大蒜素抑制家兔離體小腸平滑肌收縮及機制的實驗研究

侯睿涵，任星宇，魏江洋，李汶辛，盧世蝶，唐瑞

（川北醫(yī)學院，四川 南充 637100）

0 引言

大蒜素（Allium sativum）是存在于大蒜、洋蔥等植物的鱗莖中的一種有機硫化合物?！侗静菥V目》中提示其有“搗汁飲, 治吐血心痛?！弊饔?，近年來研究認為具有抗炎、抗菌、降血糖、抗纖維化以及抗癌等廣泛作用[1-5]。大蒜素作為容易獲得的天然產(chǎn)物，作用范圍廣，不過要用于臨床仍然需要挖掘其價值，需要更深入的研究。有文獻報道[6,7]大蒜素可抑制小鼠小腸平滑肌的運動，并對血管平滑肌增殖有抑制作用，王雅立[8]采用大蒜素治療慢性結(jié)腸炎取得一定療效，但大蒜素對家兔小腸平滑肌自發(fā)性收縮研究報道較少，本文觀察大蒜素對家兔小腸平滑肌的影響并進一步探討機制與M受體、鈣離子以及與組胺受體的關系，對天然產(chǎn)物開發(fā)和利用提供基礎實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

大蒜素（索萊寶，批號：618T021），釕紅（上海源葉，批號：Y22011R127112），乙酰膽堿，組胺，肝素（索萊寶，批號：S9041081），氯化鈣。臺氏液配制參考川北醫(yī)學院主編的醫(yī)學機能實驗學[9]方法。

1.2 儀器

兔類手術(shù)器械一套、BL-420 F生物信號采集處理系統(tǒng)、張力換能器和 恒溫平滑肌系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 實驗動物

由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供 2～2.5kg的健康家兔 5只,雌雄不限，實驗動物許可證號：SYXK(渝)2017-0006。

1.4 標本制備

倒提家兔后肢，用小錘子猛擊家兔后枕部，確認家兔死亡后立即打開腹腔，取出十二指腸，洗凈后剪成1.5cm～2cm小段，平滑肌標本放入維持38℃溫度的臺氏液中保證標本興奮性。

1.5 實驗記錄

打開BL-420F生物機能實驗系統(tǒng),調(diào)節(jié)恒溫平滑肌槽面板溫度檔按鈕，調(diào)至38℃，在準備管和標本管分別加入18mL臺式液，其余部分加入蒸餾水。將1.5cm～2cm小段標本固定通氣鉤和張力換能器之間,旋轉(zhuǎn)恒溫平滑肌槽面板上通氣按鈕，氣泡頻率大概為每秒1～2個氣泡，BL-420系統(tǒng)打開小腸平滑肌實驗進行實驗。

1.6 大蒜素對家兔小腸平滑肌收縮的影響

分為四組：空白組、低濃度大蒜素組（1μmol/L）、中濃度大蒜素組（2μmol/L）、高濃度大蒜素組（10μmol/L）組，每次在小腸平滑肌收縮穩(wěn)定后加入不同濃度大蒜素，記錄收縮幅度和頻率。

1.7 大蒜素對Ach引起的小腸平滑肌收縮的影響

分為空白組、Ach膽堿組、Ach膽堿+高濃度大蒜素組，首先給予1μmol/L的Ach，記錄收縮幅度和頻率，15 min后繼續(xù)加入10μmol/L大蒜素溶液，記錄加入大蒜素后收縮活動的改變。

1.8 大蒜素對鈣離子作用

1.8.1 大蒜素對氯化鈣引起的小腸平滑肌的作用

分為空白組，氯化鈣組、氯化鈣+高濃度大蒜素組，先加入50 mg/L的 氯化鈣，記錄收縮幅度和頻率，作用15 min 后加入大蒜素溶液10μmol/L，記錄加入大蒜素后收縮活動的改變。

1.8.2 HP作用小腸平滑肌的影響

分為空白組、HP組、HP+高濃度大蒜素組，先加入50 mg/L的 HP，記錄收縮幅度和頻率，作用15min 后加入大蒜素溶液10μmol/L，記錄加入大蒜素后收縮活動的改變。

