基于形態(tài)性狀和指標(biāo)成分的遠(yuǎn)志遺傳多樣性分析及綜合評(píng)價(jià)

張 茹 吳昌娟 張麗君 郭淑紅 田洪嶺,*

(1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030600；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所，山西 汾陽 032200；3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心，山西 太原 030000)

遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld.)為遠(yuǎn)志科(Polygalaceae)遠(yuǎn)志屬(PolygalaL.)多年生草本藥用植物[1]。遠(yuǎn)志是我國重要的傳統(tǒng)出口藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，常年種植面積超過10 000 hm-2，年產(chǎn)量約800 t[2]。遠(yuǎn)志根的韌皮部作為藥用部位，主要指標(biāo)成分包括皂苷類[3]、酮類、寡糖酯類、生物堿類[4]、香豆素、木質(zhì)素、黃酮類[5]等，具有安神益智[6]、交通心腎[7]、祛痰和消腫[8]等多種功效。研究遠(yuǎn)志種質(zhì)資源的遺傳多樣性，掌握其分布特點(diǎn)及規(guī)律，對(duì)于遠(yuǎn)志種質(zhì)資源的正確評(píng)價(jià)、現(xiàn)有資源的充分發(fā)掘利用等具有十分重要的意義[9-11]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者先后采用形態(tài)數(shù)據(jù)測(cè)定和指標(biāo)成分含量測(cè)定等方法分析了藥用植物山藥[12]、甜蕎[13]、甘草[14]、紫蘇[15]、紅花[16]等種質(zhì)資源的遺傳多樣性。李占林等[17]對(duì)遠(yuǎn)志的根部性狀進(jìn)行了研究，劉超[18]對(duì)遠(yuǎn)志和西伯利亞遠(yuǎn)志的形態(tài)性狀進(jìn)行了測(cè)定，秦金山等[19]對(duì)遠(yuǎn)志的花部結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，高潔等[20]對(duì)遠(yuǎn)志的根莖葉結(jié)構(gòu)進(jìn)行了顯微觀察，王永艷[21]對(duì)遠(yuǎn)志和卵葉遠(yuǎn)志的指標(biāo)成分含量進(jìn)行了測(cè)定，但目前暫未有研究同時(shí)對(duì)遠(yuǎn)志的形態(tài)和指標(biāo)成分含量進(jìn)行全面測(cè)定。鑒于此，本研究在總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取山西省、陜西省、河南省、河北省4個(gè)省區(qū)的42份遠(yuǎn)志種質(zhì)資源作為研究對(duì)象，所選材料地理覆蓋面廣，涵蓋了我國所有遠(yuǎn)志主產(chǎn)區(qū)，較好地代表了遠(yuǎn)志資源的自然分布和整個(gè)種質(zhì)資源的遺傳多樣性；并于形態(tài)水平和指標(biāo)成分含量水平對(duì)42份不同地理來源的遠(yuǎn)志種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析和綜合評(píng)價(jià)，旨在建立綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，為遠(yuǎn)志新品種選育和遺傳改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用遠(yuǎn)志材料分別征集于山西省、陜西省、河北省、河南省農(nóng)戶，并種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所藥用植物資源圃內(nèi)(簡(jiǎn)稱經(jīng)作所資源圃)。經(jīng)作所資源圃位于汾陽市東南方(37°14′40″N，111°47′2″E)，為新墾樹林地，土質(zhì)為壤土，肥力中上等，排灌方便；平均海拔750 m，全年平均氣溫9.7℃，積溫 3 400～3 700℃， 全年平均日照時(shí)數(shù)2 601.3 h，無霜期175 d左右，年均降水量450～500 mm，降水主要分布在7—9月。土壤類型為石灰性褐土，供試土壤堿解氮含量55.08 mg·kg-1，有效磷含量17.5 mg·kg-1， 速效鉀含量159.45 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量16.24 g·kg-1，pH值8.3。本試驗(yàn)所用材料均為三年生遠(yuǎn)志，具體材料來源信息見表1。

表1 遠(yuǎn)志樣品信息Table 1 Information of Polygala tenuifolia

1.2 遠(yuǎn)志種質(zhì)資源形態(tài)性狀遺傳多樣性研究

對(duì)遠(yuǎn)志采用五點(diǎn)取樣法，選擇每份種質(zhì)的5株植株，對(duì)形態(tài)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)定并記錄。具體的形態(tài)性狀指標(biāo)包括株高、莖分支、鮮根長、鮮根粗、根分支、鮮根重、木芯粗、根皮鮮重、木芯鮮重、根皮干重、木芯干重、葉色、花色、根皮顏色。為便于數(shù)量化和統(tǒng)計(jì)分析，質(zhì)量性狀予以賦值，見表2。

