高黎貢山紫果西番蓮果皮中原花青素的提取工藝及其穩(wěn)定性

張星和，侯洪波，鄒章玉，馮李院，汪玉潔*

（1.保山學院資源環(huán)境學院，云南 保山 678000；2.云南省高校怒江河谷生物質(zhì)資源高值轉(zhuǎn)化與利用重點實驗室，云南 保山 678000）

西番蓮（Passiflora edulis）別名受難果、熱情果、洋酸茄花，是一種具有濃郁芳香氣味的水果[1-3]，為多年生的常綠西番蓮科西番蓮屬雙子葉植物，原產(chǎn)于南美巴西，目前在世界范圍內(nèi)廣泛種植，國內(nèi)主要集中于四川、廣西和云南等地，是近年來南方地區(qū)重點開發(fā)的特色經(jīng)濟作物之一[4-7]。西番蓮果實不僅可供食用，鮮果還可用于果汁、果酒和果脯的生產(chǎn)。西番蓮屬果實和根葉作為藥物的應(yīng)用歷史悠久，國外主要用來治療焦慮、痢疾、高血壓、疝氣等[8]。DeQueiroz等[9]用西番蓮果皮粉治療2型糖尿??；Do Socorro等[10]用西番蓮果皮粉治療艾滋病患者的脂代謝障礙問題，結(jié)果表明在調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)的同時，食用西番蓮果皮粉90 d能改善總膽固醇構(gòu)成，同時降低甘油酯的濃度；Ayres等[11]證明西番蓮葉提取物具有抗焦慮活性。我國《云南民族藥大辭典》中記載，西番蓮全身可入藥，具有活血鎮(zhèn)痛、止咳化痰的功效，可用于治療感冒、失眠和神經(jīng)痛等[12-13]。因此，西番蓮作為藥食同源的植物具有極大的開發(fā)價值和市場前景。

西番蓮的藥用價值很高，根本原因是其含有豐富的功能性物質(zhì)。目前，對西番蓮功能成分的研究主要集中在對果皮中多酚類[14-16]、膳食纖維[17]、果膠多糖[18-19]、生物堿[20-21]和類胡蘿卜素、芳香類物質(zhì)[2,22]的提取優(yōu)化及性質(zhì)的研究。其中，關(guān)于黃酮類[23-24]活性物質(zhì)的研究最多，如García-Ruiz等[25]利用高效液相色譜法從香蕉西番蓮中分離鑒定出9種原花青素。研究表明，原花青素是由兒茶素或表兒茶素聚合而成的黃酮類天然高分子物質(zhì)，具有多種藥理活性[26-27]，如抗氧化[28]、抗菌[29]、抗癌[30]、抗動脈粥樣硬化[31]、抗炎等[32]。研究顯示，低聚原花青素（oligomeric proanthocyanidis，OPC’s）在體內(nèi)的抗氧化活性是VC的20倍、VE的50倍[33]，其因超強的抗氧化性已成為食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的研究熱點。王開銀[34]采用超聲輔助和溶劑萃取法提取巴西莓原花青素，提取率為2.0278%；只德賢等[35]采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面法對微波-超聲協(xié)同提取原花青素的工藝進行優(yōu)化，白刺果原花青素最大得率為（17.289±0.402）mg/g。但是目前對紫果西番蓮果皮中原花青素的提取工藝及穩(wěn)定性研究較少。因此，本文以高黎貢山紫果西番蓮果皮為原料，采用微波輔助法提取原花青素，通過單因素、響應(yīng)面分析優(yōu)化其提取工藝，并考察溫度、光照條件和食品添加劑種類（蔗糖、檸檬酸、維生素C等）對提取液穩(wěn)定性的影響。以期提高西番蓮副產(chǎn)物的利用率，為西番蓮在食品工業(yè)中的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紫果西番蓮：采自高黎貢山地區(qū)。選擇成熟度適中、形狀飽滿的紫果西番蓮果實，去除霉變、病蟲害部分和果肉，留下果皮，用去離子水洗凈，通風處陰干，用高速萬能粉碎機進行粉碎，過60目篩，密封放于干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

