B亞型禽偏肺病毒的分離鑒定及致病性研究

于蒙蒙，包媛玲，王素艷，辛子琪，劉 鵬，馮笑艷，孟令宅，郭 茹，張艷萍，劉長(zhǎng)軍，祁小樂(lè)，李俊平，王笑梅，3，高玉龍*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室禽免疫抑制病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，哈爾濱 150069； 2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；3.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

禽偏肺病毒(avian metapneumovirus, aMPV)屬于副黏病毒科，肺病毒亞科，偏肺病毒屬，為單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒。根據(jù)編碼G蛋白的基因?qū)MPV分為A、B、C和D4個(gè)亞型。aMPV的自然宿主是火雞，其次是雞。aMPV感染火雞可引起火雞鼻氣管炎(turkey rhinotracheitis, TRT)，是除禽流感之外對(duì)火雞影響最大的呼吸道疾病。感染蛋雞導(dǎo)致產(chǎn)蛋量下降、軟殼蛋率增高，也是導(dǎo)致肉雞腫頭綜合征(swollen head syndrome, SHS)的主要病原體，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

aMPV最早于20世紀(jì)70年代末在南非發(fā)現(xiàn)，隨后相繼出現(xiàn)在歐洲、亞洲、南美等地。血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)大多數(shù)火雞飼養(yǎng)國(guó)家除澳大利亞和加拿大外均有該病的存在。1999年，沈瑞忠等首次在國(guó)內(nèi)分離報(bào)道aMPV，隨后各地相繼有該病的報(bào)道。2009年，郭龍宗和曲立新在山東膠東地區(qū)對(duì)種雞群進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)aMPV的感染是普遍存在的；2012年，贠炳嶺等調(diào)查表明黑龍江、吉林、河北、湖北等地區(qū)的雞群也普遍感染aMPV，部分雞場(chǎng)的血清陽(yáng)性率甚至高達(dá)100%；2012—2015年，江蘇、遼寧、河南、山東和河北5個(gè)省份也存在aMPV的感染，陽(yáng)性率為50.7%；2016年，本實(shí)驗(yàn)室從遼寧某肉種雞場(chǎng)分離到B亞型aMPV(LN16株)，且證實(shí)該分離株對(duì)SPF、商品蛋雞、肉雞和黃羽雞均有明顯的致病性；2017年，安徽、河北、北京、上海等地的不同品種(系)雞群中均存在aMPV抗體，且出現(xiàn)臨床癥狀；近幾年來(lái)，本課題組發(fā)現(xiàn)河北井陘縣和遼寧海城地區(qū)的多個(gè)蛋雞雞群以及黑龍江、山東等地的多個(gè)雞群出現(xiàn)了疑似aMPV感染的癥狀，其aMPV抗體陽(yáng)性率和抗體滴度均較高。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明aMPV在我國(guó)雞群中已流行甚廣，但由于病毒分離困難，國(guó)內(nèi)關(guān)于aMPV分離鑒定報(bào)道和致病性研究相對(duì)較少。

本研究從疑似aMPV感染發(fā)病雞群的鼻甲骨內(nèi)成功分離到3株病毒，經(jīng)RT-PCR、病毒分離、基因序列分析、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)等試驗(yàn)鑒定為B亞型aMPV，分別命名為SD2001、SD2002和HLJ2101。致病性研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)雞群流行的B亞型aMPV對(duì)雞有明顯的致病性，這為aMPV的流行病學(xué)調(diào)查研究、疫苗的研制以及該病的有效防控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

山東省、福建和黑龍江等地區(qū)的養(yǎng)雞場(chǎng)的雞出現(xiàn)疑似aMPV感染的臨床癥狀：甩頭、精神萎靡、嚴(yán)重者出現(xiàn)腫頭等。本研究從山東省某蛋雞規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的病雞群內(nèi)采集了35份喉拭子(35/100)、30份鼻甲骨(30/50)及10份肺(10/20)；從福建某肉種雞場(chǎng)的父母代肉雞采集了40份喉拭子(40/100)和10份鼻甲骨(10/50)；黑龍江某肉種雞場(chǎng)的祖代肉雞采集了25份喉拭子(25/100)、10份鼻甲骨(10/50)及10份肺(10/20)，以上雞場(chǎng)均未免疫過(guò)aMPV疫苗。將采集的病料冷藏保存，送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)和分離。