表2 質(zhì)量性狀賦值表Table 2 Assignment table of quality traits

1.3 遠(yuǎn)志種質(zhì)資源指標(biāo)成分含量遺傳多樣性研究

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算供試材料各指標(biāo)的總體平均值(X)、標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation，SD)、變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)。利用Shannon-Wiener遺傳多樣性指數(shù)H′來評(píng)價(jià)遺傳多樣性[23]。

利用SPSS 21軟件分別對(duì)形態(tài)性狀和指標(biāo)成分含量進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及聚類分析[24]、主成分分析[25]、相關(guān)性分析[26]、主成分分析[27]，利用隸屬函數(shù)計(jì)算綜合評(píng)價(jià)值F，再結(jié)合逐步回歸分析篩選遠(yuǎn)志資源綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 變異及遺傳多樣性指數(shù)分析

2.1.1 形態(tài)性狀變異及遺傳多樣性指數(shù)分析 由表3可知，遠(yuǎn)志形態(tài)性狀的變異系數(shù)變化范圍較大，其中根長變異系數(shù)最小，為13.99%，根皮顏色變異系數(shù)最大，為48.11%。這些指標(biāo)中，株高、根長、根粗、木芯粗的變異系數(shù)較低，在13%～20%之間，依次為根長<根粗<株高<木芯粗，其余性狀變異系數(shù)均明顯較高，介于32%～49%之間，依次為根皮重<根重<木芯重<葉色<花色<根分支數(shù)<莖分支數(shù)<根皮顏色。株高遺傳多樣指數(shù)最大，為1.654 7，葉色的遺傳多樣性指數(shù)最小，為0.780 3。3個(gè)質(zhì)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)處于0.7～1.0之間，依次為葉色<根皮顏色<花色，均低于數(shù)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)(1.2～1.7)，依次為根長<根粗<根分支數(shù)<木芯重<根皮重<莖分支數(shù)<根重<木芯粗<株高。形態(tài)性狀變異系數(shù)平均為32.42%，遺傳多樣性指數(shù)平均為1.292 1。

表3 遠(yuǎn)志形態(tài)性狀測(cè)定統(tǒng)計(jì)Table 3 Determination of morphological traits of Polygala tenuifolia

2.1.2 指標(biāo)成分含量變異及遺傳多樣性指數(shù)分析 由表4可知，3，6′-二芥子酰基蔗糖含量的變異系數(shù)最大，為29.54%，變異幅度為2.52～9.61 mg·g-1，其次是遠(yuǎn)志酮Ⅲ，為25.31%，變異幅度為0.84～2.64 mg·g-1， 細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的變異系數(shù)最小，為19.75%，變異幅度為13.46～36.28 mg·g-1。3個(gè)指標(biāo)成分含量的遺傳多樣性指數(shù)與變異系數(shù)變化一致，差異明顯。最高為3，6′-二芥子酰基蔗糖，1.418 0，其次是遠(yuǎn)志酮Ⅲ，為1.201 9，最低是細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷，為0.987 1。指標(biāo)成分含量變異系數(shù)平均為24.87%，遺傳多樣性指數(shù)平均為1.202 3。

表4 遠(yuǎn)志指標(biāo)成分含量測(cè)定統(tǒng)計(jì)Table 4 Determination of the content of medicinal ingredients of Polygala tenuifolia

2.2 遠(yuǎn)志形態(tài)性狀與指標(biāo)成分含量相關(guān)性分析

對(duì)遠(yuǎn)志形態(tài)性狀和指標(biāo)成分的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析(表5)，結(jié)果表明，遠(yuǎn)志酮Ⅲ含量與花色深度呈極顯著正相關(guān)，與株高呈顯著正相關(guān)，與木芯粗呈極顯著負(fù)相關(guān)；3，6′-二芥子?；崽呛颗c細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量呈顯著正相關(guān)，與株高呈極顯著負(fù)相關(guān)；細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量與莖分支數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.3 形態(tài)性狀與指標(biāo)成分含量結(jié)合主成分分析

