食木白蟻腸道降解木質(zhì)素及環(huán)境內(nèi)分泌干擾物細(xì)菌的篩選與特性研究

尚華蓉李成林朱道辰季榮孫建中

(1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.南京大學(xué)污染控制與資源化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046)

食木白蟻是一種取食木質(zhì)纖維素昆蟲，能夠在24h 內(nèi)轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素中90%以上的纖維素并能同時(shí)降解半纖維素和木質(zhì)素[1]。木質(zhì)素由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難被微生物降解，一直以來(lái)被認(rèn)為是木質(zhì)纖維素利用的最大障礙[2]。近年來(lái)，食木白蟻高效降解木質(zhì)素的能力引起了研究人員的極大熱情和興趣，并開展了大量研究。Butler等分別以天然和人工的木質(zhì)素喂養(yǎng)白蟻，證明了白蟻能夠消化木質(zhì)素[3]。此外，木質(zhì)素降解菌可能同時(shí)具有降解EEDs的能力，因此可以從白蟻腸道中篩選環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)降解菌，為環(huán)境生態(tài)修復(fù)提供技術(shù)支持。

本文以木質(zhì)素及EEDs為底物，從4種食木白蟻腸道內(nèi)篩選出了33株共13個(gè)屬的細(xì)菌，并比較了不同食木白蟻腸道內(nèi)木質(zhì)素及EEDs降解細(xì)菌的構(gòu)成，證實(shí)了白蟻腸道細(xì)菌參與了木質(zhì)素及EEDs的降解，為進(jìn)一步探明食木白蟻對(duì)木質(zhì)素的降解機(jī)制提供了更多的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃胸散白蟻、黑胸散白蟻和圓唇散白蟻采集于鎮(zhèn)江南山景區(qū)；臺(tái)灣乳白蟻由蘇州白蟻防治中心提供。本研究所用木質(zhì)素及衍生化芳香化合物購(gòu)自Sigma Aldrich公司，EEDs：壬基酚(NP)、雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)、雙酚S(BPS)和四溴雙酚A(TBBPA)均由南京大學(xué)污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 木質(zhì)素及衍生化芳香化合物降解細(xì)菌的篩選

在顯微鏡下用鑷子抽取4種低等食木白蟻的腸道各30條，隨之放入裝有1mL 0.4%無(wú)菌NaCl溶液的1.5mL離心管中；然后用高溫滅菌后的勻漿器分別將4種低等食木白蟻腸道研磨至均勻懸浮狀；用100uL移液器吸取80uL腸道勻漿懸浮液至M9液體培養(yǎng)基中于30℃ 220r·min-1振蕩培養(yǎng)；待菌液出現(xiàn)渾濁后，轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)基中，重復(fù)此操作3次；最后將菌液在LB固體平板富集并挑取單菌落，最終獲得可降解相應(yīng)木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的菌種。

1.3 16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

分離到的細(xì)菌總DNA用Wizard@基因組DNA純化試劑盒提取，16S rDNA產(chǎn)物擴(kuò)增參考之前方法[4]。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司測(cè)序。對(duì)測(cè)序得到的核苷酸序列，在NCBI上進(jìn)行Blast操作，通過(guò)序列比對(duì)確定菌屬，并采用MEGA 5.05分析軟件構(gòu)建菌種系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 篩選細(xì)菌碳源利用分析

分別以木質(zhì)素、衍生化芳香化合物或者EEDs為唯一碳源，在MM63固體平板上接種8種細(xì)菌，根據(jù)菌種在平板上的生長(zhǎng)特征(如菌株數(shù)量、菌落大小)，比較8種細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果和分析

2.1木質(zhì)素及衍生化芳香化合物降解細(xì)菌的篩選

表1 不同白蟻腸道中篩選出的可降解或利用木質(zhì)素及其衍生化芳香化合物的細(xì)菌屬

低等食木白蟻腸道內(nèi)的木質(zhì)素及衍生化芳香化合物降解細(xì)菌的篩選結(jié)果如表2所示。以木質(zhì)素及衍生化芳香化合物為底物，本研究從4種低等食木白蟻腸道內(nèi)共篩出了13種菌屬，包括無(wú)色桿菌屬、伯克氏菌屬、假單胞桿菌屬、特布爾西氏菌屬、細(xì)桿菌屬、潘多拉菌屬、雷弗森菌屬、阪崎腸桿菌屬、蒼白桿菌屬、伊麗莎白菌屬、腸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、噬染料菌屬。