1.2 細(xì)胞、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Vero細(xì)胞、aMPV-N基因的陽(yáng)性質(zhì)粒PCAGGS-N、aMPV/B陽(yáng)性血清均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病團(tuán)隊(duì)鑒定、保管和供應(yīng)；SPF雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 常用試劑

RNAiso Plus、pMD18-T載體、rTaq酶、Premix Taq(EX Taq)DNA聚合酶、Prime STAR Max 預(yù)混酶和DL2000 Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；BioRT高靈敏cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自博日科技有限公司；核酸膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；FITC標(biāo)記的兔抗雞IgY熒光二抗購(gòu)自Sigma試劑公司。

1.4 病料的處理

取適量組織樣品放入1 mL預(yù)冷的無(wú)菌PBS內(nèi)，研磨勻漿，喉拭子內(nèi)加入1 mL PBS漩渦振蕩混勻1 min。將所有樣品利用低溫高速離心機(jī)在4 ℃條件下，6 000離心10 min，取上清，經(jīng)0.45 μm的濾器過(guò)濾后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-PCR鑒定

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的LN16毒株序列(MH745147.1)，利用DNAStar里面的Megalign軟件對(duì)不同亞型的基因序列進(jìn)行比較，選擇其保守區(qū)域設(shè)計(jì)aMPV的特異性檢測(cè)引物：上游引物aMPVNF：5′-ATGCAAGCTTATGGAGCTGG-3′/下游引物aMPVNR: 5′-ATGCAAGCTTATGGAGCTGG-3′，引物由吉林長(zhǎng)春庫(kù)美生物有限公司合成。取“1.4”處理好的病料各200 μL，利用Trizol提取總RNA，然后根據(jù)BioRT高靈敏cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物為模板，采用aMPVNF/NR進(jìn)行PCR檢測(cè)，以aMPV-基因陽(yáng)性質(zhì)粒PCAGGS-N作為陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)體系為25 μL：aMPVNF 2 μL，aMPVNR 2 μL，cDNA 2 μL，EX預(yù)混酶12.5 μL，RNase Deionized 水6.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，若在228 bp處出現(xiàn)條帶判斷為陽(yáng)性，用于后續(xù)的病毒分離。

1.6 病毒分離

取400 μL“1.4”處理好的病料接種于6孔板內(nèi)單層的Vero細(xì)胞，37 ℃、5% CO溫箱內(nèi)孵育1 h后，將培養(yǎng)液換成含1%青鏈霉素、2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞維持液。每天觀察Vero細(xì)胞的狀態(tài)，持續(xù)觀察7 d，然后將接毒的細(xì)胞反復(fù)凍融3次，然后在4 ℃條件下，6 000離心10 min去除細(xì)胞碎片，收集上清，盲傳5代后，將仍未出現(xiàn)特征性的細(xì)胞病變(CPE)的棄去，出現(xiàn)CPE則進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

1.7 G和F基因測(cè)序

根據(jù)LN16(MH745147.1)的和基因設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增和基因的引物。擴(kuò)增基因引物序列為aMPV-GF: 5′-ATGGGGTCAGAGCTCTACAT-3′；aMPV-GR: 5′-TTATTGACTAGTACAGCACC-3′。擴(kuò)增基因引物序列為aMPV-FF:5′-ATGTACCTCAAACTGCTACT-3′；aMPV-FR:5′-TCAACTGATGTAGCCCATGT-3′。以病毒分離陽(yáng)性樣品的cDNA為模板進(jìn)行和基因的擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：上下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，Prime STAR Max預(yù)混酶25 μL，加水至50 μL。反應(yīng)程序：98 ℃ 5 min；98 ℃ 15 s，53 ℃ 15 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物中加入1 μL rTaq酶在72 ℃ 10 min加poly A尾巴。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，和基因的預(yù)期目的條帶分別為1 263和1 617 bp，然后按照Axygen的膠回收試劑盒說(shuō)明書對(duì)PCR產(chǎn)物純化。

