基于計算機輔助藥物設計的新冠病毒抑制劑的虛擬篩選及其活性驗證

李 震，王 瑞

(聊城大學 藥學院，山東 聊城 252059)

由新冠病毒(SARS-CoV-2)引起的新冠肺炎已經(jīng)成為一個世界性安全問題，給世界各國經(jīng)濟帶來了巨大的損失[1]。雖然疫苗的特異性強，但其研發(fā)成本高且周期長，而且RNA病毒的變異速度較快，這使疫苗的有效性大大降低[2，3]。針對新冠病毒如此高的變異速度，當務之急是研發(fā)一種既對當前的病毒有效，也對變異的病毒有治療效果的“特效藥”。有研究表明，病毒入侵細胞時，首先病毒S蛋白RBD與人體細胞的表面受體ACE2結合，隨后病毒膜和細胞膜融合，病毒被內(nèi)化進入細胞，在細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄和復制，重新組裝成大量新的病毒，又去繼續(xù)感染其他細胞。S蛋白受體結合域(RBD)與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的結合是SARS-CoV-2進入宿主細胞的方式[4，5]，不管病毒是否變異，均主要通過此種方式入侵細胞，故可以針對這種結合方式設計一種抑制劑阻斷兩者結合，從而阻止新冠病毒進入宿主細胞。小分子抗病毒藥物在治療由病毒引起的疾病方面有著舉足輕重的地位。瑞德西韋、洛匹那韋、 依米丁、高三尖杉酯堿等多種小分子抗病毒藥物已被證明可以抑制病毒的復制，其中瑞德西韋是2019年批準的第一種治療新冠病毒的藥物[6，7]。小分子抗病毒藥物在阻斷蛋白與蛋白結合方面效果欠佳，而多肽藥物在這方面具有明顯的優(yōu)勢[8]。PDB(Protein Data Bank)蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫中編號為6M0J的RBD與ACE2的熱點結合殘基通過100 ns的分子動力學模擬已分析得到[9]，ACE2中的一段多肽(a.a.21～43)已被驗證具有阻斷RBD與ACE2結合的活性，且27～38這段多肽不能與RBD結合[10]，通過對接也驗證了這一點。通過丙氨酸掃描，三種不同的對接方式以及50 ns的分子動力學模擬驗證了兩條肽段(18肽：28～45和23肽：23～45)具有相近的結合效率[11]。肽的長度雖然縮短，但對結合效率的影響較小，提示或許存在一條更短的多肽仍具有阻斷病毒入侵的能力。本研究使用DS軟件確定最佳多肽對接分數(shù)，通過突變提高多肽的親和力，設計了一系列長度較短的多肽并通過對接和體外細胞實驗進行篩選，這將為新冠病毒的治療提供新的方式。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑與儀器

293T細胞(中國科學院細胞庫)；293-ACE2細胞(上海藥物所)；多肽合成(南京肽業(yè)生物科技有限公司)；新冠假病毒SARS-CoV-2 Spike Pseudotyped Virus (GFP)(吉滿生物科技(上海)有限公司GM-0220PV07)；DMEM培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific(GIBCO))；胎牛血清(美國Thermo Fisher Scientific(GIBCO))；MTT(上海阿拉丁試劑有限公司)；DMSO(上海阿拉丁試劑有限公司)；RG005螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific)；CKX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ImageXpress Micro Confocal高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)(美谷分子儀器(上海)有限公司)；XP6百萬分之一超微量天平(德國梅特勒公司)；多功能微孔板檢測Synergy H1(美國Biotek公司)。

1.2 多肽設計、篩選與驗證

1.2.1 三維結構準備。從PDB蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫[12]中檢索到了ACE2-RBD復合物的三維結構(PDB編號：6M0J)用于肽段的設計和開發(fā)。使用DS軟件對6M0J蛋白質(zhì)復合物進行預處理[13]。所有設計的肽的復雜結構均是從與SARS-CoV-2-RBD結合的ACE2-PD的螺旋的晶體結構中獲得，同時查看RBD和ACE2的結合位點。