2.2 木質(zhì)素及衍生化芳香化合物降解細(xì)菌在低等食木白蟻腸道的構(gòu)成

臺(tái)灣乳白蟻腸道中篩出了8種菌屬，而黃胸散白蟻腸道內(nèi)篩出了5種菌屬,黑胸散白蟻腸道內(nèi)篩出了7種菌屬,圓唇散白蟻腸道中篩出了5種菌屬，見表1。從表1中可知，散白蟻和乳白蟻腸道內(nèi)主要菌屬構(gòu)成不同,散白蟻腸道內(nèi)存在著大量可降解木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的伯克氏菌屬，而在臺(tái)灣乳白蟻腸道中只篩選出了1種可降解3,4,5-三甲氧基苯甲醛的伯克氏菌屬。在臺(tái)灣乳白蟻腸道內(nèi)可降解木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的菌屬是細(xì)桿菌屬，而散白蟻腸道內(nèi)則較少細(xì)桿菌屬。

此外，除了伯克氏菌屬在3種散白蟻中都存在以外，3種散白蟻腸道內(nèi)主要菌屬構(gòu)成也有所不同。黃胸散白蟻腸道中，存在著一種假單胞桿菌屬，可降解苯甲酸、香草酸、阿魏酸及木質(zhì)素。無(wú)色桿菌屬則主要存在于黑胸散白蟻腸道內(nèi)，可降解3,4,5-三甲氧基苯甲醛、3,5-二甲氧基-4-羥基苯乙酸、香草酸、阿魏酸、3,4-二甲氧基苯丙酸，黃胸散白蟻腸道內(nèi)也少量存在可降解上述化合物的無(wú)色桿菌屬。圓唇散白蟻腸道內(nèi)存在著2種特有的可降解木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的菌屬—伊麗莎白菌屬、腸桿菌屬，其中，伊麗莎白菌屬可降解3,5-二甲氧基-4-羥基苯乙酸、苯甲酸、香草酸、3,4-二甲氧基苯丙酸和木質(zhì)素，而腸桿菌屬能降解苯甲酸、香草酸及木質(zhì)素。

從表1中還可以看出，低等白蟻腸道內(nèi)雖然存在著大量可降解木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的共生微生物，但卻不能有效地降解苯酚類有機(jī)化合物，如苯酚、2,6-二甲氧基苯酚。而可降解的香草醛的菌屬也僅有伯克氏菌屬(存在于黃胸散白蟻、黑胸散白蟻腸道內(nèi))。

2.3 木質(zhì)素及衍生化芳香化合物降解細(xì)菌的特性研究

2.3.1 細(xì)菌利用木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的生長(zhǎng)狀況

從表2中可知(碳源編號(hào)與表1中木質(zhì)素及其類似化合物編號(hào)一致)，這8種木質(zhì)素及衍生化芳香化合物降解細(xì)菌在一定程度上可有效利用木質(zhì)素以及6種芳香族化合物，但對(duì)于2,6-二甲氧基苯酚、香草醛及苯酚卻不能有效利用；菌株YC105C相比其他細(xì)菌更能有效地利用木質(zhì)素及衍生化芳香化合物；通過(guò)Blast序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)YC105C菌株與腸桿菌屬的菌株相似度為99%，這表明菌株YC105C為腸桿菌屬。