按照pMD18-T載體說(shuō)明書將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體分別進(jìn)行連接，挑取菌落進(jìn)行PCR篩選陽(yáng)性單克隆菌。最后選擇3個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒送吉林庫(kù)美生物公司進(jìn)行測(cè)序。利用DNAStar和MEGA7.0軟件進(jìn)行同源性分析和繪制遺傳演化進(jìn)化樹(shù)。

1.8 IFA檢測(cè)

取50 μL“1.6”分離的病毒培養(yǎng)液接種于6孔板內(nèi)單層的Vero細(xì)胞37 ℃、5% CO溫箱內(nèi)孵育1 h，將培養(yǎng)液換成含1%青鏈霉素，2%血清的DMEM細(xì)胞維持液，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，培養(yǎng)72 h后進(jìn)行IFA檢測(cè)。具體操作：棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBST洗3次；然后加入500 μL無(wú)水乙醇室溫固定15 min，PBST洗5遍，加入500 μL 100倍稀釋的aMPV陽(yáng)性血清在37 ℃條件下孵育1 h，PBST洗5遍，再加入500 μL 200倍稀釋的FITC標(biāo)記兔抗雞IgY的熒光二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBST洗5遍。將處理好的樣品置于熒光倒置顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.9 RT-qPCR檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[12]中aMPV/B的RT-qPCR檢測(cè)方法，根據(jù)LN16的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物和探針，引物aMPV-F:5-AATAGTCCTCAAGCAAGTCCTCAGA-3′/aMPV-R:5′-CTGTTGTAATTTGACCTGTTCTACACT-3′；探針：5′-FAM-CTGGTGTTATCAGCCTTAGGCTTGACGCTTAMRA-3′。反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 10.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L)和探針各0.7 μL，模板cDNA 2.0 μL，HO 5.9 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性 3 s，60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)，計(jì)算樣品中病毒拷貝數(shù)。

1.10 病毒含量(TCID50)測(cè)定

用無(wú)血清的DMEM在1.5 mL離心管內(nèi)10倍倍比稀釋病毒，渦旋混勻，每個(gè)稀釋度做18個(gè)重復(fù)，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的Vero細(xì)胞，其中，96孔板的第一行(A)和最后一行(H)設(shè)為陰性對(duì)照孔，100 μL·孔)。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d，每天觀察病變，統(tǒng)計(jì)各稀釋度產(chǎn)生的CPE孔數(shù)。根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID。

1.11 外源病毒檢測(cè)

將分離的病毒各取200 μL按照Axygen的DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA，然后根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行雞毒支原體(MG)和雞傳染性喉氣管炎(ILTV)的檢測(cè)。同時(shí)以病毒分離陽(yáng)性樣品的cDNA為模板，進(jìn)行新城疫病毒(NDV)和傳染性支氣管炎病毒(IBV)的檢測(cè)。

1.12 動(dòng)物感染試驗(yàn)

將40只3周齡SPF雞隨機(jī)分為兩組：感染組和空白組各20只，其中，感染組采用滴鼻點(diǎn)眼的方法進(jìn)行攻毒，每只接種200 μL, 10TCID·mL的SD2001病毒液，空白組也采用滴鼻點(diǎn)眼的方式接種200 μL無(wú)菌的PBS，分開(kāi)飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)，每天觀察并記錄臨床癥狀。感染后2、3、4、5及6 d采集攻毒組和空白組的鼻裂拭子，進(jìn)行排毒檢測(cè)；于感染后第9天每組隨機(jī)抽取3只采集喉頭、氣管和鼻甲骨固定于福爾馬林內(nèi)，用于組織病理學(xué)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 臨床樣品RT-PCR檢測(cè)

