變區(qū)。以上研究均證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR可以用來(lái)檢測(cè)含有非典型3'端的整合子，從而減少整合子的漏檢，全面了解整合子的各種分型。但是，反向PCR技術(shù)的難點(diǎn)是需要從許多酶中選擇合適的限制酶，才能酶切到合適的DNA片段。

5 其他檢測(cè)方法

基因芯片技術(shù)是通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交來(lái)檢測(cè)核酸序列，可以快速得到所測(cè)DNA碎片的基因序列。GLENN等[35]使用結(jié)合和固定在基質(zhì)上的整合子特異性寡核苷酸探針，發(fā)現(xiàn)29個(gè)陽(yáng)性雜交產(chǎn)生目標(biāo)DNA-探針雙鏈，陽(yáng)性雜交與PCR分析結(jié)果一致。沈瀚等[36]還開(kāi)發(fā)了菌落原位雜交法，用于檢測(cè)整合子，他們制備1類(lèi)整合酶基因的特異性探針，利用細(xì)菌自身的繁殖對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)革蘭陰性菌中的Ⅰ類(lèi)整合酶基因。但菌落原位雜交法實(shí)驗(yàn)周期比較長(zhǎng)，程序比較繁雜，影響因素也較多，因此未被廣泛使用。

6 總結(jié)

在抗菌藥物的選擇壓力下，耐藥細(xì)菌的存活增加了細(xì)菌的毒性和致病性，嚴(yán)重影響了人類(lèi)的健康。細(xì)菌整合子檢測(cè)方法的研究對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)整合子具有重大意義，可盡早判斷細(xì)菌的進(jìn)化方向。了解細(xì)菌整合子不同檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)和不足，可幫助臨床實(shí)驗(yàn)室根據(jù)樣本量和檢測(cè)目的選擇合適的方法。細(xì)菌整合子檢測(cè)方法的研究不僅需要關(guān)注其特異性，還要考慮檢測(cè)時(shí)間和成本等問(wèn)題，包括其能否與試紙或試劑盒等結(jié)合，從而可以大批量檢測(cè)整合子，增加實(shí)用性。為此，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極探索整合子的檢測(cè)方法，及時(shí)發(fā)現(xiàn)或避免新型耐藥表型的出現(xiàn)。