2.3.2 木質(zhì)素降解細(xì)菌利用EEDs的生長(zhǎng)狀況

研究數(shù)據(jù)表明，低等白蟻腸道內(nèi)篩選的木質(zhì)素降解細(xì)菌可有效利用NP、BPA、BPF、BPS、TBBPA 5種EEDs作為唯一碳源來(lái)生長(zhǎng)，見表3。從表3中可知，8種木質(zhì)素降解細(xì)菌均可高效利用NP、TBBPA，而只有少部分菌種可利用NP、BPF、BPS作為唯一碳源來(lái)生長(zhǎng)，其中菌株Hu109A可高效利用5種EEDs。通過(guò)Blast序列比對(duì)確定菌株Hu109A為假單胞桿菌屬；利用MEGA 5.05分析軟件NJ法構(gòu)建了Hu109A的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1，發(fā)現(xiàn)菌株Hu109A與Pesunomonas guariconensis PCAVU11T的16S rDNA序列相似性為98%，確定菌種Hu109A與P.g PCAVU11T同種。

表3 木質(zhì)素降解細(xì)菌在EEDs上的生長(zhǎng)狀況

圖1 以16S rRNA序列為基礎(chǔ)的Pseudomonas sp.Hu109A

3 討論

低等食木白蟻腸道內(nèi)存在著大量可降解木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的共生細(xì)菌。本研究以木質(zhì)素及衍生化芳香化合物為唯一碳源從4種食木白蟻腸道內(nèi)篩選出共13個(gè)屬的33株細(xì)菌，其中細(xì)桿菌屬、無(wú)色桿菌屬、特布爾西氏菌屬、雷弗森菌屬、潘多拉菌屬、伊麗莎白菌屬、噬染料菌屬、蒼白桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬是首次從低等食木白蟻中篩選鑒定的腸道共生細(xì)菌[5]，而細(xì)桿菌屬、無(wú)色桿菌屬、特布爾西氏菌屬、雷弗森菌屬、潘多拉菌屬、伊麗莎白菌屬、噬染料菌屬、蒼白桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞桿菌屬、阪崎腸桿菌屬是首次從低等食木白蟻腸道內(nèi)篩選出的可降解利用木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的菌屬。

木質(zhì)素及衍生化芳香化合物降解細(xì)菌在散白蟻和乳白蟻以及不同散白蟻腸道內(nèi)的構(gòu)成有所不同。散白蟻腸道內(nèi)存在著大量可降解木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的伯克氏菌屬，而臺(tái)灣乳白蟻腸道內(nèi)可降解木質(zhì)素的菌屬是細(xì)桿菌屬，而圓唇散白蟻腸道內(nèi)可降解木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的特有菌屬則是伊麗莎白菌屬、腸桿菌屬，這可能是由于食物影響到木質(zhì)素及衍生化芳香化合物降解細(xì)菌在白蟻腸道內(nèi)的種類和分布[6]；此外，低等食木白蟻腸道共生細(xì)菌不能有效利用苯酚、2,6-二甲氧基苯酚，這可能是由于白蟻腸道細(xì)菌利用木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的機(jī)制有所不同。

通過(guò)比較8種不同屬的細(xì)菌在木質(zhì)素及衍生化芳香化合物上的生長(zhǎng)狀況，本研究復(fù)篩出1株可高效利用木質(zhì)素及衍生化芳香化合物的腸桿菌Enterobacter sp.YC105C，而腸桿菌屬也被眾多研究證明可高效降解木質(zhì)素及衍生化芳香化合物[7]；假單胞桿菌Pseudomonas sp.Hu109A是首次從黃胸散白蟻腸道內(nèi)分離鑒定出高效利用NP、BPA、BPF、BPS、TBBPA的假單胞桿菌，也有從水體環(huán)境中篩選到可降解EEDs壬基酚、雙酚A的假單胞桿菌，表明假單胞桿菌屬是一類可高效降解利用EEDs的微生物[8]。

通過(guò)食木白蟻腸道共生細(xì)菌篩選及其特性研究，本研究初步掌握了4種食木白蟻腸道內(nèi)共生細(xì)菌的構(gòu)成，并獲得了可高效利用木質(zhì)素及衍生化芳香化合物和EEDs的細(xì)菌，這為白蟻腸道降解木質(zhì)素的機(jī)制以及對(duì)EEDs的去除提供了更多的參考依據(jù)，同時(shí)對(duì)木質(zhì)纖維素高效利用以及EEDs的生物治理具有重要的參考價(jià)值。