以220份樣品的cDNA為模板，利用aMPV的基因的特異性檢測(cè)引物aMPV-NF/NR進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，有3份(山東2份，黑龍江1份)鼻甲骨樣品擴(kuò)增出了228 bp左右的特異性條帶，與預(yù)期目的片段大小一致(圖1)。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1～3. 3份鼻甲骨樣品；+. 陽(yáng)性性對(duì)照；-. 陰性對(duì)照M. DNA marker (DL2000); 1-3. Three samples of nasal turbinate; +. Positive control; -. Negative control圖1 aMPV N基因的RT-PCR檢測(cè)Fig.1 RT-PCR detection of aMPV N gene

2.2 病毒分離

將RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的樣品分別接種于Vero細(xì)胞，盲傳5代。結(jié)果顯示，3份鼻甲骨樣品接種的Vero細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞變圓、聚集和融合等明顯的CPE(圖2)，符合aMPV所形成的特征性CPE，初步判斷分離到的病毒為aMPV，同時(shí)在分離的病毒內(nèi)未檢測(cè)到引起雞呼吸道癥狀的其他致病性病毒：IBV、NDV、ILTV和MG等(結(jié)果沒(méi)顯示)，將其命名為SD2001、SD2002和HLJ2101。

SD2001、SD2002和HLJ2101在Vero細(xì)胞上形成的細(xì)胞變圓、聚集和融合等明顯的CPE(箭頭)Obvious CPE (arrow) such as cell rounding, aggregation and fusion formed by SD2001, SD2002 and HLJ2101 on Vero cells圖2 SD2001、SD2002、HJL2101分離株在Vero細(xì)胞上的CPE(標(biāo)尺=100 μm)Fig.2 CPE of SD2001, SD2002, HJL2101 isolates on Vero cell (bar=100 μm)

2.3 G和F基因序列分析

以SD2001、SD2002和HLJ2101分離株提取的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板利用aMPV-GF/GR和aMPV-FF/FR引物分別進(jìn)行和基因的擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果顯示，3個(gè)分離株的基因全長(zhǎng)1 263 bp，編碼414個(gè)氨基酸；基因全長(zhǎng)1 617 bp，編碼539個(gè)氨基酸。

利用DNA Star中MegAlign軟件對(duì)3個(gè)分離株的和基因的核苷酸和氨基酸序列相似性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，3個(gè)分離株的基因與其他國(guó)家B亞型aMPV毒株的核苷酸和氨基酸序列的相似性分別為93.4%～96.0%和88.7%～92.8.%，與我國(guó)B亞型LN16分離株的核苷酸和氨基酸序列的相似性分別為98.4%～98.6%和97.3%～97.8%，與A、C和D亞型aMPV毒株的核苷酸和氨基酸的相似性僅為27.1%～61.8%和16.1%～36.7%。3個(gè)分離株的基因與B亞型aMPV毒株的核苷酸和氨基酸序列的相似性分別為95.6%～98.2%和97.6%～98.9%，與我國(guó)B亞型LN16分離株的核苷酸和氨基酸的相似性為99.3%～100.0%和99.4%～100.0%，與A、C和D亞型aMPV毒株的核苷酸和氨基酸的相似性為66.8%～74.8%和72.5%～86.5%。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，3個(gè)分離株的基因(圖3A)和基因(圖3B)均與B亞型aMPV毒株在同一分枝上，表明SD2001、SD2002和HLJ2101分離株均屬于B亞型aMPV。

SD2001、SD2002和HLJ2101分離株用●標(biāo)記；括號(hào)中顯示的是毒株的GenBank登錄號(hào)SD2001, SD2002 and HLJ2101 strains were marked with ●; The GenBank accession number of the strain is shown in parentheses圖3 SD2001、SD2002和HLJ2101分離株的G基因(A)和F基因(B)核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic analysis of G gene (A) and F gene (B) nucleotide sequences of SD2001, SD2002 and HLJ2101 strains