對(duì)遠(yuǎn)志種質(zhì)資源形態(tài)性狀和指標(biāo)成分進(jìn)行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，將15個(gè)指標(biāo)簡(jiǎn)化為4個(gè)因子，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)67.764%，包含了形態(tài)性狀和指標(biāo)成分的絕大部分信息(表6)。第1主成分特征值為5.024，貢獻(xiàn)率為33.490%，解釋了根重、根皮重、木芯粗、木芯重、根粗、根分支數(shù)的信息，此類因子均為根部形態(tài)性狀相關(guān)因子。第2主成分特征值為1.983，貢獻(xiàn)率為13.221%，解釋了細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、花色、遠(yuǎn)志酮Ⅲ和葉色4個(gè)指標(biāo)。第3主成分特征值為1.834，貢獻(xiàn)率為12.225%，解釋了株高和3，6′-二芥子?；崽?個(gè)指標(biāo)。第4主成分特征值為1.324，貢獻(xiàn)率為8.827%，解釋了根皮顏色和根長2個(gè)指標(biāo)。

表6 遠(yuǎn)志形態(tài)性狀與指標(biāo)成分含量主成分分析Table 6 Principal analysis between morphological traits and the content of medicinal ingredients of Polygala tenuifolia samples

2.4 聚類分析

2.4.1 形態(tài)性狀聚類分析 基于形態(tài)性狀對(duì)遠(yuǎn)志進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖1所示。在歐氏距離為15時(shí)，將遠(yuǎn)志種質(zhì)資源分為三大類，類群Ⅰ包含16份遠(yuǎn)志種質(zhì)資源，主要來源于山西省呂梁市、晉中市、臨汾市、運(yùn)城市，陜西省渭南市、榆林市；類群Ⅱ包含12份種質(zhì)資源，主要來源于山西省臨汾市、運(yùn)城市，河南省洛陽市；類群Ⅲ包含14份種質(zhì)資源，主要來源于山西省臨汾市、運(yùn)城市，河南省洛陽市，河北省保定市、衡水市、邢臺(tái)市。由表7可知，類群Ⅰ表現(xiàn)為植株矮、根莖分支少、根短且細(xì)、根和木芯重量小；類群Ⅱ表現(xiàn)為植株高、根長且粗、根重量大、根皮顏色深；類群Ⅲ表現(xiàn)為根莖分支多、葉色花色深。

表7 遠(yuǎn)志形態(tài)性狀聚類分析Table 7 Dendrogram analysis from the morphological traits of Polygala tenuifolia samples

圖1 遠(yuǎn)志形態(tài)性狀聚類Fig.1 Dendrogram based on the morphological traits of Polygala tenuifolia samples

2.4.2 指標(biāo)成分含量聚類分析 根據(jù)指標(biāo)成分含量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。這些材料被明顯分為三類，類群Ⅰ包含16份種質(zhì)資源，主要來源于山西省呂梁市、晉中市、臨汾市、運(yùn)城市，陜西省渭南市、榆林市；類群Ⅱ包含17份種質(zhì)資源，主要來源于山西省臨汾市、運(yùn)城市，河北省衡水市、邢臺(tái)市；類群Ⅲ包含9份遠(yuǎn)志種質(zhì)資源，主要來源于河南省洛陽市，河北省保定市、邢臺(tái)市、衡水市。由表8可知，類群Ⅰ遠(yuǎn)志酮Ⅲ含量最高，類群Ⅱ細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷和3，6′-二芥子酰基蔗糖含量最高。

圖2 遠(yuǎn)志指標(biāo)成分含量聚類Fig.2 Dendrogram based on the content of medicinal ingredients of Polygala tenuifolia samples

2.5 綜合評(píng)價(jià)

對(duì)42份遠(yuǎn)志資源的12個(gè)形態(tài)性狀值和3個(gè)指標(biāo)性成分含量值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，求得各種質(zhì)的4個(gè)主成分得分，將4個(gè)主成分進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算各成分權(quán)重系數(shù)分別為0.446、0.176、0.163、0.118，最后求得每份種質(zhì)材料的綜合得分F值，進(jìn)而對(duì)42份遠(yuǎn)志種質(zhì)資源進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，F(xiàn)值的變化范圍在-1.15～1.23之間。根據(jù)F值進(jìn)行排序，其中14、1、11、19、23、38、3和24號(hào)8份種質(zhì)的綜合得分大于0.5，可作為優(yōu)異育種資源加以利用。來自山西省臨汾市的14號(hào)種質(zhì)的F值最高，為1.23，來自河南省洛陽市的32號(hào)種質(zhì)的F值最低，為-1.15。