兒茶素標準品（色譜純）：中國食品藥品檢定研究院；香草醛：天津市光復(fù)精細化工研究所；濃鹽酸：重慶川東化工集團有限公司；無水乙醇：四川隴西科學有限公司；維生素C：成都錦華藥業(yè)有限責任公司；以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計（UV-2600）：島津儀器蘇州有限公司；微波爐（M1-211A）：廣東美的廚房電器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（OSB-2000）：上海愛朗儀器有限公司；60目標準篩：紹興市上虞華豐五金儀器有限公司；高速萬能粉碎機（DFT-250A）：溫嶺市林大機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波輔助提取原花青素

準確稱取西番蓮果皮粉1.0 g于錐形瓶中，按照一定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液，充分攪拌并確保溶劑完全淹沒樣品，加塞封口，浸泡1 h。將混合物放入微波爐，設(shè)定微波功率，提取一段時間后，抽濾得原花青素粗提液[36]。將濾液濃縮至無醇味，加鹽酸香草醛顯色，于500 nm測定吸光度，計算原花青素得率。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 乙醇濃度對原花青素得率的影響

準確稱取5份西番蓮果皮粉1.0 g，分別加入30 mL濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，固定微波功率420 W、微波時間40 s，考察乙醇濃度對原花青素得率的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.2.2 料液比對原花青素得率的影響

準確稱取5份西番蓮果皮粉1.0 g，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）加入濃度為 70%的乙醇溶液，固定微波功率420 W、微波時間40 s，考察料液比對原花青素得率的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.2.3 微波功率對原花青素得率的影響

準確稱取5份西番蓮果皮粉1.0 g，加入30 mL濃度為 70%的乙醇溶液，微波功率為 140、280、420、560、700 W，微波時間40 s，考察微波功率對原花青素得率的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.2.4 微波時間對原花青素得率的影響

準確稱取5份西番蓮果皮粉1.0 g，固定料液比1∶30（g/mL），乙醇濃度 70%，微波功率 420 W，考察微波時間 20、40、60、80、100 s對原花青素得率的影響。每個水平均做3個平行。

1.3.3 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化試驗

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以原花青素得率（Y）為響應(yīng)值，選取乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、微波功率（X3）和微波時間（X4）為變量進行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化，具體因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 穩(wěn)定性試驗

將原花青素提取液進行適當稀釋后用于研究西番蓮果皮原花青素在不同光照條件、不同溫度和不同添加劑種類下的穩(wěn)定性。

1.3.4.1 光照條件對原花青素穩(wěn)定性的影響

將3份原花青素提取液分別置于室外陽光直射、室內(nèi)自然光和避光（用錫箔紙包裹置于暗處）條件下，每隔 2 h（2、4、6、8、10 h）于 500 nm 處測定吸光度 Ai，相同體積未置于光照條件下的原花青素原液吸光度記為A0，以Ai/A0的變化評價原花青素保存率，分析光照條件對西番蓮果皮原花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.4.2 溫度對原花青素穩(wěn)定性的影響

將 5 份原花青素提取液分別于 0、20、40、60、80 ℃下保溫 2、4、6、8、10 h，冷卻至室溫后于 500 nm 測定吸光度Ai，相同體積未保溫處理的原花青素原液吸光度記為A0，以Ai/A0的變化評價原花青素保存率，分析溫度對西番蓮果皮原花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.4.3 不同食品添加劑對原花青素穩(wěn)定性的影響

用相同濃度的蔗糖、檸檬酸、VC、山梨酸鉀溶液稀釋提取的原花青素，搖勻后避光且于室溫下保存0、12、24 h測吸光度Ai，加入相同體積的超純水作為對照（A0），以Ai/A0的變化評價原花青素保存率，分析常用食品添加劑對西番蓮果皮原花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.5 指標檢測方法