1.8.3 大蒜素對RR作用小腸平滑肌的影響

分為空白組、RR組、RR+高濃度大蒜組，先加入10μmol/L的RR，記錄收縮幅度和頻率，作用15 min 后加入大蒜素溶液10μmol/l，記錄加入大蒜素后收縮活動的改變。

1.9 大蒜素對組胺作用的影響

分為空白組、組胺組、組胺+高濃度大蒜素組，小腸收縮穩(wěn)定后給予1×104組胺0.5mL，孵育15min后加入大蒜素溶液10μmol/L，觀察大蒜素對組胺作用的影響，并與空白組比較。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對家兔離體小腸平滑肌收縮的影響

空 白 組 收 縮 幅 度 為(5.29±0.86)g，頻率 為(22.20±1.92)次/min，低、濃 度 可 以降 低 幅 度 至(3.40±0.25)g，降 低36%，頻 率至(17.00±1.10)次/min，降 低23%，中 濃 度 大蒜素組可以降至(1.49±0.26)g，降低72%，頻率為(12.2±0.83)次/min，降低45%，高濃度組能使收縮幅度降到(0.76±0.05)g，降低97%，收縮頻率 降 到(5.80±0.84)次/min，降 低74%(P＜0.05，P＜0.01)，見表1。

表1 不同濃度大蒜素對家兔離體小腸平滑肌收縮的影響(±s，n=5)

表1 不同濃度大蒜素對家兔離體小腸平滑肌收縮的影響(±s，n=5)

注：※與空白組相比：P＜0.01

Group 收縮幅度（g） 收縮頻率（次/min）空白組 5.29±0.86 22.20±1.92低濃度大蒜素 3.40±0.25※ 17.00±1.10※中濃度大蒜素 1.49±0.26※ 12.2±0.83※高濃度大蒜素 0.76±0.05※ 5.80±0.84※

圖1不同濃度大蒜素對小腸平滑肌的影響

2.2 大蒜素對Ach誘導小腸平滑肌收縮后的影響

加入Ach 1μmol/L可小腸平滑肌收縮幅度增加到（9.13±0.41），頻率增加到（28.40±1.67），差異具有顯著性(P＜0.01)。加入10μmol/L大蒜素溶液可降低Ach引起的小腸平滑肌運動收縮，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表 2。

表2 大蒜素對Ach誘導家兔小腸平滑肌收縮后的影響(±s，n=5)

表2 大蒜素對Ach誘導家兔小腸平滑肌收縮后的影響(±s，n=5)

注：※與空白組相比：P＜0.01，?與ACH組比較:P＜0.01

組別 收縮幅度（g） 收縮頻率（次/min）空白組 4.99±0.87 22.20±1.92 AcH 9.13±0.41 ※ 28.40±1.67※AcH+大蒜素 3.54±0.20? 14.00±1.00?

2.3 大蒜素對 CaCl2能促進兔離體小腸平滑肌收縮幅度和收縮頻率的影響

在CaCl2作用后加入大蒜素兔離體小腸平滑肌的收縮幅度和收縮頻率有明顯的下降，與Cacl2組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）見表3。

表3 大蒜素對氯化鈣作用兔離體平滑肌收縮的影響(±s，n=5)

表3 大蒜素對氯化鈣作用兔離體平滑肌收縮的影響(±s，n=5)

注：氯化鈣組與氯化鈣+大蒜素組組相比具有統(tǒng)計學意義：*P＜0.001

組別 收縮幅度（g） 收縮頻率（次/min）CaCl2 10.45±0.58 32.40±1.18 CaCl2+大蒜素 5.04±0.48* 19.40±1.67*

2.4 大蒜素對HP作用小腸平滑肌的影響

HP處理對大蒜素抑制小腸腸平滑肌的影響 與相同濃度的大蒜素組比較，HP(50 mg/L)抑制小腸運動，加入大蒜素10μmol/L 溶液，大蒜素抑制腸平滑肌的作用減弱，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而 RR(10 μmol/L) 作用后對大蒜素抑制小腸平滑肌運動(P＞0.05)，見表4。