表8 遠(yuǎn)志指標(biāo)成分含量聚類分析Table 8 Dendrogram analysis based on the contents of medicinal ingredients of Polygala tenuifolia samples

對(duì)形態(tài)性狀值和指標(biāo)性成分含量值與綜合得分(F值)進(jìn)行相關(guān)性分析(表9)，結(jié)果表明，除了株高、葉色和根皮顏色外，其余指標(biāo)與F值均有相關(guān)性，其中根分支數(shù)、根長、根粗、木芯粗、根重、根皮重、木芯重、花色、遠(yuǎn)志酮Ⅲ含量和3，6′-二芥子?；崽呛颗cF值呈極顯著相關(guān)性。以綜合評(píng)價(jià)值F與12個(gè)形態(tài)性狀值和3個(gè)指標(biāo)性成分含量值構(gòu)建最優(yōu)回歸方程：Y=0.028X2+0.126X3+0.196X4+0.104X9+0.457X11+0.419X13+0.041X14-2.778。X2、X3、X4、X9、X11、X13和X14分別代表莖分支數(shù)、葉色、花色、根重、木芯重、遠(yuǎn)志酮Ⅲ含量和3，6′-二芥子?；崽呛?。式中，方程相關(guān)系數(shù)r和決定系數(shù)R2分別為0.986和0.972，表明7個(gè)自變量可決定F值總變異的97.20%，F(xiàn)值為181.316。由回歸方程可知，7個(gè)指標(biāo)可以用于遠(yuǎn)志種質(zhì)綜合評(píng)價(jià)，作為篩選遠(yuǎn)志優(yōu)異種質(zhì)的關(guān)鍵性指標(biāo)。

表9 形態(tài)性狀值和指標(biāo)性成分含量值與綜合得分(F值)的相關(guān)系數(shù)Table 9 Correlation coefficients between morphological character value, index component content value and F value

3 討論

本研究以征集到的山西省、陜西省、河北省、河南省遠(yuǎn)志資源為樣本，對(duì)其形態(tài)性狀和指標(biāo)成分含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行變異系數(shù)及遺傳多樣性指數(shù)分析、聚類分析、主成分分析、相關(guān)性分析。變異系數(shù)及遺傳多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示，4個(gè)主產(chǎn)區(qū)遠(yuǎn)志資源在形態(tài)性狀水平存在明顯差異，且其差異呈不均勻分布，變異系數(shù)平均為32.42%，遺傳多樣性指數(shù)平均為1.292 1，這與李占林等[17]和劉超[18]關(guān)于遠(yuǎn)志形態(tài)性狀的研究結(jié)果基本一致。4個(gè)產(chǎn)區(qū)遠(yuǎn)志資源在指標(biāo)成分含量水平的變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)的平均值分別為24.87%和1.202 3，說明在形態(tài)性狀水平的遺傳多樣性大于指標(biāo)成分水平的遺傳多樣性。

研究結(jié)果還表明遠(yuǎn)志種質(zhì)資源指標(biāo)成分含量與部分形態(tài)性狀有一定的相關(guān)性：遠(yuǎn)志酮Ⅲ含量和花色呈極顯著正相關(guān)，與株高呈顯著正相關(guān)，與木芯粗呈極顯著負(fù)相關(guān)；3，6′-二芥子酰基蔗糖含量與細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量呈顯著正相關(guān)，與株高呈極顯著負(fù)相關(guān)；細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量與莖分支數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。王丹丹等[28]對(duì)3個(gè)指標(biāo)成分含量與6個(gè)不同農(nóng)藝性狀特征包括株高、根直徑、根長、第一側(cè)根分叉高度、側(cè)根數(shù)、根重進(jìn)行相關(guān)性研究，結(jié)果表明細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量與6個(gè)農(nóng)藝性狀無明顯相關(guān)性；遠(yuǎn)志酮Ⅲ與根長呈負(fù)相關(guān)，與側(cè)根數(shù)呈正相關(guān)；3，6′-二芥子?；崽桥c根長呈正相關(guān)。張琳等[29]對(duì)3個(gè)指標(biāo)成分含量與3個(gè)形態(tài)性狀特征包括根長、根粗、株高進(jìn)行相關(guān)性研究，結(jié)果表明遠(yuǎn)志酮Ⅲ與株高之間存在極顯著相關(guān)關(guān)系，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷與根粗之間存在極顯著相關(guān)性，3，6′-二芥子?；崽桥c3個(gè)性狀指標(biāo)無相關(guān)性。本研究相關(guān)性研究結(jié)果與上述結(jié)果有差異，可能與遠(yuǎn)志種質(zhì)資源材料種類選擇的不同有關(guān)。

