現(xiàn)地應(yīng)用雞紅細胞保存方法的研究

李 鑫，方 超，李建華

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

在動物血清抗體監(jiān)測過程中，常進行血凝-血凝抑制試驗，如新城疫病毒抗體、禽流感病毒抗體、減蛋綜合征病毒抗體等，均需要新鮮的1%雞紅細胞作為材料輔助進行試驗。但新鮮雞紅細胞的制備需要特定環(huán)境（無病毒感染）下的SPF大公雞，且保存期較短，配制繁瑣，所以使用方便和穩(wěn)定的雞紅細胞保存方法是必然的需求。本研究通過借鑒相關(guān)研究制備了醛化雞紅細胞、凍干雞紅細胞，并與1%新鮮的雞紅細胞進行了對比試驗，以期為適用于現(xiàn)地實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

磷酸緩沖鹽溶液（PBS），購自Biosharp公司，按說明書添加雙蒸水，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4；2.5%戊二醛溶液（C5H8O2），購自中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司；血凝-血凝抑制用新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗體、血凝-血凝抑制用禽流感H9病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗體，均為哈藥集團生物疫苗有限公司制備。

2 方法

2.1 新鮮雞紅細胞的制備

參照楊志峰[1]制備雞紅細胞的方法，選擇12個月以上的SPF公雞，翅下靜脈無菌采集血液至抗凝管中，低速（3 000 r·min-1）離心5 min，去除上層液，留取下層雞紅細胞，用PBS液洗滌，再離心，去上清，重復(fù)2次。最后，采用PBS重懸雞紅細胞，配制成10%的雞紅細胞懸液，置于4℃冰箱中保存。

2.2 1%雞紅細胞的制備

取新鮮配制的10%雞紅細胞，1 500 r·min-1離心5 min，參考王宇波等[2]的方法，按血細胞比容用pH為7.2～7.4的PBS液重懸，得到1%雞紅細胞，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 醛化紅細胞的制備

根據(jù)萬勇虎等[3]、孫軍杰等[4]試驗結(jié)果，確定醛化紅細胞的制備方案。將雞紅細胞緩慢加入2.5%戊二醛溶液中，配制成1%紅細胞懸液，在4℃條件下醛化5 h，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 凍干紅細胞的制備

曾麗亞[5]在《診斷用凍干雞紅細胞的制備》研究中，制定了適合紅細胞凍干的條件：將醛化后紅細胞懸液置于液氮氣相中平衡30 min，凍干體系達到超冷狀態(tài)但未出現(xiàn)結(jié)冰，再置于冷凍干燥機中抽真空，凍干時間設(shè)置為20 h，凍干隔板溫度為-35℃，最后將西林瓶壓蓋、封裝。取凍型完整、顏色均勻和空隙致密的凍干紅細胞，放置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 微量血凝-血凝抑制試驗

設(shè)2個試驗組，分別為醛化紅細胞試驗組、凍干紅細胞試驗組，以及對照組（1%新鮮雞紅細胞），見表1。以上各組同時進行新城疫病毒和禽流感H9病毒的微量血凝-血凝抑制比較試驗，具體步驟參照康華玲等[6]、黃艷羚等[7]的試驗方法。

表1 試驗分組

2.6 現(xiàn)地臨床血清樣本檢測

隨機無菌采集取某雞場現(xiàn)地雞血10份，進行3 500 r·min-1離心5 min，分離血清，分別使用2.5%醛化紅細胞、2%凍干紅細胞、1%新鮮雞紅細胞進行新城疫病毒抗體和禽流感H9病毒抗體檢測，觀察各試驗組的差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 新城疫病毒血凝-血凝抑制試驗（NDV HAHI）

通過新城疫病毒血凝-血凝抑制試驗，重復(fù)3次同時比較試驗，取平均值（保留整數(shù)），可以看出：對照組與試驗組1和試驗組2存在明顯差異。在血凝試驗中，對照組較試驗組1和試驗組2的血凝價均高，且試驗組1比對照組低2個效價、試驗組2比對照組低3個效價，具體見表2；在血凝抑制試驗中，試驗組1比對照組的新城疫血凝抑制價

高1個效價，試驗組2比對照組的血凝抑制價高2個效價。通過重復(fù)試驗比較可知，試驗組1和試驗組2與對照組的血凝價-血凝抑制價差異穩(wěn)定，具體見表2、表3。

表2 新城疫病毒血凝試驗結(jié)果

表3 新城疫病毒血凝抑制試驗結(jié)果

3.2 禽流感H9病毒血凝-血凝抑制試驗（AIVH9 HA-HI）

通過禽流感H9病毒血凝-血凝抑制試驗，重復(fù)3次同時比較試驗，取平均值（保留整數(shù)），在血凝試驗中，對照組較試驗組1、試驗組2的血凝價均高，且試驗組1比對照組低1個效價、試驗組2比對照組低2個效價，具體見表4；在血凝抑制試驗中，試驗組1比對照組禽流感血凝抑制價高1個效價，試驗組2比對照組血凝抑制價高2個效價，具體見表5?？煽闯?，對照組與試驗組仍存在明顯差異。重復(fù)試驗可以看出，差異存在是穩(wěn)定的。