2.5 大蒜素對RR作用小腸平滑肌的影響

與相同濃度的大蒜素組比較，RR(10 μmol/L)抑制小腸運動，加入大蒜素10μmol/L溶液對大蒜素抑制小腸平滑肌無明顯影響(P＞0.05)，見表4。

表4 HP、RR 預處理對大蒜素抑制家兔小腸平滑肌的影響(±s，n=5)

表4 HP、RR 預處理對大蒜素抑制家兔小腸平滑肌的影響(±s，n=5)

注：※與空白組相比：P＜0.01，?與高濃度大蒜素組比較:P＜0.01，◇與高濃度大蒜素組比較：P＞0.05

組別 收縮幅度（g） 收縮頻（次/min）空白組 4.99±0.87 22.20±1.92高濃度大蒜素組 0.76±0.05※ 5.80±0.84※HP組 2.15±0.26 ※ 12.20±0.95※RR組 3.26±0.15※ 15.08±1.02※HP+大蒜素 1.53±0.41? 12.40±1.67?RR+大蒜素 0.64±0.20◇ 5.20±0.92◇

2.6 大蒜素對組胺作用的影響

見表5。結(jié)果顯示組胺增加小腸平滑肌的收縮，從空白組（4.99±0.87）增加至（6.28±0.35），收縮頻率（22.20±1.92）增加至（26.40±1.14），但加入大蒜素后收縮幅度和收縮頻率與高濃度大蒜素相比無差異。

表5 組胺和大蒜素對家兔小腸離體平滑肌收縮的影響(±s，n=5)

表5 組胺和大蒜素對家兔小腸離體平滑肌收縮的影響(±s，n=5)

注：＃與空白組相比：P＜0.05，與高濃度大蒜素，※P＞0.05

組別 收縮幅度（g） 收縮頻率（次/min）空白組 4.99±0.87 22.20±1.92組胺 6.28±0.35＃ 26.40±1.14＃高濃度大蒜素組 0.76±0.05 ＃ 5.80±0.84＃大蒜素+組胺 0.68±0.27※ 5.62±0.24※

3 討論

實驗結(jié)果顯示，大蒜素抑制家兔小腸腸平滑肌收縮，顯著降低收縮幅度和頻率，有統(tǒng)計學意義，低濃度降低幅度為12%，高濃度可以達到50%。本實驗進一步觀察大蒜素作用機制，發(fā)現(xiàn)在加入10μmol/L大蒜素后，Ach 對小腸平滑肌的興奮作用明顯減弱，說明大蒜素對小腸平滑肌作用與阻斷M受體有關，報道認為Ach 引起的胃腸平滑肌收縮與細胞內(nèi)鈣離子濃度上升有關。

鈣離子是肌肉收縮關鍵離子，鈣離子濃度升高，肌肉收縮加強，目前研究認為內(nèi)鈣增加與IP3R和RyR途徑有關，當IP3增加，與受體結(jié)合，促使鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放引起鈣離子增加；RyR是存在于肌質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞內(nèi)鈣釋放通道之一，當與RyR結(jié)合，同樣可促進細胞內(nèi)鈣離子濃度升高[10]。因此本實驗觀察氯化鈣作用與平滑肌運動增加，加入大蒜素抑制氯化鈣增加平滑肌收縮作用，說明大蒜素收縮與鈣離子降低確實有關系，實驗進一步顯示，HP作用后大蒜素對家兔離體小腸平滑肌的抑制作用減弱 (P＜0.05)，而RR 對大蒜素抑制家兔平滑肌收縮的作用無影響(P＞0.05)。由此證實大蒜素通過IP3R 介導的內(nèi)鈣釋放減少來抑制平滑肌收縮，而不是通過但RyR 途徑產(chǎn)生作用。

目前研究認為消化道平滑肌收縮與ACh、組胺、5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)對胃腸道平滑肌相應受體的影響有關。王慧等報道，組胺通過作用H1受體，導致細胞膜去極化，促進細胞內(nèi)游離鈣離子的濃度，從而引起胃腸道平滑肌收縮[11]，實驗結(jié)果顯示，大蒜素不能抑制組胺對小腸平滑肌的興奮作用(P＞0.05)，說明大蒜素對小腸平滑肌的抑制作用與H1受體無關。