采用香草醛-濃鹽酸法測定提取液中原花青素含量：以乙醇溶液溶解兒茶素標準品，加入4%的香草醛和濃鹽酸，30℃水浴避光反應(yīng)10 min，在最大吸收波長500 nm處測定吸光度。以兒茶素濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖繪制標準曲線，得到回歸方程 y=1.935 1x+0.003 6，R2=0.999 4。

由標準曲線計算提取液中原花青素的濃度（mg/mL），按下式計算原花青素得率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用OriginPro9.0和SPSS 22.0進行繪圖及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Design-Expert V8.0.6進行響應(yīng)面設(shè)計試驗和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對原花青素得率的影響

圖1為乙醇濃度對西番蓮果皮原花青素得率的影響。

圖1 乙醇濃度對西番蓮果皮原花青素得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on proanthocyanidins yield

由圖1可知，原花青素得率隨著乙醇濃度的增加呈先上升后下降的變化趨勢，且整體上差異顯著。當乙醇濃度為60%時，西番蓮果皮原花青素得率達到了最大值，為5.33%，差異顯著（P＜0.05）。原因可能是乙醇濃度過低時，原料與體系之間滲透壓小，西番蓮果皮未能充分浸潤，不利于原花青素的溶出；隨著乙醇濃度的增大，醇水比發(fā)生改變，溶液體系介電常數(shù)改變，根據(jù)相似相溶原理，有利于多酚類物質(zhì)的溶解；當乙醇濃度為60%時，乙醇對粉末中氫鍵的破壞達最大，再繼續(xù)增大乙醇濃度脂溶性雜質(zhì)的溶出量也有所增加，成為原花青素的競爭性抑制劑[37]，導(dǎo)致得率下降。因此，選擇乙醇濃度50%、60%和70%進行后續(xù)試驗。

2.1.2 料液比對原花青素得率的影響

圖2為料液比對西番蓮果皮原花青素得率的影響。

圖2 料液比對西番蓮果皮原花青素得率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on proanthocyanidins yield

由圖2可知，原花青素得率隨溶劑體積的增大而增大，然后有所降低，之后趨于平穩(wěn)。料液比從1∶10（g/mL）變化到1∶30（g/mL），得率顯著性上升，可能是由于溶劑體積的增加，使原料更好地分散和漂浮，增大了原花青素與溶劑的接觸比表面積，傳質(zhì)推動力增大，從而提高了得率；而料液比為 1∶40、1∶50（g/mL）時，雖與1∶30（g/mL）時的得率相比差異顯著，但與 1∶20（g/mL）的得率比較并不顯著?？赡苁橇弦罕葹?∶30（g/mL）時，原花青素的析出已接近平衡。再繼續(xù)增大溶劑體積，會使其他成分加速溶出并影響原花青素的穩(wěn)定性，得率下降。綜合考慮，選擇料液比 1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）進行后續(xù)試驗。

2.1.3 微波功率對原花青素得率的影響

圖3為微波功率對西番蓮果皮原花青素得率的影響。

圖3 微波功率對西番蓮果皮原花青素得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on proanthocyanidins yield

由圖3可知，原花青素得率隨著微波功率的增大先升高后下降，整體上差異顯著。其中，當微波功率達到420 W時，得率最高，為5.24%，具有顯著性差異（P＜0.05）。這可能是由于微波功率增大，溶劑單位時間吸收的微波能越多，更多的微波能轉(zhuǎn)化為熱能，使體系溫度升高，分子擴散加快，原花青素的溶解度隨之增大；但當微波功率過大，熱效應(yīng)使體系溫度過高，原花青素被氧化或分解，得率下降。因此，選擇微波功率280、420、560 W進行后續(xù)試驗。

2.1.4 微波時間對原花青素得率的影響

圖4為微波時間對西番蓮果皮原花青素得率的影響。

圖4 微波時間對西番蓮果皮原花青素得率的影響Fig.4 Effect of microwave time on proanthocyanidins yield

由圖4可知，原花青素得率隨著微波時間的延長呈先上升后下降的趨勢，且整體上差異顯著。當微波時間為80 s時，得率最大且差異顯著（P＜0.05）。微波時間超過80 s后，原花青素得率下降。這可能是因為較長的微波時間，使更多的西番蓮果皮細胞壁結(jié)構(gòu)改變，便于內(nèi)部的原花青素擴散到溶液，所以得率增加；而繼續(xù)延長微波時間，溶液中極性物質(zhì)吸收的過多熱量會破壞已提取的原花青素，得率反而下降。因此，選擇微波時間60、80、100 s進行后續(xù)試驗。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 數(shù)學模型的建立及方差分析