表4 禽流感H9病毒血凝試驗結(jié)果

表5 禽流感H9病毒血凝抑制試驗結(jié)果

3.3 現(xiàn)地臨床樣本檢測

在某雞場現(xiàn)地采集的血液，分離得到血清約0.75 mL·只-1，使用不同紅細胞懸液，各重復(fù)3次。新城疫、禽流感H9的血凝抑制試驗中，使用2.5%醛化紅細胞、2%凍干紅細胞的抗體效價結(jié)果均高于1%新鮮雞紅細胞（分別為8.2 lb、9.7 lb和7.4 lb；7.0 lb、8.0 lb和6.3 lb；），且符合試驗組中兩者之間的抗體差異規(guī)律。詳細結(jié)果見表6。

表6 現(xiàn)地臨床樣本血清檢測結(jié)果lb

4 分析與討論

禽類抗體監(jiān)測是養(yǎng)殖業(yè)的重點項目，從抗體檢測結(jié)果中可以得到禽類的免疫情況及有無潛在的疫病存在。禽類抗體檢測通常在實驗室采用瓊括試驗、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗、微量血凝抑制試驗等進行，但在現(xiàn)地抗體臨檢通常采用微量血凝-血凝抑制試驗，試驗中需要新鮮的雞紅細胞，但新鮮雞紅細胞制備需要離心機、SPF大公雞等條件，現(xiàn)場制備麻煩，因此這成為限制臨床檢測禽類血清樣本的因素[8]。通過醛化紅細胞和凍干紅細胞替代新鮮雞紅細胞進行檢測，可為現(xiàn)地臨床試驗提供便利。

通過2.5%醛化紅細胞（試驗組1）、2%凍干紅細胞（試驗組2）與1%新鮮雞紅細胞（對照組）比較試驗發(fā)現(xiàn)，在新城疫病毒血凝試驗中，試驗組1與對照組比低2個效價，試驗組2與對照組比低3個效價；而在禽流感-H9病毒血凝試驗中，試驗組1較對照組低1個效價，試驗組2較比照組低2個效價。在新城疫血凝抑制試驗中，試驗組1較對照組高1個效價，試驗組2較對照組高2個效價；在禽流感-H9病毒血凝抑制試驗中，試驗組1較對照組高1個效價，試驗組2較對照組高2個效價。3組之間的差異存在著一定的規(guī)律性[9]。

有報道表明，2.5%戊二醛可改變紅細胞表面受體結(jié)構(gòu)，從而使紅細胞的血凝活性發(fā)生改變[10]，所以醛化的雞紅細胞與新鮮的雞紅細胞的血凝價等存在一定差異。新鮮的雞紅細胞保存期短，僅能維持5 d左右，之后會發(fā)生紅細胞破裂，但由于戊二醛存在2個具有反應(yīng)活性的醛基，可與新鮮紅細胞上的自由氨基或者巰基結(jié)合，從而增加了紅細胞的機械強度，不容易發(fā)生破碎，延長了紅細胞的保存期[11]。

凍干紅細胞是通過醛化后的雞紅細胞冷凍真空干燥制備而成，凍干紅細胞加水復(fù)原后，細胞形態(tài)完整，仍可進行血凝-血凝抑制試驗，原則上血凝價與醛化后的雞紅細胞相同，但在凍干前分裝或操作不當(dāng)均會造成紅細胞的破壞，所以在血凝-血凝抑制試驗中，醛化的雞紅細胞與冷凍真空干燥的雞紅細胞存在1～2個效價差。醛化的雞紅細胞保存時間大概為3個月以上[12]，而凍干紅細胞在4℃條件下可維持半年以上[13]。

通過現(xiàn)地臨床檢測雞的新城疫病毒、禽流感H9病毒抗體情況，可以看出醛化紅細胞、凍干紅細胞與新鮮的雞紅細胞的抗體效價之間的差異是穩(wěn)定存在的，且醛化紅細胞與新鮮雞紅細胞及凍干紅細胞與新鮮紅細胞之間的差值也是相對穩(wěn)定的。所以，在現(xiàn)地進行血凝-血凝抑制試驗，可應(yīng)用醛化紅細胞或凍干紅細胞來代替1%新鮮雞紅細胞。

新鮮的雞紅細胞制備簡單，但在4℃條件下保存期僅為5 d左右，醛化的紅細胞保存期所有延長，但兩者在現(xiàn)地檢測中，存在運輸問題，若路途顛簸，可能造成紅細胞的二次破裂，影響試驗結(jié)果。而凍干雞紅細胞形態(tài)穩(wěn)定，不易再受外界影響破壞紅細胞，對結(jié)果影響較小。綜上所述，在現(xiàn)地進行血凝-血凝抑制試驗時可使用2%凍干雞紅細胞來代替1%新鮮雞紅細胞。