對(duì)遠(yuǎn)志種質(zhì)資源形態(tài)性狀和指標(biāo)成分進(jìn)行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，將15個(gè)指標(biāo)簡(jiǎn)化為4個(gè)因子，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)67.764%，包含了形態(tài)性狀和指標(biāo)成分的大部分信息。其中第2、第3主成分包含指標(biāo)成分和形態(tài)性狀因子，反映遠(yuǎn)志的質(zhì)量。第1、第4主成分為根部形態(tài)形狀相關(guān)因子，反映遠(yuǎn)志的產(chǎn)量。主成分4個(gè)因子包含了大部分信息量，且各指標(biāo)間具有一定的相關(guān)關(guān)系，表明形態(tài)性狀與指標(biāo)成分含量對(duì)主成分結(jié)果均有一定的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，形態(tài)性狀水平和指標(biāo)成分含量水平的聚類分析結(jié)果不一致，雖然兩個(gè)水平的聚類分析都將遠(yuǎn)志種質(zhì)資源分為三大類群，但每個(gè)類群包含種質(zhì)資源的類型和數(shù)量不相同。兩個(gè)水平中，山西臨汾市和運(yùn)城市均存在于每個(gè)類群，可能是由于臨汾市和運(yùn)城市作為山西遠(yuǎn)志的主產(chǎn)區(qū)，本次試驗(yàn)采用的樣本量較大。在兩個(gè)水平中均為第Ⅱ類群中臨汾市和運(yùn)城市種質(zhì)占據(jù)主要部分，且其在形態(tài)性狀方面根的長度和重量均大于其他類群，在指標(biāo)成分含量水平，三個(gè)指標(biāo)成分含量同樣均達(dá)到藥典的標(biāo)準(zhǔn)?？傮w來說，地理位置接近的區(qū)域其遺傳距離也較近。但各個(gè)地區(qū)并未單一地按照地域聚集于一個(gè)類群，這可能與遠(yuǎn)志種質(zhì)資源間存在著相互引種有關(guān)。

本研究利用綜合評(píng)價(jià)F值進(jìn)行遠(yuǎn)志種質(zhì)資源評(píng)價(jià)，篩選出8份優(yōu)良種質(zhì)，其中有2份來自山西南部的臨汾市，3份來自山西南部的運(yùn)城市，2份來自山西中部的呂梁市，1份來自河北中部的保定市，這些種質(zhì)可以作為參試區(qū)優(yōu)異種質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究。以綜合評(píng)價(jià)值F與12個(gè)形態(tài)性狀值和3個(gè)指標(biāo)性成分含量值構(gòu)建最優(yōu)回歸方程，篩選到莖分支數(shù)、葉色、花色、根重、木芯重、遠(yuǎn)志酮Ⅲ含量和3，6′-二芥子?；崽呛?個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo)作為遠(yuǎn)志綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，為遠(yuǎn)志種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和新品種選育提供了參考依據(jù)。本研究也存在一定的局限性，仍需結(jié)合分子水平進(jìn)行評(píng)價(jià)鑒定，后續(xù)將結(jié)合簡(jiǎn)單重復(fù)間序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)標(biāo)記進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析，以拓展遠(yuǎn)志遺傳多樣性研究的寬度和深度。

4 結(jié)論

參試遠(yuǎn)志種質(zhì)資源主要形態(tài)性狀和指標(biāo)成分的變異幅度較大，遺傳多樣性豐富；莖分支數(shù)、葉色、花色、根重、木芯重、遠(yuǎn)志酮Ⅲ含量和3，6′-二芥子?；崽呛?個(gè)指標(biāo)可作為核心種質(zhì)評(píng)價(jià)的綜合指標(biāo)。本研究從42份種質(zhì)資源中篩選出8份綜合表現(xiàn)良好的優(yōu)異單株，可用于進(jìn)一步開發(fā)和利用。