響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Results of response surface methodology

用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到乙醇濃度（X1）、料液比（X2）、微波功率（X3）和微波時間（X4）與西番蓮果皮原花青素得率（Y）的多項式模型：Y=5.31-0.22X1+0.19X2+0.39X3+0.18X4+0.29X1X2+0.21X1X3+0.038X1X4-0.15X2X3-0.28X2X4-0.15X3X4-0.42X12-0.38X22-0.42X32-0.58X42。所得模型的方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3可知，響應(yīng)面模型高度顯著（P＜0.000 1）；失擬項不顯著（P=0.857 4＞0.05），且決定系數(shù) R2=0.945 0，校正系數(shù)R2adj=0.889 9，表明該模型與試驗的擬合效果較好，有一定的準確性；自變量與響應(yīng)值之間關(guān)系顯著，能很好地預(yù)測原花青素的提取工藝參數(shù)；變異系數(shù)為3.95%，信噪比為13.301，表明該模型試驗誤差小且可靠性高。

由F值大小可知，影響原花青素得率的因素主次順序為微波功率（X3）＞乙醇濃度（X1）＞料液比（X2）＞微波時間（X4），其中微波功率影響高度顯著（P＜0.000 1），其他 3 個因素影響極顯著（P＜0.01）；二次項中 X12、X22、X32和 X42影響高度顯著（P＜0.000 1），X1X2、X2X4影響極顯著（P＜0.01），X1X3影響顯著（P＜0.05），說明因素對響應(yīng)值的影響并非簡單的線性關(guān)系。

2.2.2 響應(yīng)面圖與交互作用分析

圖5～圖7為所建模型的等高線和響應(yīng)面曲面圖。

圖5 乙醇濃度和料液比對原花青素得率影響的等高線和響應(yīng)面曲面Fig.5 Contour lines and response surface for the effect of ethanol concentration and material-to-liquid ratio on proanthocyanidins yield

圖6 料液比和微波時間對原花青素得率影響的等高線和響應(yīng)面曲面Fig.6 Contour lines and response surface for the effect of material-to-liquid ratio and microwave time on proanthocyanidins yield

圖7 乙醇濃度和微波功率對原花青素得率影響的等高線和響應(yīng)面曲面Fig.7 Contour lines and response surface for the effect of ethanol concentration and microwave power on proanthocyanidins yield

響應(yīng)面曲面圖的陡峭程度能夠反映兩兩因素對原花青素得率影響的強弱，坡面越陡峭，則原花青素得率受交互作用影響越大；坡面越平緩，原花青素得率受交互作用影響越小。等高線形狀也可反映交互作用的強弱，橢圓形表示相應(yīng)因素之間交互作用顯著，圓形表明交互作用不顯著。由圖5～圖7可知，響應(yīng)面曲面的陡峭度大小順序為X1X2＞X2X4＞X1X3，且等高線均呈橢圓形，表明乙醇濃度和料液比、料液比和微波時間、乙醇濃度和微波功率的交互作用對原花青素得率影響顯著，與表3方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)工藝和驗證試驗

西番蓮原花青素提取的最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度58.71%，料液比 1∶30.98（g/mL）、微波功率 474.84 W、微波時間81.56 s，此條件下西番蓮果皮原花青素得率預(yù)測值為5.41%。根據(jù)實際操作條件，將最佳提取工藝修正為乙醇濃度59%，料液比為1∶31（g/mL）、微波功率為470 W、微波時間82 s，得到原花青素得率為5.38%。實際值與預(yù)測值之間偏差較小，驗證了該響應(yīng)面模型的有效性，說明試驗優(yōu)化的技術(shù)參數(shù)是可靠的。