1.2.2 初始構象設定。將熱點殘基設置為結合位點，同時均方根誤差截止值(RMSD Cutoff) 設置為6.0；相互作用面的截止距離(Interface Cutoff)設置為9.0；最大分組數(shù)(Maximum Number of Clusters )設置為60，進行ZDOCK對接。同時在對接的蛋白質(zhì)姿勢的初始排名中使用形狀互補性，去溶劑化作用和靜電能。使用默認參數(shù)將對接結果中ZRank分數(shù)[14]排名前10的構象進行RDOCK對接，來對構象進行優(yōu)化，參數(shù)為默認參數(shù)。使用蛋白質(zhì)疊合工具對RDOCK對接結果產(chǎn)生的構象進行疊合，同時以6M0J原始構象為基準計算各構象的RMSD值。

1.2.3 多肽重設計。使用DS軟件的計算突變結合能(Calculate Mutation Energy (Binding))模塊先進行單點突變(丙氨酸掃描)[15]，然后對非關鍵的氨基酸殘基進行三點突變，其余參數(shù)為默認參數(shù)。使用DS軟件的側(cè)鏈重設定(Side-Chain Refinement)功能[16]對突變后的配體構象進行優(yōu)化，參數(shù)為默認參數(shù)。使用DS軟件的能量最小化(Full Minimization)模塊對配體和受體結合的復合物進行能量最小化，參數(shù)為默認參數(shù)。

1.2.4 CDOCKER對接。使用DS軟件的CDOCKER對接模塊對30～38的原始序列，最佳三種突變方式以及最差的一種突變方式與RBD進行CDOCKER對接，最大最佳構象數(shù)量(Top Hits)設置為100，其余參數(shù)為默認參數(shù)。

1.3 體外細胞實驗

1.3.1 細胞培養(yǎng)。293T細胞和293-ACE2細胞均使用DMEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為5%。顯微鏡下觀察細胞，選擇生長狀態(tài)良好的細胞，密度達到80%～90% 即可傳代，傳代時用0.25% 胰酶消化細胞，制備單細胞懸液進行細胞計數(shù)(4個大方格細胞數(shù)的均值×104為每mL所含細胞數(shù))。根據(jù)細胞計數(shù)的結果，將適當數(shù)量的細胞懸液按照實驗需要接入含有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)板中，補足培養(yǎng)基，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以備實驗所需。

1.3.2 MTT實驗。將對數(shù)生長期的293-ACE2細胞以3 000/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設計4個復孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后，每孔分別加入1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L的多肽，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)處理4 h后，去掉培養(yǎng)基，每孔加入120 μL DMSO，輕微震蕩10 min，在490 nm的波長下測定OD值讀數(shù)，同時設置調(diào)零孔，對照孔，重復實驗三次。計算相對細胞存活率 Relative survival/control=測試組OD值/對照組OD值。

1.3.3 多肽活性測定。將對數(shù)生長期的293T和293-ACE2細胞以5 000/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設計2個復孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。將不同濃度的多肽與帶有綠色熒光標記的新冠假病毒SARS-CoV-2 Spike Pseudotyped Virus(GM-0220PV07)孵育10 min后加入細胞，同時設置對照孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h，ImageXpress Micro Confocal高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)拍照，并進行熒光檢測，計算相對熒光強度 Fluorescence relative to control =測試組熒光值/對照組熒光值，重復實驗三次。

1.3.3 統(tǒng)計學分析。實驗所得數(shù)據(jù)均以平均值(Mean ± SD)表示，各組數(shù)據(jù)差異性比較采用t-test(非參數(shù)檢驗)方法進行分析，p>0.05表示差異性不顯著；*，0.01