2.4 IFA鑒定

將SD2001、SD2002和HLJ2101分離株接種于6孔板中的Vero細(xì)胞，在37 ℃、5% CO溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，利用B亞型特異的陽(yáng)性血清進(jìn)行IFA檢測(cè)，倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，感染SD2001、SD2002和HLJ2101分離株的Vero細(xì)胞呈現(xiàn)特異性的綠色熒光信號(hào)，而陰性對(duì)照的Vero細(xì)胞沒(méi)有熒光信號(hào)(圖4)，進(jìn)一步表明SD2001、SD2002和HLJ2101分離株屬于B亞型的aMPV。

圖4 SD2001、SD2002和HLJ2101分離株感染Vero細(xì)胞的間接免疫熒光檢測(cè)(標(biāo)尺=125 μm)Fig.4 Indirect immunofluorescence detection of Vero cells infected by SD2001、SD2002 and HLJ2101 strains (bar=125 μm)

2.5 致病性試驗(yàn)

和基因分析表明，3個(gè)分離株的同源性較高，所以選擇病毒毒價(jià)為10TCID·mL的SD2001分離株感染3周齡的SPF雞，感染組SPF雞在感染后第3～6天出現(xiàn)精神萎靡、流鼻涕、鼻痂和甩頭等癥狀(圖5)，第5天癥狀最明顯，該組的發(fā)病率為90%，空白組SPF雞未見(jiàn)明顯的癥狀。鼻裂拭子的排毒檢測(cè)結(jié)果顯示，攻毒后的2～6 d雞出現(xiàn)排毒，第4天的排毒率達(dá)到100%，且病毒的平均拷貝數(shù)達(dá)到峰值，為1 472 406拷貝·200 μL(圖6)。病理組織學(xué)結(jié)果顯示，感染病毒后9 d，雞的鼻甲骨黏膜固有層淋巴組織增生，個(gè)別黏液腺萎縮，腺上皮細(xì)胞變性，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7A)；氣管的黏膜上皮細(xì)胞少量變性(圖7B)；肺輕度淤血(圖7C)。空白對(duì)照組雞則沒(méi)有任何臨床癥狀和組織病理?yè)p傷。以上結(jié)果表明，SD2001分離株對(duì)SPF雞有明顯的致病性。

A.鼻痂; B.膿鼻涕A. Nasal scabs; B. Purulent snot圖5 SPF雞感染SD2001分離株后的臨床癥狀Fig.5 Clinical symptoms of SPF chickens infected with SD2001 strain

圖6 SPF雞感染SD2001分離株后排毒情況Fig.6 Viral shedding of SPF chickens infected with SD2001 strain

A. 雞的鼻甲骨出現(xiàn)腺體萎縮，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(標(biāo)尺=100 μm)；B. 雞的氣管出現(xiàn)黏膜上皮細(xì)胞少量變性(標(biāo)尺=50 μm)；C. 雞的肺出現(xiàn)輕度淤血(標(biāo)尺=100 μm)A. Gland atrophy and inflammatory cell infiltration appeared in the turbinate bone of chickens 9 days after infection (100 μm); B. A small amount of degeneration of mucosal epithelial cells appeared in the trachea of chickens 9 days after infection (50 μm)；C. Mild congestion appeared in the lungs of chickens 9 days after infection (100 μm)圖7 SPF雞感染SD2001毒株9 d的鼻甲骨、氣管和肺的HE染色Fig.7 HE staining of nasal turbinate, trachea and lung of SD2001 infected SPF chickens 9 days after infection

3 討 論

1999年，我國(guó)雞群首次檢測(cè)到aMPV，隨后國(guó)內(nèi)許多研究人員對(duì)aMPV的流行情況展開(kāi)了調(diào)查，血清學(xué)結(jié)果表明我國(guó)家禽養(yǎng)殖場(chǎng)普遍存在aMPV的感染，有些地區(qū)的雞群血清陽(yáng)性率高達(dá)100%。aMPV感染蛋雞導(dǎo)致產(chǎn)蛋率和孵化率下降，產(chǎn)軟殼蛋和薄殼蛋率增高；感染肉雞導(dǎo)致腫頭綜合征，同時(shí)也影響肉質(zhì)、增重比及飼料轉(zhuǎn)化率。若僅有aMPV感染時(shí)，雞的恢復(fù)速度很快，但繼發(fā)其他細(xì)菌或病毒時(shí)發(fā)病率高達(dá)100%，成年雞的死亡率為0.5%，幼齡雞的死亡率可高達(dá)80%。