2.3 西番蓮原花青素穩(wěn)定性結(jié)果分析

2.3.1 光照條件對原花青素穩(wěn)定性的影響

圖8為不同光照條件對原花青素穩(wěn)定性的影響。

圖8 光照條件對原花青素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of light condition on the stability of proanthocyanidins

由圖8可知，在不同光照條件下，原花青素提取液的吸光度比值都隨著時間的延長而減小，且避光組＞自然光組＞陽光直射組。在10 h內(nèi)避光組的吸光度比值呈較緩慢下降趨勢，自然光組與陽光直射組在2 h～8 h時吸光度比值都明顯降低，相同時間內(nèi)陽光直射組下降更快；在8 h～10 h時自然光組吸光度比值減小速度迅速提升，陽光直射組趨于平穩(wěn)，這可能是因為陽光直射8 h時，在強紫外線作用下，溶液中的原花青素含量太低，大量原花青素均已被破壞，導(dǎo)致吸光度比值變化不明顯。表明避光保存有利于西番蓮原花青素濃度的穩(wěn)定，減少降解損失。因此在使用西番蓮原花青素時盡量避光，尤其避免紫外線照射。

2.3.2 溫度對原花青素穩(wěn)定性的影響

圖9為不同溫度對原花青素穩(wěn)定性的影響。

圖9 溫度對原花青素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of temperature on the stability of proanthocyanidins

由圖9可知，溫度影響西番蓮原花青素穩(wěn)定性，隨著時間的延長，各溫度下的原花青素吸光度比值均有不同程度的降低。溫度低于60℃時，西番蓮原花青素的吸光度比值在10 h內(nèi)變化較小，基本穩(wěn)定；當溫度為60℃時，吸光度比值隨著時間延長急劇下降。故加工提取原花青素時，溫度以不高于60℃為佳，應(yīng)在低溫下保存。

2.3.3 食品添加劑種類對原花青素穩(wěn)定性的影響

圖10為食品添加劑種類對原花青素穩(wěn)定性的影響。

圖10 食品添加劑種類對原花青素穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of food additive type on the stability of proanthocyanidins

由圖10可知，在避光且低溫條件下，添加蔗糖、檸檬酸、VC和山梨酸鉀的原花青素提取液的吸光度比值很接近，說明這4種添加劑對西番蓮果皮原花青素的穩(wěn)定性無明顯影響。即使添加后24 h，蔗糖和山梨酸鉀的原花青素混合液吸光度比值也沒有太大的變化。而一段時間后，檸檬酸和VC對原花青素穩(wěn)定性的影響較為明顯，溶液的吸光度比值有所增大，可能是酸性條件下原花青素會部分水解形成花青素和花色苷，VC作為典型的抗氧化劑，也會促進原花青素轉(zhuǎn)化。因此蔗糖、山梨酸鉀對原花青素的穩(wěn)定性無明顯影響，而檸檬酸和VC會使原花青素水解，有一定程度的增色作用。

3 結(jié)論

本文以高黎貢山紫果西番蓮果皮為原料，優(yōu)化了微波輔助提取原花青素的工藝條件，并對提取液的穩(wěn)定性進行了研究。通過Box-Behnken響應(yīng)面分析法得到最佳提取條件為乙醇濃度59%，料液比為1∶31（g/mL）、微波功率為470 W、微波時間82 s，在此工藝下原花青素得率為5.38%；影響原花青素得率的因素順序為微波功率＞乙醇濃度＞料液比＞微波時間。穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明：原花青素在光照尤其是陽光直射下穩(wěn)定性較差，避光條件下較穩(wěn)定，因此在貯存或使用時應(yīng)盡量避免暴露在紫外線下；其熱穩(wěn)定性較差，在60℃以上容易分解，因此應(yīng)盡量避免高溫；添加劑蔗糖、苯甲酸鈉對其穩(wěn)定性無明顯影響，而檸檬酸和VC對其有一定的增色作用。試驗結(jié)果為原花青素的提取以及應(yīng)用開發(fā)提供了依據(jù)。