2 結果

2.1 初始構象設定

使用DS軟件查看6M0J中RBD與ACE2的結合殘基，與已報道的關鍵殘基基本一致，將這些殘基設置為結合位點進行ZDOCK對接，共產(chǎn)生2 000個構象。將結果中Zdock值前10的構象與6M0J進行疊合后發(fā)現(xiàn)對接結果較好，這10個構象的RMSD值有9個小于0.2 nm，其中有4個構象的RMSD值小于0.1 nm，如表1所示。再次使用DS軟件查看這4個構象的結合殘基并與已有報道中的關鍵殘基進行比較，如表1所示。結果顯示Pose2與關鍵殘基相比，缺少19，355，387，但這三個殘基是氫鍵維持時間最短的三個；Pose3缺少19，35，37，38，41，355，387；Pose4缺少35，37，41，42，355，387；Pose5缺少35，37，355，387，除Pose2外都涉及較重要的關鍵殘基。而比較RMSD值，Pose2的也是最小的。同時計算RBD與ACE2的結合力為-57.347 48 kcal/mol。綜上，選擇Pose2中RBD-ACE2復合物的構象作為初始構象，并將對接結果作為參照。

表1 Zdock分數(shù)排名前10且RMSD值小于1的4個構象以及原始構象的結合位點

2.2 初始肽段構建

圖1 ACE2、21～43、27～38、30～38與RBD對接后親和力計算

ACE2中的一段多肽(a.a.21～43)已被驗證具有阻斷RBD與ACE2結合的活性，且27～38這段多肽不能與RBD結合[10]。使用這兩段已被驗證親和力的多肽(a.a.21～43 和a.a.27～38)與RBD進行對接，并與初始構象的對接結果進行比較，以驗證通過對接設計多肽抑制劑的可靠性，如表2所示。結果顯示21～43肽段的對接結果確實和RBD與ACE2的對接結果相當，而27～38肽段的對接結果較差，通過計算親和力得知，RBD與ACE2的親和力為-57.347 48 kcal/mol，21～43肽段與RBD的親和力為-60.384 57 kcal/mol，27～38肽段與RBD的親和力為-38.220 76 kcal/mol，如圖1所示。通過計算親和力也進一步驗證21～43這段多肽的親和力相當，而27～38這段多肽的親和力較低，表明對接結果較好。

針對熱點結合殘基，設計一系列不同長度的多肽，并分別與RBD進行對接，如表2所示。結果顯示30～38這段多肽是長度較短且對接結果相當?shù)碾亩巍ｋm然它的親和力只有-45.235 03 kcal/mol，但熱點結合殘基最為密集，且ZDock值也較大，說明這段多肽的形狀互補性更好，更能與RBD緊密的結合。綜上這段多肽具有較高的潛力并設定為初始肽段。

表2 多肽與RBD的對接結果

2.3 對初始肽段進行突變

對初始肽段首先進行單點突變(丙氨酸掃描)，來確定初始肽段中的關鍵氨基酸殘基位點。其中32、33、37號位氨基酸殘基突變?yōu)楸彼崮芰可咔页^0.5 kcal/mol，為關鍵氨基酸殘基，30、34、38突變能升高小于0.5 kcal/mol，而31和35號位氨基酸殘基突變能降低。故選擇31、35以及36號位ALA氨基酸殘基進行三點突變，共產(chǎn)生6 156種突變方式，其中共有3532種突變方式的突變能小于0.5 kcal/mol，最佳突變方式為K31I，E35Y，A36H。為更加方便的了解突變在整體上的情況，對突變能小于-4 kcal/mol的突變結果進行分析，如圖2所示。

結果顯示，這條多肽更傾向于突變成堿性殘基，而在親疏水性方面不太明顯。這或許為設計新冠病毒的阻斷劑做出了提示。將原始構象(pro1)，最佳前三種突變構象(pro2～pro4)以及最差突變構象(pro5)共五個構象與RBD的親和力進行比較，如圖3所示。發(fā)現(xiàn)親和力和突變結果相符合，其中 pro2與RBD的結合力最高，pro2～pro4與RBD的結合力均在-100 kcal/mol以下，但pro4卻表現(xiàn)出更高的范德華力。從結合能方面看，設計的肽段都要比RBD與ACE2的結合能高。使用DS軟件的CDOCKER對接模塊對這5條肽與RBD進行對接同時計算產(chǎn)生的每一個構象的結合能，如圖4所示。結果顯示pro4對接結果最好，pro5結果最差，這或許和范德華力的大小有關系。