近些年，在河北、山東、黑龍江、福建等地的蛋雞和肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)中常出現(xiàn)雞群精神沉郁、流淚、流鼻涕、眼瞼和頭部腫脹等癥狀，死淘率增加，產(chǎn)蛋率明顯下降，有的雞場(chǎng)下降達(dá)30%以上，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。本研究從這些雞群采集發(fā)病雞的喉拭子，鼻甲骨和肺組織等病料，進(jìn)行了病毒分離鑒定，從蛋雞中分離到2株B亞型aMPV(SD2001和SD2002)，從肉雞中分離到1株B亞型aMPV(HLJ2101)。盡管大量的研究數(shù)據(jù)表明，我國(guó)蛋雞存在aMPV的感染，但是由于病毒分離困難，一直沒(méi)有蛋雞源的分離株的報(bào)道，所以SD2001和SD2002的成功分離是我國(guó)內(nèi)首次從蛋雞上分離到B亞型的aMPV，這為蛋雞群開(kāi)展aMPV的流行病調(diào)查、遺傳演化分析和防控提供了參考。

G和F蛋白是aMPV的主要抗原結(jié)構(gòu)蛋白和保護(hù)性抗原，根據(jù)基因不同可將aMPV分為A、B、C和D 4個(gè)亞型。F蛋白決定aMPV的宿主范圍，介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜相互融合，是病毒感染最關(guān)鍵的一步。本研究分析了3個(gè)分離株與其他B亞型aMPV毒株的遺傳演化關(guān)系，和基因同源性分析結(jié)果顯示，3個(gè)分離株與其他國(guó)家的不同宿主(火雞和雞)來(lái)源的B亞型aMPV的基因的核苷酸相似性為93.4%～96.0%，基因的核苷酸相似性為95.6%～98.2%，相對(duì)保守，這與之前的報(bào)道相似；3個(gè)分離株的和基因與我國(guó)2016年遼寧某肉種雞場(chǎng)分離的B亞型aMPV(LN16株)的核苷酸的相似性更高，均在98.4%以上，高度保守，且遺傳演化樹(shù)顯示，我國(guó)毒株已經(jīng)形成獨(dú)立的分支，這證實(shí)我國(guó)流行的B亞型aMPV的主要保護(hù)性抗原非常保守，為aMPV疫苗的研制提供了理論依據(jù)。

SPF雞感染肉雞源的分離株和肉雞感染火雞源的分離株后主要出現(xiàn)精神沉郁、流鼻涕和咳嗽等癥狀和上呼吸道出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象。在本研究中，SPF雞感染蛋雞SD2001分離株后的臨床癥狀和病理?yè)p傷等指標(biāo)與感染肉雞源或火雞源的指標(biāo)無(wú)明顯的差異，這說(shuō)明宿主來(lái)源對(duì)B亞型aMPV的致病性影響不大。

4 結(jié) 論

本研究從疑似aMPV感染的雞群采集病料，首先利用aMPV特異性的RT-PCR方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行初步檢測(cè)，再將RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的樣品利用Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，然后通過(guò)CPE、IFA和基因序列測(cè)定分析等方法證實(shí)，本研究成功分離到3株B亞型aMPV(SD2001、SD2002和HLJ2101)。SD2001分離株感染SPF雞后導(dǎo)致90%的雞出現(xiàn)臨床癥狀，第4天排毒率達(dá)100%，引起鼻甲骨、氣管和肺等組織出現(xiàn)病理性損傷，對(duì)SPF雞有明顯的致病性。