圖2 突變能小于0.5 kcal/mol的統(tǒng)計結果

圖3 五條多肽與RBD的親和力

圖4 五條多肽與RBD的-CDOCKER能量值的統(tǒng)計結果

注：5條多肽(pro1、pro2、pro3、pro4、pro5)分別在5種濃度(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)下對293-ACE2細胞的毒性。Relative survival/control=測試組OD值/對照組OD值，所有的點表示三個獨立實驗的平均值，誤差線表示平均值的標準誤差。圖5 多肽細胞毒性分析

2.4 多肽細胞毒性分析

將對數(shù)生長期的293-ACE2細胞以3 000/孔接種于96孔培養(yǎng)板，實驗每組設計4個復孔。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。 每孔分別加入1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 的多肽，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h，MTT法測定不同多肽的細胞毒性。結果顯示，不同濃度的多肽在293-ACE2細胞中均顯示出較高的細胞活力(圖5)，與對照相比無明顯差異，因此推測5條多肽對細胞均無明顯毒性。

2.5 多肽活性分析

將對數(shù)生長期的293T和293-ACE2細胞以5 000/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設計2個復孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。將不同濃度的多肽與帶有綠色熒光標記的新冠假病毒SARS-CoV-2 Spike Pseudotyped Virus(GM-0220PV07)孵育10 min后加入細胞，高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)結果顯示，加入5條多肽后，與對照相比，進入細胞的病毒熒光強度明顯減弱，并隨多肽濃度的上升，熒光強度逐漸減弱(圖6(a))，因此推測5條多肽均具有阻斷病毒入侵細胞的能力。數(shù)據(jù)分析結果顯示，pro1多肽和pro4多肽在最高濃度1 μM時的熒光強度最小，因此在該濃度下pro1和pro4阻斷病毒入侵細胞的能力最強(圖6(b))。

注：(a) 5條多肽(pro1、pro2、pro3、pro4、pro5)分別在4種濃度(1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)下對病毒的阻斷作用;(b) 熒光強度的定量統(tǒng)計。相對熒光強度 Fluorescence relative to control =測試組熒光值/對照組熒光值，誤差線表示平均值的標準誤差。圖6 多肽活性測定

3 討論

由新冠病毒引起的疫情對人類的健康和世界的經(jīng)濟發(fā)展帶來嚴重的破壞。S蛋白受體結合域(RBD)與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的結合是新冠病毒進入宿主細胞的方式。ACE2表達于人體的多種器官和組織中，例如心臟、腎臟、睪丸、肺、肝臟、結腸、呼吸道以及血管[17]，因此ACE2在人體中扮演著極其重要的角色，這也是患者感染新冠病毒后，出現(xiàn)呼吸困難以及多種器官受損的原因所在[18]。阻斷RBD與ACE2的結合，將會有效的抑制新冠病毒對人體細胞的感染。

本研究利用DS軟件對接設計了一條含有9個氨基酸的多肽(pro1)，并通過突變進一步提高了其與RBD的親和力(pro2-pro4)，從而阻斷RBD與ACE2的結合。有研究表明，存在于hACE2上的一段多肽(a.a.21～43)與RBD的親和力較高，且另一段多肽(a.a.27～38)不能與RBD結合[10]。對突變結果進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)這條多肽更傾向于突變成堿性殘基，而在親疏水性方面不太明顯，這為新冠病毒抑制劑的開發(fā)提供了重要依據(jù)。本研究進一步在體外細胞實驗中證明計算機輔助設計的多肽具有一定的阻斷病毒入侵的能力，與對接結果相似。pro5作為最差的突變體，與pro2、3的熒光強度相似，也具有一定的阻斷病毒入侵的能力。這是因為原始肽段與RBD已具有較高的親和力，雖突變結果較差但是仍然會表現(xiàn)出一定的親和力。其次，設計的多肽的目的是為了和RBD-ACE2的結合面相結合，但也不排除設計的多肽會結合到其他位置，導致表現(xiàn)出了抑制作用，還需進一步驗證。體外實驗結果表明通過虛擬對接設計的多肽對病毒進入宿主細胞具有阻斷作用，這種方法是可行的，但同時也表明虛擬對接設計與真實情況會存在一定的差別。計算機輔助藥物設計在一定程度上縮短了藥物篩選的時間，加快藥物研發(fā)的速度，助力藥物研究。